CN113943777A

CN113943777A - 一种自保护DNA酶步行器的构建方法及其在活细胞miRNA检测中的应用

Info

Publication number: CN113943777A
Application number: CN202111276290.9A
Authority: CN
Inventors: 吴再生; 王伟军; 高艳莎; 王文青
Original assignee: Fuzhou University
Current assignee: Fuzhou University
Priority date: 2021-10-29
Filing date: 2021-10-29
Publication date: 2022-01-18

Abstract

本发明提供了一种自保护DNA酶步行器的构建方法及其在活细胞miRNA检测中的应用，属于纳米材料技术领域。所述自保护DNA酶步行器包括纳米金、硫醇化底物探针和Mg²⁺依赖的DNA酶探针。该自保护DNA酶步行器能够通过特定底物探针切割来驱动自保护DNA酶步行者在金纳米颗粒轨道上的逐步运动以实现对miRNA生物标志物进行高灵敏度的细胞内成像。所述自保护DNA酶步行器能准确地区分患病细胞与健康细胞，并且由于DNA的可设计性，DNA酶步行器可以扩展到仅通过改变目标结合域来对其他miRNA进行成像，是一种很有前景的癌症诊断和预后工具。

Description

一种自保护DNA酶步行器的构建方法及其在活细胞miRNA检测中的应用

技术领域

本发明属于纳米材料技术领域，具体涉及一种自保护DNA酶步行器的构建方法及其在活细胞miRNA检测中的应用。

背景技术

MicroRNA（miRNA，大约22个核苷酸）是一类在动物、植物和一些病毒中发现的RNA分子，具有内源性、非编码和调节性等特点，在RNA沉默和基因调控中扮演着重要角色。越来越多的研究证据表明，miRNA异常表达与各种癌症和许多其他病理状况的发生有关。例如，miRNA-21与恶性肿瘤的增殖、凋亡、侵袭和迁移密切相关，经常在慢性淋巴细胞白血病、宫颈癌、肺癌、乳腺癌和前列腺癌中过度表达。因此，miRNA成为癌症诊断和治疗最有希望的靶点之一。

尽管miRNA是癌症诊断和治疗的关键点, 但是对于miRNA的检测仍然具有较大挑战性。首先，癌细胞中miRNA的表达水平较低（约为0.35-1.20 amol/ngRNA）和对核酸酶消化的低稳定性的特征，通过Northern印迹和微阵列杂交等标准方法难以检测生物体液中的miRNA。其次，miRNA家族成员之间具有高序列同源性，这一特点要求传感平台具有严格的检测特异性。尽管定量逆转录PCR (qRT-PCR)这一检测方法通常被认为是核酸检测的“金标准”方法，但它不适合筛选miRNA表达，尤其是体内分析。为了克服这些限制，研究者们付出了相当大的努力，提出了一些通过基于光学、电化学发光和电化学等测量方法来放大测量信号。尽管这些方法在一定程度上克服了某些问题，但大多数都无法检测到活细胞内的miRNA。荧光原位杂交(FISH)分析通常用于通过在荧光显微镜下利用多个荧光标记的寡核苷酸探针来检测固定细胞或活细胞中的 miRNA分子，是目前常用的用于检测活细胞内miRNA的方法。然而，探针与靶标的结合比率1:1 不足以提供高灵敏度来量化低丰度的miRNA。因此，开发一种有效的扩增策略势在必行，尤其是开发一种可以敏感的细胞内成像并且能够直接可视化活细胞中的miRNA技术迫在眉睫。

为了产生放大的信号输出，一些蛋白酶介导的等温信号放大方法常用于miRNA的痕量检测，例如滚环扩增(RCA)和等温环状链置换聚合(ICSDP)等。然而，蛋白酶这一生物材料对周围微环境的变化较为敏感，并且在细胞环境中通常表现出受损的催化活性。最近，一类新兴的无酶信号放大方法——DNAzyme介导的催化(DNAzymatic) 反应出现在了大众视野中。在这项技术中，RNA切割的DNA 酶由于其优异的活性和灵活的可编程性而在 miRNA的检测中备受关注。然而，DNA酶应用于细胞内的miRNA检测仍然面临两个主要问题。首先，由于核碱基的高度负电荷骨架和亲水性，DNA酶难以穿过亲脂性细胞膜。其次，内源性核酸酶可以在DNA酶到达细胞目的地之前就将DNA酶切割掉，导致DNA酶无法有效发挥作用。因为基于金纳米粒子(AuNP) 的球形核酸(SNA)展现了卓越的细胞渗透能力，并且表面限制的核酸具有相对较长的细胞内寿命。DNA酶形成的纳米复合物，例如通过在 AuNP上组装 DNA酶制备的纳米步行器和纳米机器，有望减轻完全由DNA酶制成纳米材料所遇到的不利因素。不幸的是，很少有人直接关注针对脱氧核糖核酸酶对体内核酸酶降解的敏感性，可能是因为缺乏可靠的理论模型来预测保护性二级结构或外源性保护涂层的适当排列以提高其生物稳定性而不影响催化活性。事实上，即使被限制在AuNP上，DNA酶步行器仍然会在活细胞中降解，尤其是在步进信号结合靶标时。因此，开发一种用于长期在细胞内miRNA成像的DNA酶步行器在实际应用中仍然是一项艰巨的挑战。

基于上述原因，本发明设计了一种由AuNP介导的自我保护DNA酶步行器（ES-AuNP），该DNA酶步行器适用于在足够长的孵育时间内对活细胞内的miRNA进行荧光成像。具体来说，DNA酶步行器由AuNP核和核酸壳组成，将硫醇化底物探针通过Au-S键相互作用组装在AuNP表面，该链包含可裂解的腺苷核糖核苷酸(rA)，两侧是内臂和外臂，能够与Mg²⁺依赖的DNA酶探针的两个结合臂的序列互补分子杂交。DNA酶步行器的催化核心被一个目标结合域隔开，该域可以抑制切割活性并作为拱形保护盾，导致自我保护的DNA酶步行器（环形刚性保护作用发挥）。对于信号输出而言，我们将FAM荧光基团修饰在底物探针上，当硫醇化的底物探针成功连接在AuNP上时，底物探针的FAM荧光团的荧光被 AuNP 淬灭，因此在没有目标 miRNA 的情况下，该DNA步行器的传感系统处于关闭状态。该DNA酶步行器无需任何转染剂即可有效进入细胞。一旦内化到细胞中，DNA酶步行器的催化活性就会被目标探针（miRNA）激活，miRNA在DNA酶步行器表面的逐步运动由底物的特定水解提供动力，无需额外的能量供应。更重要的是，靶标结合可以增强防护罩的结构稳定性，进一步提高抗核酸酶降解能力，使脱氧核糖核酸酶的细胞内整体寿命足够长，可以完全在金纳米粒子上行走（刚性环形保护作用发挥）。通过这一系列的酶切割反应，大量底物被切割，从而在细胞内显示出了增强的荧光信号。利用DNA酶步行器这一有效设计，无论细胞环境如何，都可以轻松区分目标miRNA和非目标信号，并且能够有效的将将患病细胞系与健康细胞系区分开来，为准确评估癌症分期和进展提供了一个有前景的平台，也能够提供用于治疗过程中的反应和预后评估。

发明内容

本发明的目的在于针对上述问题，提供一种自保护DNA酶步行器的构建方法及其在活细胞miRNA检测中的应用。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种自保护DNA酶步行器，所述DNA酶步行器包括纳米金、硫醇化底物探针和Mg²⁺依赖的DNA酶探针；

所述纳米金为通过柠檬酸钠还原法制备的13nm的纳米金颗粒AuNP；

所述硫醇化底物探针为：5’-/FAM/ATGCACTATrAGGAAGAGACACGTAGTTTTTTTTTT-SH

-3’;

所述Mg²⁺依赖的DNA酶探针为：5’-CTACGTGTCTCTTCTCCGAGCCTGATAAGCTAAAAT

CAACATCAGTCGGTCGAAATAGTGCAT-3’。

上述一种自保护DNA酶步行器的构建方法，包括以下步骤：

（1）通过柠檬酸钠还原法制备直径为13nm的纳米金颗粒AuNP；

（2）在19.5 µL 500 mM pH 5.2的Tris-Ac buffer中将0.5µL 10 mM三(2-羧乙基)膦与30 µL 100 µM 硫醇化底物链探针混合，在室温下孵育1小时对巯基进行还原；

（3）往还原处理的硫醇化底物探针溶液中加入3 µL 100 µM Mg²⁺依赖的DNA酶探针，然后在37 °C下孵育 3 小时以进行完全杂交；然后，将得到的混合物加入到含有1 mL10 nM AuNP 溶液的干净玻璃小瓶中，玻璃小瓶在黑暗中200 rpm摇晃孵育16小时，孵育时间到达后，在200 rpm摇动的状态下，逐滴加入10.3 µL pH 8.2 的500 mM 高压灭菌的Tris-Ac buffer，使得Tris-Ac的最终浓度为5 mM；随后，在200 rpm摇动的状态下滴加300µL 1 M NaCl溶液，所得溶液在室温下避光轻轻摇动储存至少24小时；最后，将最终溶液16110 g，离心15分钟，沉淀物 (DNA酶步行器) 用200 µL高压灭菌的pH 8.2 Tris-Acbuffer洗涤3次；沉淀物最终溶解在pH 8.2 Tris-Ac (400 µL)中，将所得 DNA酶步行器溶液避光储存在4°C。

上述步骤（3）中Mg²⁺依赖的DNA酶探针与硫醇化底物探针的摩尔比为1:10。

上述自保护DNA酶步行器在检测活细胞内miRNA中的应用。

一种由上述自保护DNA酶步行器改造而来的通用DNA酶步行器，所述通用DNA酶步行器为针对检测目标改变Mg²⁺依赖的DNA酶探针的序列所得。

进一步的，上述的通用DNA酶步行器为针对miRNA-Let-7a检测目标改变Mg²⁺依赖的DNA酶探针的序列所得；改变后的Mg²⁺依赖的DNA酶探针序列为：5’-CTACGTGTCT

CTTCTCCGAGCCTACTACCTCAAAAAACTATACAACCGGTCGAAATAGTGCAT-3’。

进一步的，上述通用DNA酶步行器在检测活细胞内miRNA中的应用。

一种包含上述自保护DNA酶步行器的生物传感器。

一种包含上述通用DNA步行器的生物传感器。

发明原理：

据文献报道，一个DNAzyme 可以分裂成两个组分或通过在中间插入靶结合片段来分离，靶物种将这两个组分结合后可以恢复其催化活性。首先，Mg²⁺依赖的DNA酶探针被设计，该DNA酶链包含内臂区域、外臂区域（分别与硫醇化底物探针的内臂区域和外臂区域结合）、未激活的核心区域（DNA酶的催化活性核心被miRNA识别区域分成两半，从而抑制其DNA酶的催化功能）、miRNA识别区域等四个区域。其次，硫醇化底物探针被设计，其包含巯基基团修饰区域（通过Au-SH作用力将探针固定在AuNP表面）、内臂区域、外臂区域（分别与DNA酶探针的内臂区域和外臂区域结合）、聚T间隔区（为了避免AuNP核对DNA杂交的空间干扰并增加底物对行走DNA酶的可及性，在硫醇部分和底物片段之间设计了一个聚T间隔区）、切割位点（它由腺苷核糖核苷酸(rA)组成，两侧是两个能够与DNA酶的两个臂杂交的DNA结构域，用作底物来组装密集且高度取向的寡核苷酸壳）和FAM荧光基团（用于信号输出）等六个区域。最后，采用直径为13 nm的AuNP作为中心核心，因为这种尺寸的AuNP可以用寡核苷酸密集功能化，有效淬灭荧光团并且很少散射可见光。DNA酶步行器探针结构示意图见图1A。

当DNA酶步行器检测到目标miRNA时，DNA酶探针两个分开的一半可以被带到正确的位置，形成催化核心所需的活性二级结构。同时，由此产生的双链环状凸起DNA屏蔽增加了结构刚性，从而进一步增强了抗核酸酶降解能力（刚性环形保护作用发挥）。随着Mg²⁺的添加，激活的DNA酶链会对底物探针进行切割，而 FAM 标记的外臂区域与AuNP淬灭剂分离，在AuNP表面留下硫醇化的半片段。即使在复杂的生物基质中，DNA酶的催化核心也可以保持完整。处于解离状态的 DNA酶的外臂在其周围寻找另一个底物中的下一个结合位点，但更稳定的内臂仍然与表面限制的硫醇化片段结合，有效的防止DNA酶步行器从纳米金轨道上脱离。之后，立足点介导的链置换反应（DNA酶介导的底物水解产生的能量）可以迫使内臂移动到外臂预结合的下一个底物中的结合位点，完成向前一步。通过这种方式，DNA酶步行器可以在没有外源能量供应的情况下沿着附着在AuNP上的S轨道以英寸蠕虫的方式步入。DNA酶步行器向前迈出的每一步都有助于荧光增加，从而导致DNA酶催化的基于多周转反应的信号放大。对于DNA酶步行器系统而言，除了 AuNP的内在细胞进入、基于高表面积体积比的富集效应和密集寡核苷酸的内切核酸酶稳定性外，DNA酶步行器还具有额外的双链环状凸起DNA介导的降解抗性，允许它有足够的时间在S-AuNP 上完全行走，从而提高细胞内miRNA检测的灵敏度。由于DNA酶步行器的固有整体特性是传统 DNA步行器所不具备的，因此在体内应用中具有重要优势，DNA酶步行器具有对细胞内 miRNA 进行灵敏成像的巨大潜力。DNA酶步行器体外检测示意图如图1B所示。

在细胞成像过程中，不涉及转染试剂，因为DNA功能化的AuNP容易被各种细胞摄取。当DNA酶步行器被细胞摄取进入靶细胞后，DNA酶被目标miRNA激活，开始对底物探针进行切割和在AuNP表面移动，随着孵育的时间增加荧光信号会不断增加，表明DNA酶步行器可用于活细胞中的miRNA成像。DNA酶步行器用于细胞内miRNA检测检测示意图如图2所示。

本发明的优点在于：

本发明所提供的一种自保护DNA酶步行器具有以下几个优点：（1）该DNA酶步行器具有较好的抗降解稳定性。对于DNA酶步行器系统而言，除了AuNP的内在细胞摄取、基于高表面积体积比的富集效应和密集寡核苷酸的内切核酸酶稳定性外，DNA酶步行器还具有额外的双链环状凸起DNA介导的抗降解能力，这些特性极大地增强了DNA酶步行器的稳定性。（2）该DNA酶步行器具有高灵敏度和高特异性。首先，AuNP的存在可以对寡核苷酸进行富集，靶标局部浓度的增加可以提高裂解速率，快速释放裂解产物，从而在更短的时间内达到荧光信号平台；其次底物探针的非特异性切割也非常低，这归因于双链miRNA与miRNA结合域复合物的刚性环状结构所提供的构象约束所导致的。（3）该DNA酶步行器可以应用于活细胞内的miRNA成像。可以对细胞内miRNA的表达水平进行评估，从而准确区分患病细胞和健康细胞。（4）该DNA酶步行器可以通过改变DNA酶步行器中Mg²⁺依赖的DNA酶探针的序列，构建能够用于细胞内特异性地检测与DNA酶探针所对应的miRNA，提出了一种通用DNA酶步行器策略。

附图说明

图1：构建DNA酶步行器探针设计示意图及其体外检测miRNA流程图。A为DNA酶步行器探针示意图，上方为Mg²⁺依赖的DNA酶探针，主要分为内臂区域、外臂区域、未激活的核心区域、miRNA识别区域，四个区域；下方位硫醇化底物探针，主要包括巯基基团修饰区域、聚T间隔区、内臂区域、外臂区域、rA切割位点和FAM荧光基团，六个区域；B为DNA酶步行器用于体外miRNA检测示意图，DNA酶步行器在miRNA不存在的情况下，DNA酶属于未激活状态，此时不产生荧光信号（第一列）；当DNA酶步行器成功识别目标miRNA后，此时DNA酶呈现出激活状态，但是由于未产生切割现象，荧光信号仍然呈现关闭状态（第二列）；当Mg²⁺存在情况下，激活的DNA酶步行器对硫醇化的底物探针进行切割，此时荧光信号激活（第三列）。

图2：自保护DNA酶步行器的构建及其用于活细胞miRNA检测的流程图。A为DNA酶步行器的构建示意图，首先将Mg²⁺依赖的DNA酶探针与硫醇化底物探针结合形成DNA酶机器，然后与纳米金结合形成最终的DNA酶步行器，接着将DNA酶步行器与细胞共同孵育后，DNA酶步行器被细胞摄取，其会在细胞内发生DNA酶激活—DNA酶切割反应，从而产生荧光信号；B为细胞内DNA酶步行器的反应示意图，Step 1：DNA酶步行器被细胞摄取，还位于miRNA识别的原始状态；Step 2：当DNA酶步行器成功识别目标miRNA后，此时DNA酶呈现出激活状态，但是由于未产生切割现象，荧光信号仍然呈现关闭状态；Step3：当Mg²⁺存在情况下，激活的DNA酶步行器对硫醇化的底物探针进行切割，此时荧光信号激活；Step4：DNA酶步行器自主步行，在AuNP表面进行步行切割，产生大量荧光信号。

图3：自保护DNA酶步行器的纳米材料表征及其可行性分析。A为DNA酶机器与AuNP的紫外可见光吸收光谱，用于证明DNA酶步行器的成功组装；B为DNA酶机器的聚丙烯酰胺凝胶电泳分析：泳道DNA Ladder代表DNA标准条带；泳道1为硫醇化底物探针；泳道2为Mg²⁺依赖的DNA酶探针；泳道3为miRNA-21目标DNA探针；泳道4为硫醇化底物探针与miRNA-21目标DNA探针的混合物；泳道5为硫醇化底物探针与Mg²⁺依赖的DNA酶探针的混合物；泳道6为miRNA-21目标DNA探针与Mg²⁺依赖的DNA酶探针的混合物；泳道7为硫醇化底物探针与Mg²⁺依赖的DNA酶探针的混合物，并加入Mg²⁺ buffer；泳道8为硫醇化底物探针与Mg²⁺依赖的DNA酶探针的混合物，并存在miRNA-21目标DNA探针；泳道9为硫醇化底物探针与Mg²⁺依赖的DNA酶探针的混合物，并存在miRNA-21目标DNA探针和Mg²⁺；

图4：自保护DNA酶步行器的性能分析。其中A为DNA酶步行器检测高灵敏性分析数据，从上至下分别为不同浓度的miRNA探针；B为DNA酶步行器的特异性检测，使用不同的miRNA来对DNA酶步行器的特异性进行分析；C为DNA酶步行器的稳定性分析数据；D为DNA酶步行器的生物兼容性分析数据，用于证明DNA酶步行器可以用于细胞内的miRNA分析。

图5：自保护DNA酶步行器用于活细胞miRNA检测分析。使用激光共聚焦显微镜成像对不同miRNA-21表达的细胞进行细胞内miRNA成像，其中低表达L02细胞中miRNA-21低表达，中表达HeLa细胞中miRNA-21中等表达，高表达MCF-7细胞中miRNA-21高表达。

图6：自保护DNA酶步行器的通用性评估。其中A为针对miRNA-Let-7a的DNA酶步行器设计示意图，B为Let-7a-DNA酶步行器的可行性分析数据。

具体实施方式

为了使本发明所述的内容更加便于理解，下面结合具体实施方式对本发明所述的技术方案做进一步的说明，但下述的实例仅仅是本发明其中的例子而已，并不代表本发明所限定的权利保护范围，本发明的权利保护范围以权利要求书为准。

实施例1 一种自保护DNA酶步行器的制备方法，包括以下步骤：

（1）首先，通过柠檬酸钠还原法制备直径为13nm的纳米金颗粒（AuNP）。接着，在19.5µL 500 mM 醋酸盐缓冲液 (Tris-Ac buffer pH 5.2) 中将0.5µL 10 mM三(2-羧乙基)膦与30 µL 100 µM 硫醇化底物链探针混合，在室温下孵育1小时对巯基进行还原。

（2）往还原处理的硫醇化底物链溶液中加入3 µL 100 µM Mg²⁺依赖的DNA酶探针，然后在37 °C下孵育 3 小时以进行完全杂交。两种核酸的摩尔比为1:10（底物探针：DNA酶探针）。然后，将得到的混合物加入到含有1 mL AuNP 溶液 (10 nM) 干净玻璃小瓶中，玻璃小瓶在黑暗中摇晃孵育16小时（转速为200 rpm）。孵育时间到达后，在轻轻摇动的状态下（转速为200 rpm），逐滴加入10.3 µL 500 mM 高压灭菌的三羟甲基氨基甲烷醋酸盐缓冲液（Tris-Ac buffer，pH =8.2），使得Tris-Ac buffer的最终浓度为5 mM。随后，在轻轻摇动的状态下（转速为200 rpm）滴加300 µL 1 M NaCl溶液，所得溶液在室温下避光轻轻摇动储存至少24小时。最后，将最终溶液进行离心操作（16110 g，15 分钟），沉淀物 (DNA酶步行器)用200 µL高压灭菌的Tris-Ac buffer (pH =8.2) 洗涤3次。沉淀物最终溶解在Tris-Acbuffer (400 µL)中，将所得 DNA酶步行器溶液避光储存在4°C以进行进一步实验。

所述纳米金为通过柠檬酸钠还原法制备的13nm的纳米金颗粒（AuNP）；

-3’;

CAACATCAGTCGGTCGAAATAGTGCAT-3’。

实施例2一种自保护的DNA酶步行器用于体外检测miRNA的可行性分析

使用实施例1的方法构建的自保护DNA酶步行器，以miRNA-21目标探针进行可行性分析。

所使用的miRNA-21目标探针序列为：5’-TAGCTTATCAGACTGATGTTGA-3’。

可行性分析具体步骤如下：

首先，往18 μL pH 5.2的Tris-Ac Buffer 溶液加入Mg²⁺依赖的DNA酶探针（0.1 μM）和硫醇化底物探针(1 μM)，然后在37 °C下孵育3 h，使Mg²⁺依赖的DNA酶探针与硫醇化底物探针充分杂交。接着，加入1 μL 2 μM miRNA-21目标探针以激活DNA酶机器。在37 °C下孵育30分钟后，加入1 μL 200 mM Mg²⁺以启动 DNA酶催化的裂解。所得溶液在37°C下孵育8小时。其他样品，包括空白和对照，是用相应的缓冲溶液而不是包括探针和Mg²⁺的组合物制备的。

图3A为DNA酶机器与AuNP的紫外可见光吸收光谱，与AuNP相比，DNA酶步行器的最大吸收波长显示出相当大的红移(6 nm)，表明核酸成功连接到AuNP的表面。

图3B为DNA酶机器的聚丙烯酰胺凝胶电泳分析图：泳道DNA Ladder代表DNA标准条带；泳道1为硫醇化底物探针；泳道2为Mg²⁺依赖的DNA酶探针；泳道3为miRNA-21目标DNA探针；泳道4为硫醇化底物探针与miRNA-21目标DNA探针的混合物；泳道5为硫醇化底物探针与Mg²⁺依赖的DNA酶探针的混合物；泳道6为miRNA-21目标DNA探针与Mg²⁺依赖的DNA酶探针的混合物；泳道7为硫醇化底物探针与Mg²⁺依赖的DNA酶探针的混合物，并加入Mg²⁺ buffer；泳道8为硫醇化底物探针与Mg²⁺依赖的DNA酶探针的混合物，并存在miRNA-21目标DNA探针；泳道9为硫醇化底物探针与Mg²⁺依赖的DNA酶探针的混合物，并存在miRNA-21目标DNA探针和Mg²⁺。与泳道7和泳道8不同，泳道9没有底物带，但显示了两个新带，其中一个条带为硫醇化底物探针的外臂区域，证明DNA酶对底物探针进行了酶切割，表明裂解产物的产生确实需要miRNA-21目标探针和辅因子 Mg²⁺二者的共存。显然，正如预期的那样，开发的自保护DNA酶机器可以在目标miRNA存在的情况下激活DNA酶，从而切割底物链。

实施例3 自保护DNA酶步行器对目标DNA探针检测能力分析

使用实施例1的方法构建了自保护的DNA酶步行器，通过加入不同浓度的目标DNA探针，然后使用荧光光谱仪对其动力学进行测试。具体步骤如下：

在 37 ̊C 条件下监测不同浓度miRNA-21目标探针样品和空白的荧光信号随时间变化曲线，扫描时间为1h，其中激发波长为488 nm，发射波长为520 nm。具体来说，将终浓度为2nM的DNA酶步行器和不同浓度的 miRNA-21目标探针（终浓度分别为0、100 pM、600pM、1 nM、4 nM、8 nM、10 nM、12 nM 和 15 nM）混合，并用Tris-Ac buffer（pH =8.2）将体积调节至190 μL。混合溶液在37 ̊C孵育30分钟后，加入10 μL Mg²⁺溶液（终浓度为200 mM）来启动DNA酶步行器进行酶切割反应，并立即进行实时荧光监测。

图4A为保护的DNA酶步行器对目标DNA探针检测能力分析实验。图4A展示了在不同浓度的miRNA-21目标探针下，DNA酶步行器的荧光强度随着孵育时间的增加而增加，靶浓度的增加可以提高裂解速率，快速释放裂解产物，从而在更短的时间内达到荧光信号平台。

实施例4 自保护DNA酶步行器对目标DNA探针特异性能力分析

使用实施例1的方法构建了自保护的DNA酶步行器，通过加入不同的DNA目标探针，然后使用荧光光谱仪对其荧光强度进行测量。所使用的DNA目标探针如下：

miRNA-21目标探针：5’-TAGCTTATCAGACTGATGTTGA-3’；

miRNA-141目标探针：5’-TAACACTGTCTGGTAAAGATGG-3’；

miRNA-200b目标探针：5’-TAATACTGCCTGGTAATGATGA-3’；

miRNA-429目标探针：5’-TAATACTGTCTGGTAAAACCGT-3’；

miRNA-Let-7d目标探针：5’-AGAGGTAGTAGGTTGCATAGTT-3’；

具体步骤如下：对于特异性测试，将相同浓度的 miRNA-21目标探针、miRNA-141目标探针、miRNA-200b目标探针、miRNA-429目标探针和miRNA-Let-7d目标探针（每种探针终浓度为10 nM）分别加入到DNA酶步行器中（终浓度为2 nM)。混合溶液在37 ̊下孵育 30 分钟后，加入Mg²⁺ 溶液（最终浓度为10 mM）。混合溶液在37 ̊C避光孵育 8 小时后，收集荧光光谱，并利用520 nm处的荧光强度评估不同分析物种类诱导的荧光信号。

图4B为相应的自保护DNA酶步行器对目标DNA探针特异性能力分析结果。使用miRNA-141目标探针、miRNA-200b目标探针、miRNA-429目标探针和miRNA-Let-7d目标探针作为对照，探索DNA酶步行器对miRNA-21目标探针的检测特异性。如图4B 所示，在相同浓度下，目标miRNA（miRNA-21）诱导的荧光信号远高于非目标miRNA。即使孵育很长时间（8小时），硫醇化底物探针的非特异性切割也非常低。这应该归因于双链目标探针/目标结合域复合物的刚性环状结构所提供的构象约束。

实施例5 自保护DNA酶步行器的稳定性和生物兼容性分析

使用实施例1的方法构建了自保护的DNA酶步行器，通过将DNA酶步行器与10% （v/v）胎牛血清共同孵育不同时间点，然后使用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳对其稳定性进行评估；通过将DNA酶步行器与细胞共同孵育不同时间点，使用3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐试剂（MTT）对其细胞存活率进行评估，从而对DNA酶步行器的生物兼容性进行分析。具体步骤如下：

稳定性评估：为了探索 DNA酶步行器在胎牛血清中的稳定性，将DNA酶步行器（最终浓度为 2 nM）分别与 Mg²⁺（最终浓度为 10 mM）和miRNA-21目标序列（终浓度为10 nM）混合并用 Tris-Ac buffer（pH =8.2）将体积调节至 18 μL。然后，加入2 μL FBS（终浓度为10%，v/v）混合均匀，并在37 ℃下孵育 0、2、4、8、12 和 24 小时。上样样品通过将 10 μL反应溶液与 10 μL 2×上样缓冲液混合制备，通过 10% 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳对其稳定性进行评估；

生物兼容性评估： HeLa 细胞以每孔5×10³个细胞浓度接种在 96 孔板中，然后在含有5% CO₂加湿培养箱中37 ºC孵育过夜。接着，去除原始培养基并重新悬浮在含有DNA酶步行器探针（0、2 或 5 nM）的新培养基中继续在培养箱中孵育6、12、18 或 24 小时。之后，将 100 μL 0.5 mg/mL 的MTT 溶液（PBS溶解，pH =8.0））添加到每个孔中。在 37 ºC下孵育4小时后，小心去除含 MTT 的培养基，然后加入 200 µL 二甲基亚砜（DMSO）以溶解甲臜晶体。最后，使用酶标仪通过测量 492 nm 处的吸光度来测试细胞活力。

如图4C所示，即使DNA酶步行器在10% FBS溶液中运行24 小时，也未检测到DNA酶步行器的实质性降解，这表明DNA酶步行器具有很好的稳定向，能够抵抗内源性核酸酶的降解。图4D表明了DNA酶步行器的细胞毒性可以忽略不计，这通过使用 HeLa 细胞作为模型细胞的MTT测定证实。 MTT减少成为甲臜是细胞活力的指示性标志物，490 nm 处的相应吸光度值可靠地反映了活细胞的数量。从图中可以观察到，当增加DNA酶步行器浓度从0到5 nM，即使孵育24 h，HeLa 细胞也能保持 90% 以上的活力，证明了DNA酶步行器良好的生物相容性。

实施例7 自保护的DNA酶步行器用于检测不同细胞系之间 miRNA 表达水平的差异

使用实施例1的方法构建了自保护的DNA酶步行器，通过将DNA酶步行器与不同miRNA表达水平的细胞进行孵育，最后使用激光共聚焦显微镜对细胞进行成像，使用成像图片来对细胞内miRNA水平进行分析。具体步骤如下：

为了研究miRNA-21在不同细胞中的表达水平，将L02细胞、HeLa细胞和MCF-7细胞置于37℃、体积分数5％CO₂及95%相对湿度的二氧化碳细胞培养箱内培养。然后，将细胞与2nM DNA酶步行器材料在37°C下孵育 8 小时，然后使用DEPC-PBS 洗涤3次。随后，将所得细胞与2.5 ng/mL 的Hoechst 33342细胞核染料孵育15分钟，然后再次用DEPC-PBS洗涤。最后，在 Leica SP8 激光扫描共聚焦显微镜上进行细胞成像。Hoechst 染料在405 nm 激光线处激发和FAM荧光信号在488 nm激发的绿色通道中记录。

图5为自保护的DNA酶步行器用于检测不同细胞系之间 miRNA 表达水平的差异验证。为了测试这一点，根据之前的研究，L02、HeLa 和 MCF-7 细胞分别具有低、中和高水平的 miRNA-21表达水平。如图5所示，MCF-7细胞图像中的绿色FAM荧光强于HeLa细胞，而L02细胞图像中未观察到明显的绿色荧光。荧光信号的趋势，MCF-7 > HeLa > L02。实验结果表明，无论细胞类型如何，DNA酶步行器都可以轻松进入活细胞，并准确感知目标miRNA的不同表达水平，从而能够从健康细胞中分化出病变细胞，例如肿瘤细胞。

实施例8 通用型自保护DNA酶步行器的构建

通过改变Mg²⁺依赖的DNA酶探针的序列，参照实施例1的方法构建自保护的DNA酶步行器，使用激光共聚焦显微镜对所构建的DNA酶步行器检测性能进行检测，检测了活细胞（MCF-7，人乳腺癌细胞）内miRNA-Let-7a的表达情况。所使用的DNA探针如下：

所述Mg²⁺依赖的DNA酶探针为：5’- CTACGTGTCTCTTCTCCGAGCCTACTACCTCAA

AAAACTATACAACCGGTCGAAATAGTGCAT-3’；

所述miRNA-Let-7a序列为：5’-UGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUU-3’；

图6A为针对检测miRNA-Let-7a这一目标设计的DNA酶步行器序列，其硫醇化底物探针不变，Mg²⁺依赖的DNA酶探针改变了miRNA识别区域为miRNA-Let-7a识别。图6B为使用新构建的DNA酶步行器对细胞内miRNA-Let-7a进行检测的激光共聚焦成像图，可以看出新构建的DNA酶步行器可以有效的对细胞内的miRNA-Let-7a进行检测，证明本发明提供的自保护DNA酶步行器具有较好的通用性和应用潜力。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 福州大学

<120> 一种自保护DNA酶步行器的构建方法及其在活细胞miRNA检测中的应用

<130> 9

<160> 9

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

atgcactatr aggaagagac acgtagtttt tttttt 36

<210> 2

<211> 63

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

ctacgtgtct cttctccgag cctgataagc taaaatcaac atcagtcggt cgaaatagtg 60

cat 63

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

tagcttatca gactgatgtt ga 22

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

taacactgtc tggtaaagat gg 22

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

taatactgcc tggtaatgat ga 22

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

taatactgtc tggtaaaacc gt 22

<210> 7

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

agaggtagta ggttgcatag tt 22

<210> 8

<211> 63

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

ctacgtgtct cttctccgag cctactacct caaaaaacta tacaaccggt cgaaatagtg 60

cat 63

<210> 9

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 9

ugagguagua gguuguauag uu 22

Claims

1.一种自保护DNA酶步行器，其特征在于：所述DNA酶步行器包括纳米金、硫醇化底物探针和Mg²⁺依赖的DNA酶探针；

所述硫醇化底物探针为：5’-/FAM/ATGCACTATrAGGAAGAGACACGTAGTTTTTTTTTT-SH-3’；

所述Mg²⁺依赖的DNA酶探针为：5’-CTACGTGTCTCTTCTCCGAGCCTGATAAGCTAAAATCAACATCAGTCGGTCGAAATAGTGCAT-3’。

2.权利要求1所述自保护DNA酶步行器的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）通过柠檬酸钠还原法制备直径为13nm的纳米金颗粒AuNP；

（2）在19.5 µL 500 mM pH 5.2 Tris-Ac buffer中将0.5µL 10 mM三(2-羧乙基)膦与30 µL 100 µM 硫醇化底物链探针混合，在室温下孵育1小时对巯基进行还原；

（3）往还原处理的硫醇化底物链溶液中加入3 µL 100 µM Mg²⁺依赖的DNA酶探针，然后在37 °C下孵育3小时以进行完全杂交；然后，将得到的混合物加入到含有1 mL 10 nM AuNP溶液的干净玻璃小瓶中，玻璃小瓶在黑暗中摇晃孵育16小时，孵育时间到达后，在摇动的状态下逐滴加入10.3 µL 500 mM 高压灭菌的pH 8.2 Tris-Ac buffer，使得Tris-Ac的最终浓度为5 mM，在摇动的状态下滴加300 µL 1 M NaCl溶液，所得溶液在室温下避光轻轻摇动储存至少24小时；最后，将最终溶液进行离心，沉淀物用200 µL高压灭菌的pH 8.2 Tris-Acbuffer洗涤3次，沉淀物最终溶解在pH 8.2 Tris-Ac buffer中，将所得 DNA酶步行器溶液避光储存在4°C。

3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于：步骤（3）中Mg²⁺依赖的DNA酶探针与硫醇化底物探针的摩尔比为1:10。

4.权利要求1所述自保护DNA酶步行器在检测活细胞内miRNA中的应用。

5.一种由权利要求1所述自保护DNA酶步行器改造而来的通用DNA酶步行器，其特征在于：所述通用DNA酶步行器为针对检测目标改变Mg²⁺依赖的DNA酶探针的序列所得。

6.根据权利要求5所述的通用DNA酶步行器，其特征在于：所述通用DNA酶步行器为针对miRNA-Let-7a检测目标改变Mg²⁺依赖的DNA酶探针的序列所得；改变后的Mg²⁺依赖的DNA酶探针序列为：5’-CTACGTGTCTCTTCTCCGAGCCTACTACCTCAAA

AAACTATACAACCGGTCGAAATAGTGCAT-3’。

7.权利要求5所述通用DNA酶步行器在检测活细胞内miRNA中的应用。

8.一种包含权利要求1所述自保护DNA酶步行器的生物传感器。

9.一种包含权利要求5所述通用DNA步行器的生物传感器。