JP2011004654A - 微生物検出方法 - Google Patents

Abstract

【課題】従来よりも容易に標本に対する正確なオートフォーカスを顕微鏡に実行させることができる微生物検出方法を提供することを目的とする。
【解決手段】微生物検出方法が、試料中の蛍光染色された微生物をオートフォーカス機能を有する顕微鏡によって検出する微生物検出方法であって、微生物と同等の高さを有する蛍光粒子を試料中に添加する蛍光粒子添加工程を具備する。
【選択図】図３

Description

本発明は、顕微鏡によって標本である微生物を検出する際に、当該微生物に対する正確なオートフォーカスを顕微鏡に実行させる微生物検出方法に関する。

現在、顕微鏡による微生物観察では、標的とする微生物を視覚的に識別し易くする方法として、蛍光染色法が用いられている。
この蛍光染色法には、生物の持つＤＮＡ（Deoxyribonucleic acid）やＲＮＡ（Ribonucleic acid）を蛍光染色することによって生物のみを染色するＤＡＰＩ（4',6-Diamidine-2'-phenylindole dihydrochloride）染色法やアクリジンオレンジ染色法、特定微生物を核酸の配列から染め分けるＦＩＳＨ（fluorescence in situ hybridization）法、蛍光染色された抗体を用いる方法、蛍光染色されたファージを用いる方法等の多くの方法が存在する。

例えば、ＦＩＳＨ法では、標的とする微生物の核酸、多くの場合においてｒＲＮＡ（ribosome Ribonucleic acid）の配列に相補的なオリゴヌクレオチドに蛍光色素を共有結合することで生成したプローブを、オリゴヌクレオチドの適切な反応条件下で、標的微生物の相補的な核酸配列にのみ結合させることで、当該相補的な核酸配列を有する標的微生物の選択的染色が可能になる。

そして、上記蛍光染色法によって蛍光染色した標的微生物に対して蛍光顕微鏡が励起光を照射すると、当該微生物が蛍光を発する為、観察者が蛍光顕微鏡が撮像した画像を直視、または当該画像を画像解析することで、標的微生物を検出することができる。その際、蛍光顕微鏡は、一般的に、オートフォーカス機能によって、焦点を定める。オートフォーカス機能とは、画像に含まれるコントラストを算出し、当該コントラストが最大になる位置を焦点として定めるものである。

このような顕微鏡のオートフォーカス機能に関する発明として、下記特許文献１には、オートフォーカスによって認識できるような模様をスライドガラスに設ける、あるいはメンブレンフィルタによってろ過する液体標本の場合には、ろ過に用いるメンブレンフィルタに模様を設け、上記模様を用いてオートフォーカスすることによって、焦点を標本へ合わせることができる蛍光画像計測方法が開示されている。

国際公開第０３／０６７２３０号パンフレット

ところで、上記従来技術では、蛍光顕微鏡による標的微生物の観察時に、蛍光顕微鏡は、オートフォーカス機能によって、焦点を標的微生物へ合わせている。しかしながら、蛍光染色法によって蛍光染色した標的微生物を、蛍光顕微鏡によって観察した場合に、標的微生物が発光する蛍光が十分ではない為に、オートフォーカス機能によって、標的微生物のコントラストが最大になる位置に焦点を合わせることができないことがあった。その為、蛍光顕微鏡が撮像した画像に存在する標的微生物がぼやけていることがあった。
また、上記特許文献１では、スライドガラスまたはメンブレンフィルタに模様を設けることで、顕微鏡にオートフォーカス機能によって焦点を標本へ合わさせているが、スライドガラス及びメンブレンフィルタのような小さいものに模様を設ける作業は、集中力を必要とする作業であり、観察者に大きな負担を強いることになる。

本発明は、上述した事情に鑑みてなされたものであり、従来よりも容易に標本に対する正確なオートフォーカスを顕微鏡に実行させることができる微生物検出方法を提供することを目的とする。

上記目的を達成するために、本発明では、微生物検出方法に係る第１の解決手段として、試料中の蛍光染色された微生物をオートフォーカス機能を有する顕微鏡によって検出する微生物検出方法であって、前記微生物と同等の高さを有する蛍光粒子を前記試料中に添加する蛍光粒子添加工程を具備するという手段を採用する。

本発明では、微生物検出方法に係る第２の解決手段として、上記第１の解決手段において、前記蛍光粒子添加工程において、前記微生物の幅と同等の幅を有する蛍光粒子を前記試料中に添加するという手段を採用する。

本発明では、微生物検出方法に係る第３の解決手段として、上記第１または第２の解決手段において、前記蛍光粒子添加工程において、前記微生物と形態的に異なる蛍光粒子を前記試料中に添加するという手段を採用する。

本発明では、微生物検出方法に係る第４の解決手段として、上記第１〜第３いずれかの解決手段において、前記蛍光粒子添加工程において、前記微生物の蛍光波長と異なる蛍光波長を発する蛍光粒子を前記試料中に添加するという手段を採用する。

本発明では、微生物検出方法に係る第５の解決手段として、上記第１〜第３いずれかの解決手段において、前記微生物と前記蛍光粒子とが同等の波長で蛍光する場合には、前記試料中に蛍光変化色素を添加することにより前記蛍光粒子の蛍光波長を変化させるという手段を採用する。

本発明では、微生物検出方法に係る第６の解決手段として、上記第１〜第５いずれかの解決手段において、前記蛍光粒子は、蛍光ビーズであるという手段を採用する。

本発明によれば、試料中の蛍光染色された微生物をオートフォーカス機能を有する顕微鏡によって検出する微生物検出方法であって、微生物と同等の高さを有する蛍光粒子を試料中に添加する蛍光粒子添加工程を具備する。
このように、本発明では、蛍光粒子を微生物が含まれる試料に添加することによって、顕微鏡によって微生物を観察する時に、顕微鏡が、微生物と同等の高さの蛍光粒子の蛍光によって、容易に微生物に対する正確なオートフォーカスを実行することができる。

本発明の一実施形態に係る微生物検出方法の第３の工程におけるろ過装置１０の部分斜視図である。 本発明の一実施形態に係る微生物検出方法の顕微鏡観察工程における蛍光顕微鏡２０の概略構成を示す模式図である。 本発明の一実施形態に係る微生物検出方法の顕微鏡観察工程のスライドガラス１１上のメンブレンフィルタ２ａ上の固定標本であるレジオネラ菌ｌｇと蛍光ビーズｆｂとを示す模式図である。

以下、図面を参照して、本発明の一実施形態について説明する。本実施形態は、標本としての微生物を検出する微生物検出方法に関する。

本実施形態に係る微生物検出方法における工程について、説明する。
本実施形態に係る微生物検出方法は、ＦＩＳＨ法を用いて微生物を検出する方法であり、蛍光粒子添加工程及び顕微鏡観察工程を備えている。
微生物検出方法における、上記蛍光粒子添加工程及び顕微鏡観察工程を含む各工程について、手順に沿って説明する。

まず、微生物検出方法では、第１の工程において、水を主成分とするレジオネラ菌ｌｇを含む液体試料に、終濃度が４％になるようにパラホルムアルデヒド溶液を添加し、当該液体試料を４℃の温度の下で一晩保存することによってパラホルムアルデヒドに化学固定を行わせる。そして、第１の工程では、この化学固定によって、液体試料中にレジオネラ菌ｌｇの固定標本を作製する。

そして、上記第１の工程が終了すると、次に、微生物検出方法の蛍光粒子添加工程において、第１の工程において作製した固定標本を含む液体試料に、レジオネラ菌ｌｇとほぼ同等の高さである直径１．５μｍの蛍光ビーズ（蛍光粒子）ｆｂを２０００００粒子添加する。

蛍光ビーズｆｂとは、一般的に、試料に含まれる微生物等を画像解析によって抽出する際に、蛍光及び大きさのキャリブレーションの基準色及び基準サイズとして用いられるものである。なお、本実施形態に係る微生物検出方法の上記蛍光粒子添加工程における蛍光ビーズｆｂは、波長４９５ｎｍの青色の励起光が照射されると、波長５２０ｎｍの緑色の蛍光を発光するものである。

そして、上記蛍光粒子添加工程が終了すると、次に、微生物検出方法の第３の工程において、蛍光粒子添加工程において蛍光ビーズｆｂを添加した固定標本を含む液体試料を、図１に示すろ過装置１０によって、ろ過することで、固定標本と共に蛍光ビーズｆｂを取り出す。図１は、本実施形態に係る微生物検出方法の第３の工程におけるろ過装置１０の部分斜視図である。第３の工程におけるろ過装置１０は、図１に示すように、ガイドタワー１、ろ過器２及び吸引器３を備えている。

ガイドタワー１は、ろ過器２に液体試料を導入する為の筒形状の流路であり、ろ過器２の上側に取り付けられている。
ろ過器２は、ガイドタワー１を介して導入された液体試料中の液体のみをメンブレンフィルタ２ａを通じて下側の吸引器３に通過させることで、メンブレンフィルタ２ａ上に固定標本及び蛍光ビーズｆｂを取り出すものである。

このろ過器２では、メンブレンフィルタ２ａが着脱可能になっており、ろ過毎にメンブレンフィルタ２ａを交換することが可能である。
メンブレンフィルタ２ａは、装着に必要な余白を含めた直径が２５ｍｍの円形であり、孔径が０．２２μｍであるポリカーボネート製のフィルタである。そして、このメンブレンフィルタ２ａの中心部の直径１６ｍｍの円形領域が、ろ過に使用される。

吸引器３は、ろ過器２のメンブレンフィルタ２ａ上の液体試料から液体のみを通過させる為に、メンブレンフィルタ２ａの下側から吸引を行う。吸引器３は、吸引ビンと、吸引ポンプとを備えており、吸引ポンプが吸引ビン内の空気を吸引することで、メンブレンフィルタ２ａを下側から吸引を行う。

そして、第３の工程では、上記構成のろ過装置１０によってレジオネラ菌ｌｇの固定標本及び蛍光ビーズｆｂをメンブレンフィルタ２ａ上に取り出した後に、ろ過器２からメンブレンフィルタ２ａを取り外す。そして、第３の工程では、取り外したメンブレンフィルタ２ａを、常温の空気中で乾燥させ、その後に９９．５％エタノールによって脱水し、さらに再度、常温の空気中で乾燥させる。

そして、上記第３の工程が終了すると、次に、微生物検出方法の第４の工程において、
シャーレに、ＦＩＴＣ（fluorescein isothiocyanate）によって標識したプローブ（レジオネラ菌用ＤＮＡプローブ）と、ハイブリダイゼーションバッファとを「１：９」の割合で混合したプローブ溶液を作製し、ピンセットによって、第３の工程においてレジオネラ菌ｌｇを捕集したメンブレンフィルタ２ａから一部切り取った扇形のメンブレンフィルタ２ａをプローブ溶液に浸し、４６℃の温度下で、約２時間保存することによって、レジオネラ菌ｌｇの固定標本にプローブを結合させる。
上記ハイブリダイゼーションバッファの構成は、ＮａＣｌが０．９％、Ｔｒｉｓ‐Ｃｌが２０ｍＭ、formamideが３５％、Ｂｌｏｃｋｉｎｇ ｒｅａｇｅｎｔが２％、ＳＤＳ（Sodium Dodecyl sulphate：界面活性剤）が０．０２％である。

そして、上記第４の工程が終了すると、次に、微生物検出方法の第５の工程において、５０ｍｌの遠沈管にウォッシングバッファを入れ、遠沈管のウォッシングバッファに第４の工程において約２時間プローブ溶液に反応させた扇形のメンブレンフィルタ２ａを浸し、４８℃の環境下で、ウォッシングバッファにメンブレンフィルタ２ａを１５分浸した状態にすることによって、メンブレンフィルタ２ａ上の未反応のプローブを洗浄する。
上記ウォッシングバッファの構成は、Ｔｒｉｓ−Ｃｌが２０ｍＭ、ＮａＣｌが８０ｍＭ、ＥＤＴＡ（ethylenediaminetetraacetic acid）が５ｍＭ、ＳＤＳが０．０１％である。ウォッシングバッファでは、未反応のプローブが自然拡散によって、メンブレンフィルタ２ａから剥がれ落ちる。

そして、上記第５の工程が終了すると、次に、微生物検出方法の第６の工程において、ウォッシングバッファによって洗浄された扇形のメンブレンフィルタ２ａを、９９．５％のエタノールに入れることによって、メンブレンフィルタ２ａを１分間脱水し、その後に常温の空気中で乾燥させる。

そして、上記第６の工程が終了すると、次に、微生物検出方法の第７の工程において、乾燥させた扇形のメンブレンフィルタ２ａをスライドガラス１１に載せ、メンブレンフィルタ２ａにベクターシールド（マウント液）を滴下し、その上に気泡がはいらないようカバーガラスを載せて、密着させる。

そして、上記第７の工程が終了すると、次に、微生物検出方法の顕微鏡観察工程において、蛍光顕微鏡２０にスライドガラス１１を取り付ける。
図２は、本実施形態に係る微生物検出方法の顕微鏡観察工程における蛍光顕微鏡２０の概略構成を示す模式図である。

蛍光顕微鏡２０には、図２に示すように、ステージ２１上に取り付けられたスライドガラス１１に対向して対物レンズ２２が配置されている。また、この対物レンズ２２を介した観察光軸上には、三眼鏡筒ユニット２３を介して接眼レンズユニット２４が配置されていると共に、結像レンズユニット２５を介して電子カメラ２６が配置されている。蛍光顕微鏡２０の電子カメラ２６は、図示しない顕微鏡用コンピュータに接続し、電子カメラ２６が撮像した画像は、顕微鏡用コンピュータの表示部に表示される。

そして、顕微鏡観察工程では、この蛍光顕微鏡２０に、波長４９５ｎｍの青色の励起光をスライドガラス１１上のメンブレンフィルタ２ａへ照射させることによって、メンブレンフィルタ２ａの標本であるレジオネラ菌ｌｇに結合したプローブと共に蛍光ビーズｆｂを、波長５２０ｎｍの緑色の蛍光を発光させる。

図３は、本実施形態に係る微生物検出方法の顕微鏡観察工程のスライドガラス１１上のメンブレンフィルタ２ａ上の固定標本であるレジオネラ菌ｌｇと蛍光ビーズｆｂとを示す模式図である。なお図３の（ａ）は、スライドガラス１１上のメンブレンフィルタ２ａ上の固定標本であるレジオネラ菌ｌｇと蛍光ビーズｆｂとを示す平面模式図であり、図３の（ｂ）は、スライドガラス１１上のメンブレンフィルタ２ａ上の固定標本であるレジオネラ菌ｌｇと蛍光ビーズｆｂとを示す側面模式図である。

そして、顕微鏡観察工程において、蛍光顕微鏡２０では、オートフォーカス機能で対物レンズ２２の位置を上下に移動することによって、焦点を調整する。その際に、蛍光顕微鏡２０は、レジオネラ菌ｌｇに結合したプローブの蛍光強度が微弱であったとしても、レジオネラ菌ｌｇとほぼ同等の高さの蛍光ビーズｆｂが発する蛍光によって、容易にレジオネラ菌ｌｇに対して焦点を合わすことができる。

蛍光粒子添加工程において、上記蛍光ビーズｆｂを、蛍光顕微鏡２０の全てに視野に１つ以上存在するように、蛍光顕微鏡２０の１つの視野の広さに応じて、濃度を設定する。これにより、顕微鏡観察工程では、蛍光顕微鏡２０が、あらゆる視野で、オートフォーカス機能によって、レジオネラ菌ｌｇに焦点を合わすことができる。

そして、標的微生物と蛍光ビーズｆｂとが大きさ及び形態的に区別が困難である場合には、蛍光粒子添加工程において、プローブの染色に用いた染色色素と異なる色の蛍光ビーズｆｂを用いた方がよいが、蛍光ビーズｆｂの大きさが一定で標的微生物と形態的に区別が可能な場合には、プローブの染色に用いた染色色素と同色の蛍光ビーズｆｂを用いてもよい。

また、蛍光粒子添加工程において、大きな粒径の蛍光ビーズｆｂを添加した場合、標的微生物の上に覆いかぶさることで微生物を認識することができなくなってしまう為、微生物の幅の短径と同等の幅を有する粒子を用いることによって、微生物が認識できなくなることを防ぐことができる。

さらに、蛍光ビーズｆｂと標的微生物とを色相の違いによって判別し易くする為に、励起光と蛍光との波長差(ストークスシフト)が大きく、かつ標的微生物の蛍光に励起されても微生物の蛍光より長波長の蛍光を発する蛍光ビーズｆｂを用いることが好ましい。
また、上記顕微鏡観察工程のように、レジオネラ菌ｌｇに結合したプローブと蛍光ビーズが同様な励起/蛍光波長特性を有する場合には、蛍光ビーズｆｂの励起/蛍光波長特性を変化させる為に、蛍光顕微鏡２０による観察前に、メンブレンフィルタ２ａに脂質膜染色試薬ＦＭ４‐６４（励起波長５４３ｎｍ、蛍光波長７３４ｎｍ）等の蛍光変化色素を添加することにより蛍光ビーズｆｂの蛍光波長を変化させて、プローブの蛍光と蛍光ビーズｆｂの蛍光とを識別し易くするようにしてもよい。

以上のように、本実施形態に係る微生物検出方法では、蛍光粒子添加工程において、蛍光ビーズｆｂを固定標本であるレジオネラ菌ｌｇが含まれる試料に添加することによって、顕微鏡観察工程において、蛍光顕微鏡によってレジオネラ菌ｌｇを観察する時に、レジオネラ菌ｌｇとほぼ同等の高さの蛍光ビーズｆｂの蛍光によって、容易に標本に対する正確なオートフォーカスを顕微鏡に実行させることができる。

以上、本発明の一実施形態について説明したが、本発明は上記実施形態に限定されることなく、例えば以下のような変形が考えられる。
上記実施形態では、ろ過前の液体試料に、蛍光ビーズｆｂを添加したが、本発明はこれに限定されない。
例えば、上記第７の工程において、マウント液に蛍光ビーズｆｂを混合し、当該マウント液によって標本をマウントすることで、レジオネラ試料菌ｌｇが含まれる試料に蛍光ビーズｆｂを添加するようにしてもよい。

１…ガイドタワー、２…ろ過器、２ａ…メンブレンフィルタ、３…吸引器、１０…ろ過装置、１１…スライドガラス、２０…蛍光顕微鏡、２１…ステージ、２２…対物レンズ、２３…三眼鏡筒ユニット、２４…接眼レンズユニット、２５…結像レンズユニット、２６…電子カメラ

Claims (6)

1. 試料中の蛍光染色された微生物をオートフォーカス機能を有する顕微鏡によって検出する微生物検出方法であって、
   前記微生物と同等の高さを有する蛍光粒子を前記試料中に添加する蛍光粒子添加工程を具備することを特徴とする微生物検出方法。
2. 前記蛍光粒子添加工程において、前記微生物の幅と同等の幅を有する蛍光粒子を前記試料中に添加することを特徴とする請求項１に記載の微生物検出方法。
3. 前記蛍光粒子添加工程において、前記微生物と形態的に異なる蛍光粒子を前記試料中に添加することを特徴とする請求項１または２に記載の微生物検出方法。
4. 前記蛍光粒子添加工程において、前記微生物の蛍光波長と異なる蛍光波長を発する蛍光粒子を前記試料中に添加することを特徴とする請求項１〜３に記載の微生物検出方法。
5. 前記微生物と前記蛍光粒子とが同等の波長で蛍光する場合には、前記試料中に蛍光変化色素を添加することにより前記蛍光粒子の蛍光波長を変化させることを特徴とする請求項１〜３に記載の微生物検出方法。
6. 前記蛍光粒子は、蛍光ビーズであることを特徴とする請求項１〜５に記載の微生物検出方法。
   

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