JP2011172509A - 微生物検出方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】微生物検出方法が、試料中の微生物を検出する微生物検出方法であって、蛍光染色した微生物を含む試料に、微生物の輪郭を染色する微生物輪郭染色液を添加する微生物輪郭染色工程を具備する。
【選択図】図4
Description
また、下記特許文献2には、検出対象微生物を特異的に認識し、蛍光物質が結合した標識抗体による抗原抗体反応を用いて、試料に含まれる粒子の蛍光強度から該検出対象微生物を検出する微生物検出方法であって、上記粒子の前方散乱光強度、上記標識抗体による蛍光強度及び夾雑物に特有の蛍光強度を測定し、測定した光学的情報に基づいて、上記標識抗体が上記夾雑物に非特異結合した擬陽性を示す粒子を排除することによって検出対象微生物のみを検出し、該検出対象微生物を計数する微生物検出方法が開示されている。
これにより、蛍光染色した場合に、1匹の微生物の細胞内に点在する蛍光発色が存在したとしても、1匹毎の微生物を明確に認識することができる。そして、1匹毎の微生物を明確に認識することができることによって、微生物をより短時間かつ正確に検出/定量することが可能となる。上記3種類の微生物輪郭染色液は、いずれも蛍光色が異なるものの、1匹毎の微生物を明確に認識することができるという点においては同じある。
本実施形態に係る微生物検出方法における工程について説明する。
本実施形態に係る微生物検出方法は、FISH法を用いて微生物を検出する方法であり、微生物輪郭染色工程を備えている。
まず、第1の工程において、水を主成分とするレジオネラ菌lgを含む液体試料に、終濃度が4質量%になるようにパラホルムアルデヒド溶液を添加し、当該液体試料を4℃の温度の下で一晩保存することによってパラホルムアルデヒドに化学固定を行わせる。第1の工程では、この化学固定によって、液体試料中にレジオネラ菌lgの固定標本を作製する(ステップS1)。
そして、上記第1の工程が終了すると、次に、第2の工程において、第1の工程において作製した固定標本を含む液体試料を、図2に示すろ過装置10によって、ろ過することで、固定標本を取り出す。ろ過装置10は、図2に示すように、ガイドタワー1、ろ過器2及び吸引器3を備えている。
ろ過器2は、ガイドタワー1を介して導入された液体試料から固定標本をメンブレンフィルタ2a上に取り出す。
メンブレンフィルタ2aは、装着に必要な余白を含めた大きさの直径が25mmの円形であり、孔径が0.22μmであるポリカーボネート製のフィルタである。このメンブレンフィルタ2aの中心部の直径16mmの円形領域がろ過に使用される。
そして、上記第2の工程が終了すると、次に、第3の工程において、シャーレに、FITC(fluorescein isothiocyanate)によって標識したプローブ(レジオネラ菌用DNAプローブ)と、ハイブリダイゼーションバッファとを「1:9」の割合で混合したプローブ溶液を作製し、レジオネラ菌が付着したメンブレンフィルタ2aから切り取った扇形のフィルタ部分(菌サンプル2b)をピンセットによってプローブ溶液に浸し、46℃の温度下で約2時間保存することで、レジオネラ菌の固定標本にプローブを結合させる(ステップS3)。
上記ハイブリダイゼーションバッファの構成は、NaClが0.9質量%、Tris‐Clが20mM、formamideが35質量%、Blocking reagentが2質量%、SDS(Sodium Dodecyl sulphate:界面活性剤)が0.02質量%である。
そして、上記第3の工程が終了すると、次に、第4の工程において、50mlの遠沈管にウォッシングバッファを入れ、遠沈管のウォッシングバッファに第3の工程において約2時間プローブ溶液に反応させた扇形の菌サンプル2bを浸し、48℃の温度下で、ウォッシングバッファに菌サンプル2bを15分浸した状態にすることによって、菌サンプル2b上の未反応のプローブを洗浄する(ステップS4)。
上記ウォッシングバッファの構成は、Tris−Clが20mM、NaClが80mM、EDTA(ethylenediaminetetraacetic acid)が5mM、SDSが0.01質量%である。ウォッシングバッファでは、未反応のプローブが自然拡散によって、菌サンプル2bから剥がれ落ちる。
そして、上記第4の工程が終了すると、次に、第5の工程において、ウォッシングバッファによって洗浄された扇形の菌サンプル2bを、99.5質量%のエタノールに浸すことによって、菌サンプル2bを1分間脱水し、その後に常温の空気中で乾燥させる(ステップS5)。
そして、上記第5の工程が終了すると、次に、第6の工程(微生物輪郭染色工程)において、親油性スリチル色素であるN-(3-triethylammoniumpropyl)-4-(6-(4-(diethylamino)phenyl)hexatrienyl)pyridinium dibromide(親油性蛍光色素)の原液を、HBSS(Mg-free Hanks balanced salt solution)溶液によって1/200に希釈し、HBSS溶液によって希釈したものをCITIFLUOR溶液(退色防止剤)のみまたはCITIFLUOR溶液とベクターシールド(他の退色防止剤)の混合溶液によって、1/10〜1/1000に希釈した溶液である微生物輪郭染色液を作製する。すなわち、N-(3-triethylammoniumpropyl)-4-(6-(4-(diethylamino)phenyl)hexatrienyl)pyridinium dibromideの濃度が25ng/ml〜2.5μg/mlである微生物輪郭染色液を作製する。
そして、上記微生物輪郭染色工程が終了すると、次に、第7の工程において、蛍光顕微鏡を用いて試料中のレジオネラ菌lgを検出する(ステップS7)。すなわち、菌サンプル2bが載ったスライドガラス11を蛍光顕微鏡に装着し、波長495nmの青色の励起光をスライドガラス11上の試料に照射することにより、プローブが結合したレジオネラ菌を波長520nmの緑色光として蛍光させる。
上述したように、この解析では、レジオネラ菌lgの細胞膜が赤色に染色されることで輪郭が明確になるために、レジオネラ菌lgの細胞膜を染色しない試料に比べて、カラー画像におけるレジオネラ菌lgの検出が容易になった。
(1)上記実施形態では、FISH法によって検出対象微生物を染色したが、本発明はこれに限定されない。
例えば、核酸染色法及び抗体染色法等のFISH法以外の蛍光染色法によって検出対象微生物を染色するようにしてもよい。
(2)上記実施形態において、微生物輪郭染色液は、親油性スリチル色素であるN-(3-triethylammoniumpropyl)-4-(6-(4-(diethylamino)phenyl)hexatrienyl)pyridinium dibromideを希釈した溶液であるが、本発明はこれに限定されない。
例えば、夾雑物蛍光色変異液として、親油性カルボシアニン色素である3,3'-dioctadecyl-5,5'-di(4-sulfophenyl)oxacarbocyanine,sodium salt、または親油性ナイルレッドである9-(Diethylamino)-5H-benzo[a]phenoxazin-5-oneを希釈した溶液を用いてもよい。上記の微生物輪郭染色液は、蛍光色が異なるものの、1匹毎の微生物を明確に認識することができるという点においては同じある。
Claims (6)
- 試料中の微生物を検出する微生物検出方法であって、
蛍光染色した微生物を含む試料に、前記微生物の輪郭を染色する微生物輪郭染色液を添加する微生物輪郭染色工程を具備することを特徴とする微生物検出方法。 - 前記微生物輪郭染色液は、親油性蛍光色素を希釈した溶液であることを特徴とする請求項1に記載の微生物検出方法。
- 前記親油性蛍光色素は、親油性スリチル色素、親油性カルボシアニン色素または親油性ナイルレッドであることを特徴とすることを特徴とする請求項2に記載の微生物検出方法。
- 前記親油性蛍光色素は、前記親油性スリチル色素であるN-(3-triethylammoniumpropyl)-4-(6-(4-(diethylamino)phenyl)hexatrienyl)pyridinium dibromide、前記親油性カルボシアニン色素である3,3'-dioctadecyl-5,5'-di(4-sulfophenyl)oxacarbocyanine,sodium salt、または前記親油性ナイルレッドである9-(Diethylamino)-5H-benzo[a]phenoxazin-5-oneであることを特徴とする請求項3に記載の微生物検出方法。
- 前記微生物輪郭染色液は、前記親油性スリチル色素であるN-(3-triethylammoniumpropyl)-4-(6-(4-(diethylamino)phenyl)hexatrienyl)pyridinium dibromide、前記親油性カルボシアニン色素である3,3'-dioctadecyl-5,5'-di(4-sulfophenyl)oxacarbocyanine,sodium salt、または前記親油性ナイルレッドである9-(Diethylamino)-5H-benzo[a]phenoxazin-5-oneを25ng/ml〜2.5μg/mlの濃度にしたものであることを特徴とする請求項4に記載の微生物検出方法。
- FISH(fluorescence in situ hybridization)法を使用することを特徴とする請求項1〜5のいずれかに記載の微生物検出方法。
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Citations (11)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2001252093A (ja) * | 2000-03-15 | 2001-09-18 | Japan Organo Co Ltd | 細菌の検出方法および検出装置 |
JP2001258590A (ja) * | 2000-03-22 | 2001-09-25 | Sysmex Corp | 細菌の染色方法及び検出方法 |
JP2003527604A (ja) * | 2000-03-10 | 2003-09-16 | ワシントン・ユニバーシティ | 個々の細胞の標識方法 |
JP2005519625A (ja) * | 2002-03-13 | 2005-07-07 | キュー3ディーエム エルエルシー | 細胞内区画の分画局在強度の測定のための自動化呈色セグメント化および最小有意応答のためのシステムおよび方法 |
JP2006503119A (ja) * | 2002-06-06 | 2006-01-26 | ウェストマン,ガンナー | 選択的発色団 |
JP2006509514A (ja) * | 2002-12-17 | 2006-03-23 | ヘンケル・コマンディットゲゼルシャフト・アウフ・アクチエン | 細菌を同定するための方法および装置 |
JP2006340684A (ja) * | 2005-06-10 | 2006-12-21 | Fuji Electric Holdings Co Ltd | 微生物の計測方法 |
JP2007178193A (ja) * | 2005-12-27 | 2007-07-12 | Srl Inc | 浮遊細胞の検査方法 |
JP2008029294A (ja) * | 2006-07-31 | 2008-02-14 | Ihi Corp | メタノサルシナ等の微生物の検出方法及びその装置 |
JP2008507983A (ja) * | 2004-07-30 | 2008-03-21 | プロメガ コーポレイション | タンパク質およびその基質への、共有結合による機能性基の係留 |
JP2009109217A (ja) * | 2007-10-26 | 2009-05-21 | Bridgestone Corp | ラテックス産出植物の乳管細胞を検出する方法 |
-
2010
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Patent Citations (11)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2003527604A (ja) * | 2000-03-10 | 2003-09-16 | ワシントン・ユニバーシティ | 個々の細胞の標識方法 |
JP2001252093A (ja) * | 2000-03-15 | 2001-09-18 | Japan Organo Co Ltd | 細菌の検出方法および検出装置 |
JP2001258590A (ja) * | 2000-03-22 | 2001-09-25 | Sysmex Corp | 細菌の染色方法及び検出方法 |
JP2005519625A (ja) * | 2002-03-13 | 2005-07-07 | キュー3ディーエム エルエルシー | 細胞内区画の分画局在強度の測定のための自動化呈色セグメント化および最小有意応答のためのシステムおよび方法 |
JP2006503119A (ja) * | 2002-06-06 | 2006-01-26 | ウェストマン,ガンナー | 選択的発色団 |
JP2006509514A (ja) * | 2002-12-17 | 2006-03-23 | ヘンケル・コマンディットゲゼルシャフト・アウフ・アクチエン | 細菌を同定するための方法および装置 |
JP2008507983A (ja) * | 2004-07-30 | 2008-03-21 | プロメガ コーポレイション | タンパク質およびその基質への、共有結合による機能性基の係留 |
JP2006340684A (ja) * | 2005-06-10 | 2006-12-21 | Fuji Electric Holdings Co Ltd | 微生物の計測方法 |
JP2007178193A (ja) * | 2005-12-27 | 2007-07-12 | Srl Inc | 浮遊細胞の検査方法 |
JP2008029294A (ja) * | 2006-07-31 | 2008-02-14 | Ihi Corp | メタノサルシナ等の微生物の検出方法及びその装置 |
JP2009109217A (ja) * | 2007-10-26 | 2009-05-21 | Bridgestone Corp | ラテックス産出植物の乳管細胞を検出する方法 |
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
JPN6014022462; 今堀、山川 監修: 生化学辞典 第3版, 19981120, p. 578-579 * |
JPN6015009027; 河崎: 蛋白質 核酸 酵素 Vol. 42, No. 7, 19970510, p. 1173-1176 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
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