CN114295595A - 活动精子dna碎片检测试剂盒及检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种活动精子DNA碎片检测试剂盒及检测方法，该试剂盒包括：Pi检测试剂，其为荧光物质与银的络合物，当Pi存在时，Pi取代络合物中的银，使得被猝灭的荧光物质恢复荧光；酸化液，其包括盐酸、氯化钠和曲拉通X‑100；缓冲液，其包括氯化钠、乙二胺四乙酸、三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐和柠檬酸；以及AO染色液。本发明通过因与银形成络合物而应该猝灭的碳量子点作为Pi检测试剂，当存在Pi时，其恢复绿色荧光，从而能够特异性识别活动的精子；基于流式细胞仪，再配合基于吖啶橙染料的精子染色质结构检测方法，能够实现精子活率、活动精子的DNA碎片率的检测，能更直接反应精子的质量，提供更具参考价值的评价指标。
Description
技术领域
本发明涉及领域，特别涉及一种活动精子DNA碎片检测试剂盒及检测方法。
背景技术
今年来，不孕不育的发病率呈现逐年升高的趋势，而男性精子质量又是不孕不育的重要原因之一。其中，精子活率、精子DNA碎片率被广泛作为精子质量评价的指标。DNA完整性检测通常采用基于吖啶橙荧光染色原理的精子染色质结构检测(SCSA)法，其原理为：正常染色质的精子保持完整的DNA双链结构，双链DNA与吖啶橙结合会发出绿色荧光；异常染色质的精子易受算变性成单链DNA，单链DNA与吖啶橙结合会发出红色荧光，从而通过流式细胞仪采集红色和绿色荧光即可计算出DNA碎片率。例如专利CN109115735B公开的精子染色质结构检测试剂盒及其应用。
基于吖啶橙染料的精子染色质结构检测方法(SCSA)检测的是所有精子细胞：包括活动的精子、不活动的精子和死精子的DNA碎片情况，而真正更具有参考意义的应当是活动的精子的DNA碎片率，其更能直接反应精子的质量。精子的活动与精子尾部有关，精子运动靠着精子尾部鞭毛摆动产生动力。目前认为精子运动是按照滑动模式进行的。基于现有的理论，运动的精子尾部会发生ATP降解成为ADP和pi(磷酸)的情况，所以通过检测ADP和/或pi的含量，可以对运动的精子进行识别。专利CN111307694A公开了一种活动精子DNA碎片流式细胞术检测方法，其原理为：活动的精子产生的pi与钼酸铵反应产生磷钼杂多酸，其与罗丹明6G络合形成缔合物，使罗丹明6G的荧光大大下降，从而通过罗丹明6G的荧光强度的降低来识别活动的精子。但其存在如下缺陷：1、钼酸铵有毒，具刺激性，会限制其使用，且容易对操作人员的健康造成损害；2、反应体系中加入的试剂存在磷酸氢根离子，而精子细胞内还具有活性氧，磷酸氢根离子容易转化为磷酸根离子，有可能对其检测结果造成影响。
所以，现在有必要提供一种更可靠的方案。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于针对上述现有技术中的不足，提供一种活动精子DNA碎片检测试剂盒及检测方法。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种活动精子DNA碎片检测试剂盒，包括：
Pi检测试剂，其为荧光物质与银的络合物，当Pi存在时，Pi取代络合物中的银，使得被猝灭的荧光物质恢复荧光；
酸化液，其包括盐酸、氯化钠和曲拉通X-100；
缓冲液，其包括氯化钠、乙二胺四乙酸、三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐和柠檬酸；
以及AO染色液。
优选的是，所述酸化液包括：0.05-0.2mol/L的盐酸、0.1-0.5mol/L的氯化钠和质量分数0.02-0.2％的曲拉通X-100。
优选的是，所述缓冲液包括：0.1-0.5mol/L的氯化钠、0.2-2mmol/L的乙二胺四乙酸、0.005-0.03mol/L三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐、0.05-0.2mol/L的磷酸氢二钠、0.05-0.2mol/L柠檬酸。
优选的是，所述荧光物质为碳量子点，其通过以下方法制备得到：
1)将番茄红素、二硫苏糖醇溶于乙醇和水的混合溶液中，再加入乙二胺，搅拌；
2)将步骤1)得到的溶液转移到反应釜中，加热反应；
3)反应结束后，将产物过滤，滤液干燥得到粗产品；
4)将粗产品溶于超纯水中，离心，将离心液透析，收集透析袋内溶液，冷冻干燥，即得所述碳量子点。
优选的是，所述碳量子点通过以下方法制备得到：
1)将番茄红素、二硫苏糖醇溶于乙醇和水的混合溶液中，超声搅拌至澄清，再加入乙二胺，搅拌1-3分钟；
2)将步骤1)得到的溶液转移到聚四氟乙烯为内衬的反应釜中，在烘箱中加热至130℃-160℃下持续反应4-12小时；
3)反应结束后，待产物冷却至室温，再用滤膜过滤产物，将滤液冷冻干燥得到粗产品；
4)将粗产品溶于超纯水中，离心，取滤液用截断分子量为800-1500Da的透析袋透析8-16小时，收集透析袋内溶液，冷冻干燥，即得所述碳量子点。
优选的是，所述Pi检测试剂的制备方法为：将碳量子点溶于去离子水中，搅拌溶解，然后再加入足量的银离子，混合得到Pi检测试剂，避光保存。
优选的是，所述Pi检测试剂的制备方法为：将碳量子点溶于去离子水中，搅拌溶解，配置成10μg/mL的碳量子点溶液，然后再加入足量的硝酸银，混合得到Pi检测试剂，避光保存。
本发明还提供一种活动精子DNA碎片检测方法，其使用如上所述的试剂盒进行活动精子DNA碎片的检测，该方法包括以下步骤：
S1、用缓冲液将精子样品稀释，得到精子稀释液；
S2、向精子稀释液中酸化液，处理15-120s；
S3、向步骤S2得到的产物中加入缓冲液，然后加入Pi检测试剂，漩涡混匀，反应5-60min；
S4、向步骤S3得到的产物中加入AO染色液，混匀；
S5、将步骤S4得到的产物上流式细胞仪检测，收集精子的蓝色、绿色和红色荧光；
结合三种荧光检测结果进行分析：先通过蓝色荧光检测出活动的精子，然后根据绿色荧光和红色荧光分析得到活动的精子中的DNA碎片率。
优选的是，该方法包括以下步骤：
S1、用缓冲液将精子样品稀释至1-5×106个/mL，得到精子稀释液；
S2、取500μL精子稀释液，向其中加入350μL酸化液，处理30s；
S3、向步骤S2得到的产物中加入8μL缓冲液，混匀，然后加入40μL的Pi检测试剂，漩涡混匀，反应15min；
S4、向步骤S3得到的产物中加入10μL AO染色液，混匀，孵育2min；
S5、将步骤S4得到的产物上流式细胞仪检测，收集精子的蓝色、绿色和红色荧光；
结合三种荧光检测结果进行分析：先通过蓝色荧光检测出活动的精子，然后根据绿色荧光和红色荧光分析得到活动的精子中的DNA碎片率。
优选的是，其中，在Pi存在的条件下，Pi检测试剂可在波长为200-400nm的激发光的激发下产生绿色荧光。
本发明的有益效果是：
本发明通过因与银形成络合物而应该猝灭的碳量子点作为Pi检测试剂，当存在Pi时，Pi检测试剂恢复绿色荧光，从而能够特异性识别活动的精子；基于流式细胞仪，再配合基于吖啶橙染料的精子染色质结构检测方法(SCSA)，能够实现精子活率、活动精子的DNA碎片率的检测，能更直接反应精子的质量，提供更具参考价值的评价指标；
本发明中，用于制备Pi检测试剂的碳量子点是通过具有很强的抗氧化能力的番茄红素和具有还原性且富含巯基的二硫苏糖醇合成的，能够赋予碳量子点优异的还原性和清除活性氧的能力，可有效防止磷酸氢根离子向磷酸根转化而影响检测结果，并通过引入丰富的巯基到碳量子点表面，使得碳量子点很容易与银离子络合；且本发明制得的碳量子点是安全无毒的，具有更好的应用前景。
附图说明
图1为本发明的实施例1制得的碳量子点的荧光光谱。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不排除一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。
本发明提供了一种活动精子DNA碎片检测试剂盒，其包括：
Pi检测试剂，其为荧光物质与银的络合物，当Pi存在时，Pi取代络合物中的银，使得被猝灭的荧光物质恢复荧光；
酸化液，其包括盐酸、氯化钠和曲拉通X-100；
缓冲液，其包括氯化钠、乙二胺四乙酸、三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐和柠檬酸；
以及AO染色液。
本发明还进一步提供了一种基于该试剂盒的活动精子DNA碎片检测方法。以下对本发明的主要原理进行说明。
基于吖啶橙染料的精子染色质结构检测方法(SCSA)检测的是所有精子细胞：包括活动的精子、不活动的精子和死精子的DNA碎片情况，而真正更具有参考意义的应当是活动的精子的DNA碎片率，其更能直接反应精子的质量。基于现有的理论，运动的精子尾部会发生ATP降解成为ADP和pi(磷酸)的情况，所以通过检测ADP和/或pi的含量，可以对运动的精子进行识别。
而本发明中，正是通过检测pi的含量来实现活动精子的识别。本发明中的Pi检测试剂为荧光物质：碳量子点与银的络合物，该碳量子点表面富含巯基，从而非常容易与银离子络合，由于银离子是重金属，跟碳量子点结合之后，由于激发态电子转移和能量转移，导致碳量子点的绿色荧光淬灭；而当溶液中存在pi时，pi与银离子具有更强的结合能力，且生成的磷酸盐为黄色沉淀，会脱离了碳量子点溶液，使碳量子点表面吸附的银离子解离，从而使碳量子点的荧光得到恢复。所以通过检测Pi检测试剂是否恢复绿色荧光便可识别运动的精子。
以下在上述基础上提供详细的实施例，以对本发明作进一步说明。
实施例1制备碳量子点
1)将100mg番茄红素、80mg二硫苏糖醇溶于50mL乙醇和水的混合溶液中，超声搅拌至澄清，再加入0.05mL乙二胺，搅拌2分钟；
2)将步骤1)得到的溶液转移到聚四氟乙烯为内衬的反应釜中，在烘箱中加热至150℃下持续反应6小时；
3)反应结束后，待溶液冷却至室温，再用0.22μm的滤膜过滤，将滤液冷冻干燥得到未纯化的抗氧化碳量子点粉末；
4)粉末溶于超纯水中，离心，取滤液用截断分子量为1200Da的透析袋透析14小时，收集透析袋内溶液，二次冷冻干燥，即得到纯化后的抗氧化碳量子点。
番茄红素具有很强的抗氧化能力，能够有效猝灭单线态氧。本实施例中以番茄红素为原料制备的碳量子点能够保留番茄红素的强还原性和活性氧清除功能，使得制备的Pi检测试剂具有作为还原剂的应用前景。二硫苏糖醇作为原料，能够为碳量子点表面引入丰富的巯基，使得碳量子点具有可通过巯基与多种物质结合的性能，从而能方便作为荧光物质或功能性化合物修饰到其他物质表面。
本发明中制备碳量子点的原料无毒性，制得的碳点具有绿色安全的性能优势。
参照图1，为本实施例中制得的碳量子点的荧光光谱，该碳量子点在在200-400nm区间都有吸收，荧光激发峰为350nm附近，对应的发射峰位于475nm附近，能够在激发下发出明亮的蓝色荧光。
实施例2制备Pi检测试剂
将碳量子点溶于去离子水中，搅拌溶解，配置成10μg/mL的碳量子点溶液，然后再加入足量的硝酸银，混合得到Pi检测试剂，避光保存。采用350nm的激发光照射Pi检测试剂，其无绿色荧光发出，说明Pi检测试剂制备成功。然后在Pi检测试剂中滴加磷酸溶液，混匀反应后，可以观察到产生了黄色沉淀(磷酸银)，再采用350nm的激发光照射，反应后的溶液发出明亮的滤光，说明碳量子点荧光已恢复，能够说明利用Pi检测试剂检测Pi的可行性。
实施例3一种活动精子DNA碎片检测试剂盒
本实施例提供的试剂盒包括：
Pi检测试剂，其中的碳量子点的浓度为6μg/mL；
酸化液，0.1mol/L的盐酸、0.2mol/L的氯化钠和质量分数0.1％的曲拉通X-100；
缓冲液，0.15mol/L的氯化钠、0.3mmol/L的乙二胺四乙酸、0.01mol/L三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐、0.05-0.2mol/L的磷酸氢二钠、0.1mol/L柠檬酸；
以及AO染色液，浓度为10μg/mL。
实施例4一种活动精子DNA碎片检测方法
本实施例提供的方法采用实施例3的试剂盒进行活动精子DNA碎片的检测，该方法包括以下步骤：
S1、取精子样品，解冻液化后用37℃的缓冲液将精子样品稀释至1-5×106个/mL，得到精子稀释液；
S2、取500μL精子稀释液，向其中加入350μL酸化液，处理30s；
S3、向步骤S2得到的产物中加入8μL缓冲液，轻轻混匀，然后加入40μL的Pi检测试剂，漩涡混匀，反应15min；
S4、向步骤S3得到的产物中加入10μL AO染色液，轻轻混匀，孵育2min；
S5、将步骤S4得到的产物上流式细胞仪检测，设置流式细胞仪的通道、激发波长等参数，收集精子的蓝色、绿色和红色荧光：350nm激发光激发，收集475nm处的荧光信号，即蓝色荧光492nm激发光激发，收集530nm处的荧光信号(绿色荧光)和640nm处的荧光信号(红色荧光)；
重复检测样品3次，每次至少分析6000个细胞；
结合三种荧光检测结果进行分析：先通过蓝色荧光检测出活动的精子，然后根据绿色荧光和红色荧光分析得到活动的精子中的DNA碎片率。首先通过检测出的蓝色荧光精子(活动精子)，可计算得到活动精子的占比，得到样品中的精子活率。通过所有精子中，红色荧光的比例，可以得到总体样品中的DNA碎片率；再结合蓝色荧光将活动精子与非活动精子区分开，通过活动精子中的红色荧光和蓝色荧光的比例，即可计算得到活动精子中的DNA碎片率。
本实施例中，还采用常规的MAKLER精子计数板对相同的样品进行活动精子占比的检测，以与本实施例的方法进行比较，来验证本实施例的方法的检测效果，对3个样品分别进行检测的结果如下表：
从以上结果可以看出，采用实施例4的方法检测的活动精子比率与MAKLER精子计数板检测检测结果相近，可以说明本发明的方法能够实现活动精子比率的检测和活动精子DNA碎片比率的检测，相对于MAKLER精子计数板检测，本发明的方法效率更高；相对于传统的DNA碎片检测方法，本发明能够提供更具参考价值的检测结果。
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节。
Claims (10)
1.一种活动精子DNA碎片检测试剂盒，其特征在于，包括：
Pi检测试剂，其为荧光物质与银的络合物，当Pi存在时，Pi取代络合物中的银，使得被猝灭的荧光物质恢复荧光；
酸化液，其包括盐酸、氯化钠和曲拉通X-100；
缓冲液，其包括氯化钠、乙二胺四乙酸、三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐和柠檬酸；
以及AO染色液。
2.根据权利要求1所述的活动精子DNA碎片检测试剂盒，其特征在于，所述酸化液包括：0.05-0.2mol/L的盐酸、0.1-0.5mol/L的氯化钠和质量分数0.02-0.2％的曲拉通X-100。
3.根据权利要求2所述的活动精子DNA碎片检测试剂盒，其特征在于，所述缓冲液包括：0.1-0.5mol/L的氯化钠、0.2-2mmol/L的乙二胺四乙酸、0.005-0.03mol/L三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐、0.05-0.2mol/L的磷酸氢二钠、0.05-0.2mol/L的柠檬酸。
4.根据权利要求1所述的活动精子DNA碎片检测试剂盒，其特征在于，所述荧光物质为碳量子点，其通过以下方法制备得到：
1)将番茄红素、二硫苏糖醇溶于乙醇和水的混合溶液中，再加入乙二胺，搅拌；
2)将步骤1)得到的溶液转移到反应釜中，加热反应；
3)反应结束后，将产物过滤，滤液干燥得到粗产品；
4)将粗产品溶于超纯水中，离心，将离心液透析，收集透析袋内溶液，冷冻干燥，即得所述碳量子点。
5.根据权利要求4所述的活动精子DNA碎片检测试剂盒，其特征在于，所述碳量子点通过以下方法制备得到：
1)将番茄红素、二硫苏糖醇溶于乙醇和水的混合溶液中，超声搅拌至澄清，再加入乙二胺，搅拌1-3分钟；
2)将步骤1)得到的溶液转移到聚四氟乙烯为内衬的反应釜中，在烘箱中加热至130℃-160℃下持续反应4-12小时；
3)反应结束后，待产物冷却至室温，再用滤膜过滤产物，将滤液冷冻干燥得到粗产品；
4)将粗产品溶于超纯水中，离心，取滤液用截断分子量为800-1500Da的透析袋透析8-16小时，收集透析袋内溶液，冷冻干燥，即得所述碳量子点。
6.根据权利要求5所述的活动精子DNA碎片检测试剂盒，其特征在于，所述Pi检测试剂的制备方法为：将碳量子点溶于去离子水中，搅拌溶解，然后再加入足量的银离子，混合得到Pi检测试剂，避光保存。
7.根据权利要求6所述的活动精子DNA碎片检测试剂盒，其特征在于，所述Pi检测试剂的制备方法为：将碳量子点溶于去离子水中，搅拌溶解，配置成10μg/mL的碳量子点溶液，然后再加入足量的硝酸银，混合得到Pi检测试剂，避光保存。
8.一种活动精子DNA碎片检测方法，其特征在于，其使用权利要求1-7中任意一项所述的试剂盒进行活动精子DNA碎片的检测，该方法包括以下步骤：
S1、用缓冲液将精子样品稀释，得到精子稀释液；
S2、向精子稀释液中酸化液，处理15-120s；
S3、向步骤S2得到的产物中加入缓冲液，然后加入Pi检测试剂，漩涡混匀，反应5-60min；
S4、向步骤S3得到的产物中加入AO染色液，混匀；
S5、将步骤S4得到的产物上流式细胞仪检测，收集精子的蓝色、绿色和红色荧光；
结合三种荧光检测结果进行分析：先通过蓝色荧光检测出活动的精子，然后根据绿色荧光和红色荧光分析得到活动的精子中的DNA碎片率。
9.根据权利要求8所述的活动精子DNA碎片检测方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
S1、用缓冲液将精子样品稀释至1-5×106个/mL，得到精子稀释液；
S2、取500μL精子稀释液，向其中加入350μL酸化液，处理30s；
S3、向步骤S2得到的产物中加入8μL缓冲液，混匀，然后加入40μL的Pi检测试剂，漩涡混匀，反应15min；
S4、向步骤S3得到的产物中加入10μL AO染色液，混匀，孵育2min；
S5、将步骤S4得到的产物上流式细胞仪检测，收集精子的蓝色、绿色和红色荧光；
结合三种荧光检测结果进行分析：先通过蓝色荧光检测出活动的精子，然后根据绿色荧光和红色荧光分析得到活动的精子中的DNA碎片率。
10.根据权利要求9所述的活动精子DNA碎片检测方法，其特征在于，其中，在Pi存在的条件下，Pi检测试剂可在波长为200-400nm的激发光的激发下产生绿色荧光。
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