CN110455756A - 一种同时检测二价铅离子和二价铜离子的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种简单的敏感荧光纳米探针，基于钳形酶链和环状催化剪切反应同时检测Pb²⁺和Cu²⁺。通过两个分裂的酶链DNA形成钳形酶链DNA。所述钳形酶链DNA可以通过与金纳米颗粒上的底物链组合形成Pb²⁺和Cu²⁺特异性DNA酶。当溶液中存在Pb²⁺或Cu²⁺，荧光团标记的底物链被切割并从金纳米颗粒的表面释放。同时，钳形酶链DNA也被释放用于下一轮环状催化剪切反应，导致Pb²⁺或Cu²⁺的荧光强度显著恢复。该方法灵敏度高，Pb²⁺检测限为80pM，Cu²⁺检出限为30pM。它还显示出同时检测Pb²⁺和Cu²⁺的高特异性。该方法具有用于环境和活细胞样品中金属离子的同时检测和成像的巨大潜力。

Description

一种同时检测二价铅离子和二价铜离子的方法

技术领域

本发明涉及金属离子的检测领域，特别是二价铅离子和二价铜离子检测方法领域。

背景技术

金属离子不仅可以维持生物分子的结构，还可以参与各种生命过程，在材料运输，信息传递，能量转换和生物催化等许多过程中发挥着关键作用。此外，许多研究表明，金属离子的代谢紊乱是诱发疾病的重要因素。研究结果表明，金属离子的异常稳态可能是许多疾病的常见发病机制，包括阿尔茨海默病，肌萎缩侧索硬化症，白内障，线粒体疾病和帕金森病。因此，同时检测多种金属离子对于理解细胞生物学中金属离子的生理和病理功能尤为重要。到目前为止，已经建立了一些金属离子检测技术，包括电感耦合等离子体发射光谱，电感耦合等离子体质谱和原子吸收光谱。虽然这些技术准确可靠，但繁琐的操作和经验丰富的操作员限制了它们在许多领域的应用。此外，这些技术不能用于检测或成像活细胞中的多种金属离子。

最近，由于DNA酶对金属离子的高特异性和亲和力而引起了很多关注。DNA酶由催化核心和两条双链臂复合而成，它们由酶链(E-DNA)和底物链(S-DNA)形成。DNA酶可以在核糖腺嘌呤(rA)位点用特定的金属离子切割S-DNA。它已被用于检测金属离子，如Pb²⁺，Cu²⁺，Mg²⁺，Cd²⁺，Zn²⁺和UO₂ ²⁺，通过各种信号转导策略，包括电化学，比色法，荧光，电化学发光和拉曼方法[13-22]。此外，基于DNA酶的荧光策略已经成功地用于细胞中多种金属离子的检测和成像，因为其具有高的空间和时间保真度，以促进对相关疾病中金属离子的作用的理解。现有技术中，使用基于DNAzymes的金纳米粒子探针来检测活细胞中的Zn²⁺和Cu²⁺并对其进行成像，双色编码的DNAzyme四面体纳米探针，用于同时检测和成像细胞内UO₂ ²⁺和Pb²⁺。然而，由于这些策略的灵敏度限制，细胞必须在测试前与高浓度的金属离子一起孵育以增加细胞内金属离子浓度。因此，期望开发一种纳米探针以同时以高灵敏度同时检测多种金属离子。

发明内容

为解决上述问题，本发明提供一种简单的敏感荧光纳米探针，基于钳形酶链和环状催化剪切反应同时检测Pb²⁺和Cu²⁺。

本发明包括如下步骤：

1)将分裂DNA酶链1和分裂DNA酶链2混合形成钳形酶链DNA，其中，分裂DNA酶链1序列为：AATCATCTCTGAAGTAGACCTAGCCTCTTTCTTTTTAAGAAAGAAC，分裂DNA酶链2序列为：GGTAAGCCTGGGCTAGGTCGCCGCCGTAGTG；

2)将所述钳形酶链DNA与底物链修饰的金纳米颗粒混合以形成特异性DNA酶结构，其中，底物链为：对应二价铅离子的FAM-CACTrAGGAAGAGATGATTAAAAAAAAAAAA-SH和对应二价铜离子的SH-AAAAAAAAAAAAAGCTTCTTTCTAATACGGCTTACC-Cy5(FAM(羧基荧光素)，Cy5(花青素))；

3)在步骤(2)所得溶液中加入适量待测样品溶液；

4)测定步骤(3)所得溶液荧光光谱，并用标准曲线法计算溶液中二价铅离子和二价铜离子浓度。

优选的，所述步骤1)中，将分裂DNA酶链1和分裂DNA酶链2在含有300mM NaCl的10mM Tris-HCl溶液(pH＝8)中孵育20分钟以形成钳形酶链DNA。

优选的，所述步骤3)中加入适量待测样品溶液后在室温下温育80分钟以进行环状切割。

优选的，步骤4)中，FAM的荧光光谱从495nm到600nm获得，激发波长为490nm；Cy5的荧光发射光谱从650nm扫描到750nm，激发波长为640nm。

本发明提供一种简单的敏感荧光纳米探针，基于钳形酶链和环状催化剪切反应同时检测Pb²⁺和Cu²⁺。因此，该方法提供高灵敏度和优异的选择性。它还被用于同时检测环境和生物样品中的Pb²⁺和Cu²⁺，显示出令人满意的结果和有希望的应用前景。

附图说明

图1为本发明检测过程示意图。

图2为不同样品的荧光强度。

图3为干扰金属离子的检测结果与目标金属离子的检测结果的对比图。

具体实施例

下面结合实施例对本发明作进一步详细的说明。

该方法的检测原理如图1所示，将FAM标记的底物链和Cy5标记的底物链固定在金纳米颗粒(AuNP)上。FAM和Cy5的荧光信号被AuNP显著淬灭。DNA酶的两个分裂的DNA酶链可以通过中间的互补部分形成钳形酶链。所述钳形酶链可以与AuNP上的底物链结合，形成Pb²⁺和Cu²⁺特异性DNA酶。当溶液中存在Pb²⁺或Cu²⁺，荧光团标记的底物链被切割并从金纳米颗粒的表面释放。同时，钳形酶链也被释放并与AuNP上的另一荧光团标记的底物链重新结合，用于下一个DNA酶切割反应循环。在循环过程中，钳形酶链可以对FAM和Cy5标记的S-DNA进行环状切割，产生大量荧光团标记的底物链片段和扩增的荧光信号。

实施例1

将分裂的DNA酶链1和分裂的DNA酶链2在含有300mM NaCl的10mM Tris-HCl溶液(pH＝8)中孵育20分钟以形成钳形酶链。将形成的钳形酶链与底物修饰的金纳米颗粒混合以形成特异性DNA酶结构。随后，加入含金属离子的待测样品并在室温下温育80分钟以进行环状切割。然后，对于FAM，监测混合溶液在495nm至600nm的范围内的荧光光谱，对于Cy5，监测650nm至750nm的荧光光谱。通过FAM和Cy5的荧光强度分别计算Pb²⁺和Cu²⁺的浓度。其荧光信号为图2样品6的荧光强度。

实施例2

不同样品的荧光强度：如图2所示，不同组成的测试液以及测试条件下，得到的荧光强度是不同的。样品1为待测液中不存在Pb²⁺和Cu²⁺，其余条件同实施例1，其荧光强度为背景荧光强度。样品2为不存在分裂的酶链，其余条件同实施例1，其荧光强度与样品1的荧光强度相似。这可以解释为没有分裂的酶链不能形成钳形酶链，导致环状剪切反应的抑制。样品3为仅有一半的反应时间，其余条件同实施例1，显示相对强的荧光强度，这表明DNA酶的环状剪切反应仅在半反应时间内没有完成，只导致荧光强度的部分恢复。样品4为待测液中只存在Pb²⁺而不存在Cu²⁺，其余条件同实施例1，显示FAM的强荧光信号，其中存在Pb²⁺，表明Pb²⁺仅通过DNA酶切割反应引起FAM标记的S-DNA裂解，但是，由于不存在Cu²⁺，Cy5的荧光强度仅为背景荧光强度。样品5为待测液中只存在Cu²⁺而不存在Pb²⁺，其余条件同实施例1，由于Cu²⁺特异性DNA酶的环状切割，样品5显示出具有Cu²⁺存在的Cy5的高荧光信号，但是，由于不存在Pb²⁺，FAM的荧光强度仅为背景荧光强度。样品6中同时存在Cu²⁺和Pb²⁺，所以导致较强的FAM和Cy5荧光信号。

实施例2

通过几种潜在的干扰金属离子评估该方法的特异性。除待测样品的金属离子种类不同外，其余条件同实施例1，其检测结果如图3所示，除Pb²⁺(10nM)和Cu²⁺(5nM)外，Ca²⁺,Zn^{2 +},Mg²⁺,Sn²⁺,Fe²⁺,Hg²⁺(浓度都为50nM)都显示出可忽略的荧光强度，表明干扰金属离子对目标金属离子具有可忽略的影响。另外，对于混合的Pb²⁺和Cu²⁺样品，在两个荧光波长通道处观察到相应的荧光信号。两种波长通道的荧光强度与仅具有一种目标金属离子的样品相似。这些结果表明，该方法可以同时检测Pb²⁺和Cu²⁺，其相互之间没有干扰，并且该方法的特异性不受其他金属离子的存在的影响。这些结果表明该方法具有良好的抗干扰能力和出色的选择性。

实施例3

为研究该方法的实际应用可能性，特将其应用于环境水样和人血清样品的检测。水样通过离心纯化并用0.22μm膜过滤。之后，将水样的pH调节至8并在测试前将其适当稀释。然后，按照实施例1的方法进行检测。结果如表1所示，水样中Pb²⁺和Cu²⁺的浓度分别为32.4nM和267.2nM，回收率为98.6％～109.6％。此外，该方法已被用于同时检测人血清样品中的Pb²⁺和Cu²⁺。Pb²⁺和Cu²⁺分别为0.203μM和13.56μM。这些结果表明该方法具有潜在的应用前景，可同时检测环境样品和生物样品中的Pb²⁺和Cu²⁺。表1如下：

以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。

Claims (4)

1.一种同时检测二价铅离子和二价铜离子的方法，包括如下步骤：

1)将分裂DNA酶链1和分裂DNA酶链2混合形成钳形酶链DNA，其中，分裂DNA酶链1序列为：AATCATCTCTGAAGTAGACCTAGCCTCTTTCTTTTTAAGAAAGAAC，分裂DNA酶链2序列为：GGTAAGCCTGGGCTAGGTCGCCGCCGTAGTG；

2)将所述钳形酶链DNA与底物链修饰的金纳米颗粒混合以形成特异性DNA酶结构，其中，底物链为：对应二价铅离子的FAM-CACTrAGGAAGAGATGATTAAAAAAAAAAAA-SH和对应二价铜离子的SH-AAAAAAAAAAAAAGCTTCTTTCTAATACGGCTTACC-Cy5(FAM(羧基荧光素)，Cy5(花青素))；

3)在步骤(2)所得溶液中加入适量待测样品溶液；

4)测定步骤(3)所得溶液荧光光谱，并用标准曲线法计算溶液中二价铅离子和二价铜离子浓度。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤1)中，将分裂DNA酶链1和分裂DNA酶链2在含有300mM NaCl的10mM Tris-HCl溶液(pH＝8)中孵育20分钟以形成钳形酶链DNA。

3.如前述权利要求之一所述的方法，其特征在于所述步骤3)中加入适量待测样品溶液后在室温下温育80分钟以进行环状切割。

4.如前述权利要求之一所述的方法，其特征在于步骤4)中，FAM的荧光光谱从495nm到600nm获得，激发波长为490nm；Cy5的荧光发射光谱从650nm扫描到750nm，激发波长为640nm。