CN108398407A

CN108398407A - 一种人类精子活率及其dna损伤双参数检测及分析的试剂盒

Info

Publication number: CN108398407A
Application number: CN201810071175.XA
Authority: CN
Inventors: 高雅晶; 樊晓翔; 叶颖
Original assignee: Mai Kebo (tianjin) Biotechnology Co Ltd
Current assignee: Mai Kebo (tianjin) Biotechnology Co Ltd
Priority date: 2018-01-25
Filing date: 2018-01-25
Publication date: 2018-08-14
Anticipated expiration: 2038-01-25
Also published as: CN108398407B

Abstract

本发明属于生殖医学及生物检测技术领域，尤其是一种人类精子活率及其DNA损伤双参数检测及分析的试剂盒，解决了现有技术中存在的生物学意义不足、检测时效性差以及检测成本高的问题，所述人类精子活率及其DNA损伤双参数分析的试剂盒，包括缓冲液、Live‑or‑Dye CF^TM640R荧光染料、酸化液和AO染色液；所述人类精子活率及其DNA损伤双参数检测包括以下步骤：准备精液待测样品，校准和调节流式细胞仪，检测精液待测样品，利用软件分析和判断，完成检测。本发明提出的精子双参数检测及分析的试剂盒，操作简单，人为误差小，准确度高，对精子质量的判断准确，检测的时效性好，检测成本低。

Description

一种人类精子活率及其DNA损伤双参数检测及分析的试剂盒

技术领域

本发明涉及生殖医学及生物检测技术领域，尤其涉及一种人类精子活率及其DNA损伤双参数检测及分析的试剂盒。

背景技术

李升福在《精液质量影响不孕因素的调查与研究》一文中指出我国不孕不育症的发病率在10％以上，其中，男性因素和女性因素各占30％，双方共同因素占40％。精子质量是影响不孕不育症的直接因素。2016年，胡军杰在《精液常规检验在男性不育诊疗中的应用研究》一文中指出，精子质量可通过常规精液分析来完成，主要包括精液量、精子密度及其精液中精子的总数量、精子凝集、精子活力与活率、精子形态、精液液化等方面的信息。

根据《WHO(人类)精液实验室检测指南，第五版》中的定义，精子活率是指存活精子占总精子数的百分比，属于精子质量标准的必检指标之一，间接反应精子细胞膜的通透性；其推荐经典检测方法包括“伊红-苯胺黑拒染法”、“低渗膨胀法”。两种方法都是通过在显微镜下对“染色特征或是形态学差异性”细胞进行绝对计数实现，其检测的敏感下限为58％。正常男性精子存活率＞85％～90％；精子存活率低于58％严重影响生育能力。但此类检测方法高度依赖人为操作，结果判定主观性强，操作过程繁琐，检测不稳定，重复性差，是临床检验的报告瓶颈之一。

2012年，龚道元在《男性不育症患者精子DNA完整性与精液分析参数相关性研究》中指出精子DNA完整性是父系遗传信息传递给子代的前提，精子DNA完整性异常会直接影响精子活力、精卵结合障碍，胚胎染色体遗传，胚胎发育遗传及流产。在《WHO(人类)精液实验室检测指南，第五版》中，精子DNA完整性同样是评价精子质量首要指标之一。2012年，龚道元在《男性不育症患者精子DNA完整性与精液分析参数相关性研究》一文中指出，临床上用精子DNA碎片指数(DFI)来评价精子DNA的完整性，正常男性精子DFI＜15％，而DFI大于30％则说明精子DNA完整性异常。DFI可通过彗星分析完成，细胞碎片化的DNA可在单细胞凝胶电泳之中定向泳动而呈现彗星状图案，未受损DNA则由于核蛋白的保护而无法泳动。但彗星分析耗时，费力，技术要求高，已逐渐被基于吖啶橙荧光染色原理的精子染色质结构检测(SCSA)所取代。SCSA技术依赖流式细胞检测完成，染色质异常的精子易受酸变性成单链DNA与染料吖啶橙(AO)结合发红色荧光，而正常染色质的精子能保持完整的DNA双链结构，与吖啶橙结合发绿色荧光这一特性，通过流式细胞仪检测红、绿细胞丰度变化，计算出精子DFI的程度。最近几年，利用流式细胞(FCS)作为精子DFI质量评估分析系统已逐步成熟。FCS的一个重要特征是能高通量地快速分析细胞状态，可同时对每个细胞进行多荧光参数检测。

细胞死亡是细胞失去其生物学功能后的死亡性生物事件，包括：细胞坏死和细胞凋亡两种方式；其关键区别在于细胞膜完整性保持。细胞坏死的特征表现是细胞膜完整性直接破坏，导致细胞内物质释放；而凋亡细胞膜完整性保持不变，随着发生信号通路改变、染色体DNA逐步降解、内容物逐步降解，细胞逐步萎缩、直至整体崩解。虽然凋亡与坏死最终都导致细胞死亡，但是其生物学意义明显不同。这一点在精子质量分析中尤为重要。精子凋亡与坏死都是正常的生物学现象，过度的凋亡与坏死都可导致男性不育率的提升。在精子质量分析中，经典台盼蓝、伊红美蓝染色，都只能测定死亡细胞，而无法鉴别早、中期的凋亡细胞，同样也无法测定那些由于内源性DNA损伤而暂时不影响细胞结构的精子亚群。因此，基于活率染色的精子质量分析存在一定的局限性；类似的基于AO染色的DFI检测，也无法检出那些处在坏死/死亡早期阶段的精子细胞。而这些早期与中期的细胞，在单一流式检测中，往往处于流式染色的灰色区域之中，造成设门困难，无法进行精确的判断。

在人类受精的过程中，人类精子在输卵管里的存活时间为0～8天，这一时间跨度与人类细胞的凋亡时间跨度一致。因此，传统方法使用精子活率或是DFI来单一标示精子质量，都无法精确预测受孕期间的精子真实质量。只有在单个精子细胞中，整合膜通透性与精子DFI的双重信息，才可能保证对精子成活率的精确判定。现阶段，流式细胞是进行多参数分析的重要方法，得益于其固有的大样本分析特点，使得在精子质量的多参数同步分析上有着巨大的优势。主流的精子自动分析仪可在20min内完成精子活力、密度、活率、运动轨迹、运动分布图、总数等30项以上功能性分析。因此，传统的依靠人工镜检方法学如：活率检测(台盼蓝、伊红法)，DFI(彗星分析)已成为高通量、自动化检测的瓶颈。而流式的快速高通量分析，可实现与现有系统无缝数据整合。基于上述陈述，本发明提出了一种人类精子活率及其DNA损伤双参数检测及分析的试剂盒。

发明内容

本发明的目的是为了解决现有技术中存在的生物学意义不足、检测时效性差以及检测成本高的缺点，而提出的一种人类精子活率及其DNA损伤双参数检测及分析的试剂盒。

一种人类精子活率及其DNA损伤双参数分析的试剂盒，包括缓冲液、Live-or-DyeCF^TM640R荧光染料、酸化液和AO染色液。

优选的，所述缓冲液由三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、氯化钠和乙二胺四乙酸组成的混合物，缓冲液的pH值为7.4，且三羟甲基氨基甲烷盐酸盐的浓度为0.01mol/L，氯化钠的浓度为0.15mol/L，乙二胺四乙酸的浓度为1mmol/L。

优选的，所述酸化液由盐酸、氯化钠和曲拉通X-100组成的混合物，酸化液的pH值为1.2,，且酸化液中盐酸的浓度为0.08mol/L、氯化钠的浓度为0.15mol/L、曲拉通X-100的质量分数为0.1％。

优选的，所述AO染色液由浓度为1mg/mL的AO配制而成的终浓度为8.5μg/mL的染色液。

本发明还提出了一种人类精子活率及其DNA损伤双参数检测，包括以下步骤：

S1、取精子标本，加入2ml缓冲液，涡旋混匀，350g离心5min，弃去上清液，得精液原液，将精液原液在显微镜下观察，并计算精子浓度，根据计算的精子浓度，向精液原液中加入缓冲液A，调整至精子浓度为1～2×10⁶个/ml，得到精液稀释液；

S2、流式细胞管中加入Live-or-Dye CF^TM640R荧光染料，再加入步骤S1得到的精液稀释液，孵育15～30min，再加入2ml缓冲液A，涡旋混匀，离心，弃去上清液，加入酸化液酸化处理30s，再加入AO染色液，得精液待测样品；

S3、取与步骤S2相同量的酸化液和AO染色液混合作为平衡缓冲液，将平衡缓冲液加入到对照流式细胞管内，然后设定流式细胞仪的校准，将对照样品瓶放置在流式细胞仪上，调节流式细胞仪的电压和补偿，调节细胞的流速为200～300个/s，并运行15min；

S4、取步骤S2制备的精液待测样品置于样品室内，样品进入样品室后立即启动样品流，检测精液待测样品，收集精液待测样品中精子的FITC/PerCP/APC通道的荧光信号；

S5、重复步骤S4，重复检测样品，每个样品至少连续检测两次，每次至少分析5000个细胞，每个样品最后一次检测后使用步骤S3的对照样品瓶内的平衡缓冲液重新平衡1min，再用10％的漂白剂清洗5min，再用除菌水清洗10min，然后利用软件分析精子的红(PerCP通道)绿(FITC通道)荧光信号，通过收集到红色荧光精子占所收集精子的比例，判定样本的DNA碎片指数，分析精子红色(APC通道)荧光，通过收集红色荧光精子的比例，判定样本中精子的活率，完成人类精子活率及其DNA倍体损伤的检测。

优选的，所述精子标本为新鲜精子或冻存精子中的任意一种，所述冻存精子在使用前需要进行解冻。

优选的，所述Live-or-Dye CF^TM640R荧光染料和精液稀释液的体积比为1：100。

优选的，所述离心的离心力为350g，离心时间为5min。

优选的，所述流式细胞仪的校准采用校准微球实现，所述调节流式细胞仪的电压和补偿采用样品管的方式。

优选的，所述软件为BD Callibur分析软件。

相比于现有技术，本发明的有益效果为：

1、传统的精子活率检测与DFI检测分别在显微镜平台与流式平台上开展，需要2份样本，2种不同的处理方法，结果分析高度依赖人员手工操作，本发明将这两个指标归集于一个流式检测平台中，不仅有助于减少样本需求量、简化样本处理流程，更重要的是流式分析是典型的仪器分析，其样本处理、数据采集与分析皆可以标准化、形式固化，最大限度的减低人员操作误差，实现多个实验室之间的结果互认，且针对同一精子的两个质量参数同时检测，对精子质量的的判断更为精准；

2、样本操作简单，从拿到精子样本到出结果可在30min中内操作完成，比传统方法用时缩短很多，而且试剂价格低廉，进而降低检测成本；

3、在活率分析中，染色结果不但与染料质量、程序、时间有关，更与精子状态相关，临床上容易出现处于坏死/死亡的早期阶段的精子细胞，造成不同检测人员判定结果差异，因此依赖人工判断是其难以形成标准的瓶颈之一，即便引入计算机辅助的图像识别技术，也无法解决灰区细胞染色结果判定，而本发明中通过流式的无差别设门步骤，可最大限度降低人员的主观性误差；

4、FCS是典型的仪器分析，在样本处理、检测时间上，与广泛使用的精子分析仪相比都有着高度的类似，用于精子分析仪的样本可直接用于流式检测，二者的检测结果生物学意义互补性良好，且通过FCS的高通量分析技术，使得精子的分析数量级别达到10⁵，相比于镜检的10²～10³更具统计学意义，检测结果的可信度更高；

5、AO染色液的激发光谱从400～560nm，最大激发波长约为500nm，发射光谱为500～650nm之间，而Live-or-Dye CF^TM640R染料的最大激发波长约为640nm，在662±20nm之间为最大发射波长，因此，两种荧光素的激发区不存在相互干扰，发射光谱检测区域基本不存在重叠，使得后期的信号捕捉更加容易，基本不用考虑荧光素信号补偿，大大简化了操作处理流程，降低了使用成本，而且Live-or-Dye CF^TM640R染料属于细胞透性氨基结合染料，可以透过死细胞的细胞膜与胞内蛋白游离的氨基共价稳定结合，形成稳定标记，细胞可以被固定和透化而不会有荧光丢失或者出现细胞之间的串染，更为重要的是Live-or-DyeCF^TM640R染料在pH值为1～11范围内是化学稳定的，因此其荧光染色不会因为酸化染色而淬灭，使得活率和DFI的检测同时进行。

附图说明

图1为商品化试剂盒检测精子染色质完整性结果输出流程图；

图2为使用本发明提出的试剂盒检测精子染色质完整性检测流程图；

图3为使用Countstar检测精子细胞活率的结果图。

图中，FL1为染料与双链DNA结合后的荧光信号，FL3为染料与单链DNA结合后的荧光信号，FL4为CF640染料的结合信号，P1为所有有核细胞，P2为形态学正常的精子，P3为DNA染色正常精子，P4为中度DNA碎片化精子，P5为重度DNA碎片化精子，P6为高染区，P7为染色体结构完整膜通透性改变，P8为细胞碎片，P9为膜通透性完整、染色体结构异常，Q2+Q3为精子细胞膜通透性改变，P3+P4为DFI细胞。

具体实施方式

参照图1-3，下面结合具体实施例对本发明作进一步解说。

实施例，本发明提出的一种人类精子活率及其DNA损伤双参数分析的试剂盒，包括缓冲液、Live-or-Dye CF^TM640R荧光染料、酸化液和AO染色液，所述缓冲液由三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、氯化钠和乙二胺四乙酸组成的混合物，缓冲液的pH值为7.4，且三羟甲基氨基甲烷盐酸盐的浓度为0.01mol/L，氯化钠的浓度为0.15mol/L，乙二胺四乙酸的浓度为1mmol/L；所述酸化液由盐酸、氯化钠和曲拉通X-100组成的混合物，酸化液的pH值为1.2,，且酸化液中盐酸的浓度为0.08mol/L、氯化钠的浓度为0.15mol/L、曲拉通X-100的质量分数为0.1％；所述AO染色液由浓度为1mg/mL的AO配制而成的终浓度为8.5μg/mL的染色液。

其检测方法包括以下步骤：

S1、取冻存精子标本，立即置于37℃水浴解冻，冰块刚融化就要立即取出，加入2ml缓冲液，涡旋混匀，350g离心5min，弃去上清液，得精液原液，将精液原液在显微镜下观察，并计算精子浓度，根据计算的精子浓度，向精液原液中加入缓冲液A，调整至精子浓度为1～2×10⁶个/ml，得到精液稀释液；

S2、流式细胞管中加入2μl Live-or-Dye CF^TM640R荧光染料，再加入200μl步骤S1得到的精液稀释液，孵育15min，再加入2ml缓冲液A，涡旋混匀，350g离心5min，弃去上清液，加入400μl酸化液酸化处理30s，再加入1.2mlAO染色液，得精液待测样品；

S3、取400μl酸化液和1.2mlAO染色液混合作为平衡缓冲液，将平衡缓冲液加入到对照流式细胞管内，然后采用校准微球对流式细胞仪进行校准，将对照样品瓶放置在流式细胞仪上，采用样品管的方式调节流式细胞仪的电压和补偿，调节细胞的流速为200～300个/s，并运行15min；

S4、取步骤S2制备的精液待测样品置于样品室内，样品进入样品室后立即启动样品流，检测精液待测样品，收集精液待测样品中精子的FITC/PerCP/APC通道的荧光信号，使用488nm激发光激发，分别得到每个细胞的FS lin/SSC log/FL1 Lin/FL3 Lin的数值，使用633nm激发光激发得到FL4的数值；

S5、重复步骤S4，重复检测样品，每个样品至少连续检测两次，每次至少分析5000个细胞，每个样品最后一次检测后使用步骤S3的对照样品瓶内的平衡缓冲液重新平衡1min，再用10％的漂白剂清洗5min，再用除菌水清洗10min，然后利用BD Callibur分析软件分析精子的红绿荧光信号，通过收集到红色荧光精子占所收集精子的比例，判定样本的DNA碎片指数，分析精子红色荧光，通过收集红色荧光精子的比例，判定样本中精子的活率，完成人类精子活率及其DNA倍体损伤的检测。

对比例

采用与实施例相同的检测方法，但不同的是仅使用AO染液进行染色。

实验部分：

(1)分别对市售试剂盒(AO染色)、实施例(CF640R+AO复合染色)以及对比例(AO染色)的DFI与HDS的测定结果差异进行统计，结果如表1。

表1：不同测量方式的DFI与HDS的测定结果差异统计

试剂来源	DFI％	HDS％
			市售试剂盒(AO染色)	12.3	4.22
对比例(AO染色)	13.5	3.92
			实施例(CF640R+AO复合染色)	13.5	3.92

表1中，DFI的计算通过以下公式取得：DFI＝red荧光强度/(red+green)荧光强度；HDS的统计结果根据流式分析软件分析计算得出。

(2)分别利用实施例和Countstar细胞分析仪对细胞活率测定结果的差异性统计，结果见表2，

表2：两种测量方式的活率结果测定差异

试剂来源	存活率％	CF640R+AOGreen
			实施例(CF640R+AO)	51.5^*	27.8^**
Countstar细胞平台	73.8

表2中，Countstar细胞平台是利用标准的光学测定方式测定细胞活率，检测的总细胞浓度为2.53×10⁶个/ml，活细胞浓度为1.87×10⁶个/ml，平均直径为6.89μm，平均圆度为0.96，结团率为0.2％；“*”为dsDNA阳性与CF640阴性的细胞群体，应对于细胞染色体结构与细胞结构都完整的“活”细胞；“**”为染色灰色区域的细胞。

结论：

1)双参数流式分析可以区分出多种染色差异性精子细胞群：

a)CF^- and DNA^Green＝膜通透性完整+DNA结构完整；

b)CF640^- and DNA^Red＝膜通透性完整+DNA结构改变；

c)CF640⁺ and DNA^Green＝膜通透性改变+DNA结构完整；

d)CF640⁺ and DNA^Red＝膜通透性改变+DNA结构改变。

2)只有DNA结构与膜通透性这两个参数都正常的精子，即染色模式CF^-/DNA^Green才能称之为“正常精子”，而膜结构与DNA结构任意一个参数改变，都预示着精子生物学功能受损。

3)在单参数流式分析中，只能单独判定CF640^+/-或DNA^Green/Red的细胞群体，在荧光信号的正负阈值间存在染色灰区；染色灰区直接影响统计设门，并最终影响检测结果。

4)由于生物学事件的发生序贯性，DNA结构损伤与细胞膜通透性的发生可能存在一定的时间差，单参数分析无法区分处于两个生物学事件之间的精子细胞群；a、b、c、d四种染色差异性群体显示出这两个生物学事件的序贯发生，使得精子染色形态亚型的精确圈门成为可能，更为准确得检测精子存活率及DNA损伤情况，提升检测的生物学意义。

表2中，双参数流式分析显示“CF^- and DNA^Green”细胞占总群体为51.5％，被视为染色体与细胞膜结构都完好的活性细胞；这一结果与Countstar显示的73.8％有一定的差距，造成这一差距的原因可能是分化未成熟的HDS细胞(3.92％)、初期机械损伤细胞“CF⁺ andDNA^Green””(24.6％)的共同计入，分化未成熟的细胞是典型的染色灰区细胞。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种人类精子活率及其DNA损伤双参数分析的试剂盒，其特征在于，包括缓冲液、Live-or-Dye CF^TM640R荧光染料、酸化液和AO染色液。

2.根据权利要求1所述的一种人类精子活率及其DNA损伤双参数分析的试剂盒，其特征在于，所述缓冲液由三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、氯化钠和乙二胺四乙酸组成的混合物，缓冲液的pH值为7.4，且三羟甲基氨基甲烷盐酸盐的浓度为0.01mol/L，氯化钠的浓度为0.15mol/L，乙二胺四乙酸的浓度为1mmol/L。

3.根据权利要求1所述的一种人类精子活率及其DNA损伤双参数分析的试剂盒，其特征在于，所述酸化液由盐酸、氯化钠和曲拉通X-100组成的混合物，酸化液的pH值为1.2,，且酸化液中盐酸的浓度为0.08mol/L、氯化钠的浓度为0.15mol/L、曲拉通X-100的质量分数为0.1％。

4.根据权利要求1所述的一种人类精子活率及其DNA损伤双参数分析的试剂盒，其特征在于，所述AO染色液由浓度为1mg/mL的AO配制而成的终浓度为8.5μg/mL的染色液。

5.一种人类精子活率及其DNA损伤双参数检测，其特征在于，包括以下步骤：

S5、重复步骤S4，重复检测样品，每个样品至少连续检测两次，每次至少分析5000个细胞，每个样品最后一次检测后使用步骤S3的对照样品瓶内的平衡缓冲液重新平衡1min，再用10％的漂白剂清洗5min，再用除菌水清洗10min，然后利用软件分析精子的红(PercCP通道)绿(FITC通道)荧光信号，通过收集到红色荧光精子占所收集精子的比例，判定样本的DNA碎片指数，分析精子红色荧光(APC通道)，通过收集红色荧光精子的比例，判定样本中精子的活率，完成人类精子活率及其DNA倍体损伤的检测。

6.根据权利要求5所述的一种人类精子活率及其DNA损伤双参数检测，其特征在于，所述精子标本为新鲜精子或冻存精子中的任意一种，所述冻存精子在使用前需要进行解冻。

7.根据权利要求5所述的一种人类精子活率及其DNA损伤双参数检测，其特征在于，所述Live-or-Dye CF^TM640R荧光染料和精液稀释液的体积比为1：100。

8.根据权利要求5所述的一种人类精子活率及其DNA损伤双参数检测，其特征在于，所述离心的离心力为350g，离心时间为5min。

9.根据权利要求5所述的一种人类精子活率及其DNA损伤双参数检测，其特征在于，所述流式细胞仪的校准采用校准微球实现，所述调节流式细胞仪的电压和补偿采用样品管的方式。

10.根据权利要求5所述的一种人类精子活率及其DNA损伤双参数检测，其特征在于，所述软件为BD Callibur分析软件。