JP2006340684A - 微生物の計測方法 - Google Patents
微生物の計測方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2006340684A JP2006340684A JP2005170881A JP2005170881A JP2006340684A JP 2006340684 A JP2006340684 A JP 2006340684A JP 2005170881 A JP2005170881 A JP 2005170881A JP 2005170881 A JP2005170881 A JP 2005170881A JP 2006340684 A JP2006340684 A JP 2006340684A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- reagent
- sample
- red
- group
- microorganism
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Images
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
【解決手段】 試料に第一の試薬を接触させ、上記第一の試薬によって上記試料中の検出対象としている微生物を蛍光染色し、上記試料に第二の試薬を接触させ、上記第二の試薬によって上記試料中の検出対象としている微生物以外の物質を染色し、上記試料に上記第一の試薬を励起する波長の光を照射し、上記第一の試薬の蛍光波長で蛍光を発している輝点を検出し、検出した輝点の情報から微生物の有無や数を求めることを含み、上記第一の試薬が、蛍光を発する試料を含み、溶媒に溶解し、上記第二の試薬が、上記第一の試薬の蛍光を吸収し、上記試料を含む溶媒に溶解し、かつ上記試料中で負に解離する基を有するようにした。
【選択図】 図1
Description
4’,6−Diamidino−2−phenylindole dihydrochlorideを用いて、微生物の種類によらず、生死に関わらず全ての微生物の遺伝子を染色し、検出する。
Propidium iodideを用いて、微生物の種類によらず、死んだ微生物を蛍光染色し、検出する。
微生物に含まれる酵素で分解されると蛍光を発するCarboxyfluorescein diacetate(以下、CFDAと略す)を用いて、酵素活性を持っている微生物を蛍光染色し、検出する。
呼吸活性によって蛍光化する5−cyano−2,3−ditolyl tetrazolium chloride を用いて、呼吸活性を持っている微生物を蛍光染色し、検出する。
微生物細胞中のDNAやRNAを染色し、検出する方法である。予め、検出対象となる微生物が有する固有の配列に対して、相補的に結合する遺伝子断片(プローブという)を用意し、そのプローブを蛍光色素で標識しておく。この標識プローブを試料に加えることにより、目的の遺伝子、すなわち、目的の微生物を特異的に蛍光染色し、検出する。
微生物が有する抗原を染色し、検出する方法である。予め、検出対象となる微生物が有する固有の抗原に対して、特異的に結合する抗体を用意し、その抗体を蛍光色素で標識しておく。この標識抗体を試料に加えることにより、目的の抗原、すなわち、目的の微生物を特異的に蛍光染色し、検出する。
ところが、これらの手法を食品など実際の試料に適用するには、まだ大きな問題がある。それは、検出したい微生物以外の物質(以下「夾雑物」と呼ぶ)が、非特異的に試薬によって染色されてしまうことである。非特異的な染色が起こると、検出の際、微生物と夾雑物とが同じ波長の蛍光を発する。微生物と夾雑物との識別は、蛍光輝点のサイズや形状、シグナル強度などを利用すれば、ある程度可能であるが、生物性の夾雑物が多く含まれる試料(食品など)では、実用的なレベルまで微生物と夾雑物を識別するのは困難なことが多い。例えば、惣菜の衛生規範では生菌数で10万個/gが出荷の良否判定の基準となっているが、夾雑物の影響を排して、このレベルまで微生物の検出下限を下げることは難しい。
多重染色を用いる先行技術としては、例えば、以下のa〜cが挙げられる。
生細胞を蛍光発光させる試薬としてFluorescein diacetateを用い、生細胞から漏れるFluoresceinの蛍光を消光するためにHemoglobinを用いている。試料をこれらの試薬で二重染色し、染色した試料に対して励起光を照射することにより、Fluorescein diacetateで染色された生細胞が発する蛍光発光の強度を蛍光顕微鏡に接続したフォトマルチプライヤーで検出して、蛍光発光強度から生細胞数を算出する方法が記載されている。
試料に、生細胞のみに蓄積される蛍光染料と、死細胞に浸透できるが生細胞には排除される消光染料とを添加し、試料の蛍光強度を計測することで生細胞数を計測する方法が記載されている。
具体的には、蛍光染料としてFluorescein diacetateを用い消光染料としてEosin Yを用いる事例と、蛍光染料としてCalcein−AMを用い消光染料としてTrypan Blueを用いる事例とが挙げられている。
細胞を含む試料に色素または蛍光性酵素基質を添加して、色素または蛍光を検出又は測定する生細胞の検出方法において、細胞膜を透過できず、かつ、上記色素または蛍光性酵素基質の発光を吸収する吸収体の存在下で検出または測定を行うことを特徴とする方法が記載されている。
具体的には、土壌の懸濁液に、蛍光性酵素基質Carboxyfluorescein diacetate acetoxymethyl ester添加して生細胞を蛍光染色し、生細胞以外の夾雑物が発する非特異的蛍光をCytochrome cで吸収する実施例が紹介されている。
上記第一の試薬が、蛍光を発し、上記試料を含む溶媒に溶解し、上記第二の試薬が、上記第一の試薬の蛍光を吸収し、上記試料を含む溶媒に溶解し、かつ上記試料中で負に解離する基を有することを特徴とする。また、ここで第二の試薬は、脂溶性を有し、かつ分子量は小さいことが好適である。
ら選択される少なくとも一の試薬を用い、上記第二の試薬として、赤色504号、赤色503号、赤色102号、赤色502号、赤色2号、赤色201号、赤色202号、赤色401号、および赤色227号からなる群から選択される少なくとも一の試薬を用いることを特徴とする。
生きている微生物は、水中では、カルボキシル基などの解離によって細胞表面が負に帯電し、負電荷を帯びた粒子として存在している。このため、負の電荷をもつ物質は、電気的反発のため、生きている微生物に接触しにくい。染色試薬として負の電荷を持つ試薬を使うと、試薬が微生物に接触しにくく、生きている微生物を染色しない。
さらに死んだ微生物の染色を考慮すると、第二の試薬は、脂溶性を有し、かつ分子量は小さいことが好ましい。
本発明で用いる第一の試薬には、次の特性が求められる:
・目的の微生物を蛍光染色する。
・試料を含む溶媒に溶解する。
・第一の試薬の蛍光を吸収する。
・試料を含む溶媒に溶解する。
・試料中で負に解離する基を有する。
また、第二の試薬は、次の特性を持つことが好ましい:
・脂溶性基を有する。
・分子量が小さい。
表2は、第一の試薬の蛍光波長帯域と第二の試薬の吸収波長帯域が、概ね430〜490nmの試薬のグループである。
表3は、第一の試薬の蛍光波長帯域と第二の試薬の吸収波長帯域が、概ね500〜530nmの試薬のグループである。
表4は、第一の試薬の蛍光波長帯域と第二の試薬の吸収波長帯域が、概ね560〜580nmの試薬のグループである。
表5は、第一の試薬の蛍光波長帯域と第二の試薬の吸収波長帯域が、概ね600〜650nmの試薬のグループである。
表6は、第一の試薬の蛍光波長帯域と第二の試薬の吸収波長帯域が、概ね710〜720nmの試薬のグループである。
図1に示した微生物の計測手順を参照しながら、本発明の計測の流れを説明する。
本発明の方法では、まず、試料1に対して、ストマックや試薬処理、遠心分離、ろ過など、微生物と微生物以外の物質(夾雑物)を分離する処理を行う(ステップ2)。つづいて、第一の試薬を接触させる(ステップ3)。第一の試薬は、微生物および残留している夾雑物を蛍光染色する。次に、試料に第二の試薬を接触させる(ステップ4)。第二の試薬は、夾雑物をマスク染色する。
以下、本発明の微生物の方法でポテトサラダを計測した例を紹介する。説明中で特にことわらない限り、実験備品は滅菌済みのものを使用した。
ポテトサラダに純粋培養したシュードモナス菌を適当量加え、模擬的に細菌で汚染された試料とした。
まず、試料であるポテトサラダを10g秤量し、90mLの滅菌水を加えてストマックを行なった。使用したストマック袋にはメッシュフィルタが備わっており、ストマック液を採取する際、大きなゴミは分離できるようになっている。
ストマック液1mLをマイクロチューブに採取し、そこに20%のTrypsin水溶液250μLと、10%のPolyoxyethylene(10) octylphenyl ether水溶液20μLを加えた。その試料液をボルテックスミキサーで攪拌し、42℃の恒温水槽に1分間浸した。
つづいて、試料液を1万回転で3分間遠心分離し、上澄みを取り除いた。
遠心分離で得られたペレットに、900μLのりん酸生理食塩水を加え、攪拌を行って、ペレットを分散させた。その試料液に、20%のTrypsin水溶液250μLと、10%のPolyoxyethylene(10) octylphenyl ether水溶液20μLを加えた。その試料液をボルテックスミキサーで攪拌し、42℃の恒温水槽に1分間浸した。
つづいて、試料液全量をメンブレンフィルタでろ過し、検出対象となる微生物をメンブレンフィルタ上に捕捉した。メンブレンフィルタとしては、ワットマン製のポリカーボネートブラックメンブレン、ポアサイズ0.4μm、直径25mmを使用した。
あらかじめ、CFDAを1〜10mg/mLでDMSOに溶解した蛍光染色原液を用意した。その蛍光染色原液をりん酸緩衝液に混合し、蛍光染色液とした。蛍光染色液をメンブレンフィルタ上に滴下し、1〜5分間静置した後、ろ過によって蛍光染色液を吸引除去した。
次に、赤色102号を含むマスク液を用意した。マスク液をメンブレンフィルタ上に滴下し、1〜5分間静置した後、ろ過によって蛍光染色液を吸引除去した。
ろ過器のファンネルを取り外し、メンブレンフィルタをピンセットでとって、スライドガラスにのせた。これらの操作中は、手指などがメンブレンフィルタの集菌面に触れないように注意し、手指などが集菌面に触れた場合は、全ての操作をやり直した。
メンブレンフィルタは、蛍光顕微鏡と自動分析装置によって観察を行った。
図2において、左側は蛍光顕微鏡によってCFDA蛍光染色後(マスク染色前)の試料を観察した画像、右側はマスク染色後の試料を観察した画像である。マスク染色前の画像では、細菌(シュードモナス菌)と夾雑物との識別は困難である。それに対して、マスク染色後の画像では、夾雑物はマスク試薬によって細菌(緑色)と異なる色(赤色)に染め分けられており、両者は明瞭に識別できる。
図3は、実施例1と同様の操作で、タマネギ細切りにエンテロバクターを添加し、本発明の方法で微生物を測定した結果である。本実施例では、微生物の検出に自動検出装置を用いており、自動検出装置の測定結果を縦軸に、従来からの培養法の測定結果を横軸にとり、両者の相関をグラフ化した図である。先行技術で挙げたような従来の迅速検査法では、培養法による検出菌数が10〜100万個/g程度より下になると、細菌と夾雑物との識別が困難であった(図には示していない)。それに対して、本発明を用いれば、細菌の定量下限が1万個/g以下まで到達していることが図3から読み取れる。
先行技術bに紹介されている Trypan Blue は、生乳中に含まれる夾雑物のマスク染色には有効であることが本発明者によって確認されている。しかしながら、上述のような惣菜試料に適用したところ、夾雑物をマスクする力が弱く、微生物の検出感度を下げることはできなかった。
Claims (7)
- 試料に第一の試薬を接触させ、
上記第一の試薬によって上記試料中の検出対象としている微生物を蛍光染色し、
上記試料に第二の試薬を接触させ、
上記第二の試薬によって上記試料中の検出対象としている微生物以外の物質を染色し、
上記試料に上記第一の試薬を励起する波長の光を照射し、
上記第一の試薬の蛍光波長で蛍光を発している輝点を検出し、
検出した輝点の情報から微生物の有無や数を求めることを含み、
上記第一の試薬が、蛍光を発し、上記試料を含む溶媒に溶解し、
上記第二の試薬が、上記第一の試薬の蛍光を吸収し、上記試料を含む溶媒に溶解し、かつ上記試料中で負に解離する基を有することを
特徴とする微生物の計測方法。 - 上記第一の試薬として、Coumarinおよびその誘導体、並びにCascade Blueからなる群から選択される試薬を用い、上記第二の試薬として、黄色407号、緑色204号、黄色402号、黄色203号、褐色201号、および黄色403号の(1)からなる群から選択される少なくとも一の試薬を用いることを特徴とする請求項1記載の微生物の計測方法。
- 上記第一の試薬として、4’,6−Diamidino−2−phenylindole、Amino−Methoxycoumarin−Acetic−acid、Amino−Chloro−Methoxyacridine、Hoechst 33258、Hoechst 33342、POPO−1、およびBOBO−1からなる群から選択される少なくとも一の試薬を用い、
上記第二の試薬として、黄色406号、だいだい色402号、だいだい色205号、および赤色203号からなる群から選択される少なくとも一の試薬を用いることを特徴とする請求項1記載の微生物の計測方法。 - 上記第一の試薬として、Fluoresceinおよびその誘導体、Acridine orange 、YOYO−1、TO−PRO−1、TOTO−1、Calcein−AM、SYBR Green I、SYBR GreenII、並
びにRhodamine 123 からなる群から選択される少なくとも一の試薬を用い、上記第二の試薬として、赤色504号、赤色503号、赤色102号、赤色502号、赤色2号、赤色201号、赤色202号、赤色401号、および赤色227号からなる群から選択される少なくとも一の試薬を用いることを特徴とする請求項1記載の微生物の計測方法。 - 上記第一の試薬として、2−hydroxy−3−naphtoic acid−2’、Cy3、Chromomycin A3、Mithramycin、Tetramethylrhodamine isothiocyanate、および5(6)−carboxytetramethyl−rhodamine−N−hydroxysuccinimide−esterからなる群から選択される少なくとも一の試薬を用い、上記第二の試薬として紫色401号を用いることを特徴とする請求項1記載の微生物の計測方法。
- 上記第一の試薬として、5−cyano−2,3−ditolyl tetrazolium chloride、Ethidium bromide、Ethidium homodimer、Texas Red、Propidium iodide、およびNile Red からなる群から選択される少なくとも一の試薬を用い、上記第二の試薬として、青色2号、黒色401号、緑色402号、緑色3号、青色205号、青色1号、緑色205号、青色202号、青色203号、および緑色201号からなる群から選択される少なくとも一の試薬を用いることを特徴とする請求項1記載の微生物の計測方法。
- 上記第一の試薬としてLDS751を用い、上記第二の試薬として緑色401号を用いることを特徴とする請求項1記載の微生物の計測方法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2005170881A JP4911423B2 (ja) | 2005-06-10 | 2005-06-10 | 微生物の計測方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2005170881A JP4911423B2 (ja) | 2005-06-10 | 2005-06-10 | 微生物の計測方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2006340684A true JP2006340684A (ja) | 2006-12-21 |
JP4911423B2 JP4911423B2 (ja) | 2012-04-04 |
Family
ID=37638114
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2005170881A Expired - Fee Related JP4911423B2 (ja) | 2005-06-10 | 2005-06-10 | 微生物の計測方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JP4911423B2 (ja) |
Cited By (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2008201968A (ja) * | 2007-02-22 | 2008-09-04 | Asahi Kasei Pharma Kk | ロイコ色素の安定化方法 |
JP2011147404A (ja) * | 2010-01-22 | 2011-08-04 | Ihi Corp | 微生物検出方法 |
JP2011172509A (ja) * | 2010-02-24 | 2011-09-08 | Ihi Corp | 微生物検出方法 |
US8080423B2 (en) | 2004-08-05 | 2011-12-20 | Asahi Kasei Pharma Corporation | Reagent containing protease reaction promoter and/or colorant stabilizer |
JP2012503780A (ja) * | 2008-09-24 | 2012-02-09 | ストラウス ホールディングス インコーポレイテッド | 分析物を検出する方法 |
CN110672572A (zh) * | 2019-10-17 | 2020-01-10 | 厦门大学 | 一种SYBR Green衍生物及其在细胞线粒体DNA荧光成像中的应用 |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH07196930A (ja) * | 1993-07-12 | 1995-08-01 | Molecular Probes Inc | 環式置換−非対称シアニン染料 |
JP2002034594A (ja) * | 2000-07-24 | 2002-02-05 | National Institute Of Advanced Industrial & Technology | 生細胞の検出方法 |
-
2005
- 2005-06-10 JP JP2005170881A patent/JP4911423B2/ja not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH07196930A (ja) * | 1993-07-12 | 1995-08-01 | Molecular Probes Inc | 環式置換−非対称シアニン染料 |
JP2002034594A (ja) * | 2000-07-24 | 2002-02-05 | National Institute Of Advanced Industrial & Technology | 生細胞の検出方法 |
Cited By (9)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US8080423B2 (en) | 2004-08-05 | 2011-12-20 | Asahi Kasei Pharma Corporation | Reagent containing protease reaction promoter and/or colorant stabilizer |
JP2008201968A (ja) * | 2007-02-22 | 2008-09-04 | Asahi Kasei Pharma Kk | ロイコ色素の安定化方法 |
JP4697809B2 (ja) * | 2007-02-22 | 2011-06-08 | 旭化成ファーマ株式会社 | ロイコ色素の安定化方法 |
US8268017B2 (en) | 2007-02-22 | 2012-09-18 | Asahi Kasei Pharma Corporation | Method for stabilizing leuco-type colorant |
JP2012503780A (ja) * | 2008-09-24 | 2012-02-09 | ストラウス ホールディングス インコーポレイテッド | 分析物を検出する方法 |
JP2011147404A (ja) * | 2010-01-22 | 2011-08-04 | Ihi Corp | 微生物検出方法 |
JP2011172509A (ja) * | 2010-02-24 | 2011-09-08 | Ihi Corp | 微生物検出方法 |
CN110672572A (zh) * | 2019-10-17 | 2020-01-10 | 厦门大学 | 一种SYBR Green衍生物及其在细胞线粒体DNA荧光成像中的应用 |
CN110672572B (zh) * | 2019-10-17 | 2020-07-31 | 厦门大学 | 一种SYBR Green衍生物及其在细胞线粒体DNA荧光成像中的应用 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JP4911423B2 (ja) | 2012-04-04 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN102203588B (zh) | 利用光谱分离,表征和/或标识微生物的方法 | |
JP6186414B2 (ja) | 固体又は半固体培地上の微生物のキャラクタリゼーション方法 | |
US10612069B2 (en) | Methods for separation and characterization of microorganisms using identifier agents | |
CN102272585B (zh) | 采用拉曼光谱法分离、表征和/或鉴定微生物的方法 | |
CN102460172B (zh) | 用于抗微生物剂抗性测定的方法 | |
US20150118677A1 (en) | Sample preparation for flow cytometry | |
CN104379760B (zh) | 用于流式细胞术的样品制备 | |
RU2517618C2 (ru) | Способ и система для определения количества культивируемых клеток | |
EP2364356A1 (en) | Methods for detection, characterization and/or identification of microorganisms in a sealed container | |
JP4911423B2 (ja) | 微生物の計測方法 | |
CN112285083B (zh) | 一种细胞杀伤效力的评价方法 | |
EP3645734B1 (en) | A method for quantifying the cultivability of individual bacterial cells using culture independent parameters | |
ES2966679T3 (es) | Métodos y composiciones para mejorar la detección de microorganismos | |
JP2006174751A (ja) | 有芽胞細菌計量方法 | |
JP2003135094A (ja) | 新規の細菌分析方法 | |
JP2014223033A (ja) | 特定菌検出方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20080415 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20101207 |
|
A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20110207 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20110624 |
|
A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20110823 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20111226 |
|
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20120108 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20150127 Year of fee payment: 3 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |