JP5837420B2 - 固体又は半固体培地上の微生物のキャラクタリゼーション方法 - Google Patents

Description

（関連出願の相互参照）
本願は、２００８年１２月１６日に出願した米国仮特許出願第６１／１２２，９２５号「Methods for Characterization of Microorganisms on Solid or Semi Solid Media」の恩典を主張する。この米国仮特許出願の開示内容を本明細書に援用する。

本発明は固体又は半固体培地上の微生物を、検出、モニタリング、キャラクタリゼーション、及び／又は同定する方法及びシステムに関するものである。

臨床診断目的で単離された微生物や、食料品、医療用組織、又は環境の汚染をモニタリングするために単離された微生物は、検出された微生物の存在に対する適切な応答を決定するためにキャラクタリゼーションを必要とする。Ｖｉｔｅｋ（登録商標）、Ｐｈｏｅｎｉｘ（商標）、Ｍｉｃｒｏｓｃａｎ（登録商標）システムのような従来の自動化表現型同定試験、又はＡＰＩのような手動表現型試験では、強固な結果を得るために、微生物が適切な発育相にあり且つ干渉する培地及び血液製剤が存在しないことが必要である。
これらのシステムでは１６〜２４時間かけて平板培養培地上で培養したコロニーが使用され、その後、これらのコロニーから標準懸濁液を作成し、実際のキャラクタリゼーション試験のために、更に４〜２４時間かけて培養を完了することを要する。

固有蛍光（ＩＦ）、赤外分光法（ＦＴＩＲ）、ラマン分光法のような光学分光法は非常に迅速な微生物の同定を可能にする可能性があるが、「混じりけが無い」微生物懸濁液に対して機能することだけが検証されてきた。出版物には、非常に限られた微生物セットを用いた、又は、機能的なキャラクタリゼーションを実現するために、特異的な結合現象のような追加の測定方法を必要とした、ＩＦ法による微生物のキャラクタリゼーションが記載されてきた。培養培地上の微生物の直接試験は、培地自体のスペクトルパターンへの寄与が大きいと考えられてきたことから問題視されてきた。

本願発明は、高蛍光培地を含む蛍光固体及び／又は半固体培養培地上で直接分光解析した微生物同士を区別することができる方法を提供することによって、従来技術における問題を克服する。

本発明は、固体又は半固体培地上の微生物を検出、モニタリング、キャラクタリゼーション、及び／又は同定する方法を提供するものである。キャラクタリゼーションとは、１つの種を実際に同定するだけではなく、微生物を大まかにカテゴリー化又は分類することを含む。本明細書で用いる「同定」とは、不明な微生物の属する科、属、種、及び／又は株を決定することを意味する。例えば、不明な微生物を科、属、種、及び／又は株レベルで同定することを意味する。本明細書で開示する方法によって、微生物の検出、キャラクタリゼーション、及び／又は同定を従来技術よりも迅速に行うことが可能になり、（例えば、感染していることが既知である又は感染の可能性がある対象について）より迅速な診断や、汚染された物質（例えば、食料品及び医薬品）の迅速な同定につながる。本発明による方法において行うステップは短い時間枠で実施し、臨床的に意義のあるすぐに使用可能な情報を生成することができる。幾つかの実施形態では、増殖の速い生物は僅か数分で検出及び同定することができる。増殖が比較的遅い生物についても従来技術をもしいた場合よりも迅速に検出及び同定し、有効な時間枠内で結果をもたらすことができる。同定／キャラクタリゼーションステップは単体で数分以下で実施することができる。本方法によって様々な種類の微生物（例えば、異なる網及び／又は種）の微生物を（例えば、混合培養物内で）同時に検出、モニタリング、キャラクタリゼーション、及び／又は同定することができる。有利には、幾つかの実施形態では、本発明による方法をコロニーを破壊することなくインサイチュで実施することができ、これによってコロニーを更なる試験又は使用のために温存することができる。また、本発明による方法は部分的又は全体的に自動化することができ、これにより感染性物質を扱うリスクや及び／又は試料を汚染するリスクを低減することができる。

本発明の第１の観点は、固体又は半固体培地上の微生物を検出及びキャラクタリゼーションする方法に関連し、該方法は
（ａ）固体又は半固体培地上の１以上のコロニーを解析して、前記コロニー内の微生物の自家蛍光（ＩＦ）測定値特性を生成するステップと、
（ｂ）前記自家蛍光（ＩＦ）測定値に基づいて前記コロニー内の前記微生物のキャラクタリゼーション及び／又は同定を行うステップとを含むことを特徴とする。

本発明の他の観点は、固体又は半固体培地上の微生物を検出及びキャラクタリゼーションする方法に関連し、該方法は、
（ａ）１以上の微生物コロニーを含むことが既知である又は含む可能性がある培地を走査して前記培地上のコロニーを検出するステップと、
（ｂ）前記ステップ（ａ）で検出した１以上のコロニーを解析して、前記コロニー内の微生物の自家蛍光（ＩＦ）測定値特性を生成するステップと、
（ｃ）前記自家蛍光（ＩＦ）測定値に基づいて前記コロニー内の前記微生物の検出、キャラクタリゼーション、及び／又は同定を行うステップとを含むことを特徴とする。

本発明の更に他の観点は、試料内の微生物をキャラクタリゼーション及び／又は同定する方法に関連し、該方法は、
（ａ）前記固体又は半固体培地上の試料に存在する微生物を培養して少なくとも１つのコロニーを生成するステップと、
（ｂ）倍地上の１以上のコロニーを解析して、微生物の自家蛍光（ＩＦ）測定値特性を生成するステップと、
（ｃ）生成された測定値に基づいて前記コロニー内の微生物をキャラクタリゼーション及び／又は同定するステップとを含むことを特徴とする。

本発明の追加の観点は、試料内の微生物の存在を検出する方法に関連し、該方法は
（ａ）微生物を含むことが既知である又は含む可能性がある試料を取得するステップと、
（ｂ）前記固体又は半固体培地上の試料に存在する微生物を培養するステップと、
（ｃ）前記固体又は半固体培地をポイント−バイ−ポイント走査して自家蛍光（ＩＦ）測定値を生成して、前記培地上に存在するあらゆるコロニーを検出するステップであり、生成された前記測定値によって検出された１つ以上のコロニーの存在によって前記試料内に微生物が存在することが示唆されることを特徴とするステップと、を含むことを特徴とする。

一実施形態では、本発明は固体又は半固体培地上の微生物を検出、キャラクタリゼーション、及び／又は同定するシステムに関連し、該システムは分光計と、レンズ系又は顕微鏡のような光学系とを備えることを特徴とする。他の実施形態では、システムは更に培地表面を走査するための機構及び／又は培地の環境（例えば、培養環境）を制御するための機構を備えることを特徴とする。

他の実施形態では、コロニーを解析して測定値を生成し、当該測定値は、コロニーの微生物を検出、キャラクタリゼーション、及び／又は同定するために用いることができる（例えば、コロニーを分光法により解析することができる）。微生物は、測定値（例えば、スペクトル）を既知の微生物から取得した同様の測定値（例えば、スペクトル）と比較することによって、キャラクタリゼーション及び／又は同定することができる。他の実施形態では、コロニーを非侵襲的に（例えば、シールされたプレート内で）解析することができる。更なる操作を行うことなく、（例えば、シールされたプレート内で）コロニーに含まれる微生物をキャラクタリゼーション及び／又は同定することができることで、微生物同定の安全性が増す。

更に他の実施形態では、微生物の固有の特性（例えば、自家蛍光）に基づいて分光解析を行う。他の実施形態では、本発明による方法にて添加され、特定の微生物又は微生物群と相互作用する添加剤から得られた信号に部分的に基づいて分光解析を行う。

他の実施形態では、方法は更にコロニーを回収するステップを含み、コロニーを再懸濁して更なる同定及び／又はキャラクタリゼーション試験（例えば、薬物耐性、毒性因子、耐性記録）を実施するステップを含む。

以下、添付図面を参照しながら本発明の詳細な説明を行う。

接種していない、膜無し血液寒天培地（ＢＡＰ）からのスペクトルである。 接種していない、培地表面に配置されたポール社製グリッド付きメトリセルブラックポリエーテルスルホンメンブレン（ポール）からのスペクトルである。 接種していない、培地表面に配置されたワットマン社製ブラック混合エステルメンブレン（ＷＭＥ）からのスペクトルである。 接種していない、培地表面に配置されたワットマン社製トラックエッチポリカーボネートブラックメンブレンからのスペクトルである。 ＢＡＰ上のＷＭＥメンブレン上のＥＣ３コロニーから取得したスペクトルである。 ＢＡＰ上のＷＭＥメンブレン上のＳＡ１コロニーから取得したスペクトルである。 ＳＡ１のスペクトルからＥＣ３のスペクトルを差し引いた結果である。 膜無しのＢＡＰ上のＥＣ１コロニーから取得したスペクトルである。 膜無しのＢＡＰ上のＳＡ１コロニーから取得したスペクトルである。 膜無しのＢＡＰ上のＥＦ１コロニーから取得したスペクトルである。 幕無しのＢＡＰ上のＰＡ１コロニーから取得したスペクトルである。 試行Ｆのポイント−バイ−ポイントＩＦサーチ走査の３次元プロットであり、高さは蛍光輝度に相当し、６時間時点での測定値を示す。 試行Ｆのポイント−バイ−ポイントＩＦサーチ走査の３次元プロットであり、高さは蛍光輝度に相当し、８時間時点での測定値を示す。 試行Ｆのポイント−バイ−ポイントＩＦサーチ走査の３次元プロットであり、高さは蛍光輝度に相当し、１０時間時点での測定値を示す。 試行Ｆのポイント−バイ−ポイントＩＦサーチ走査の３次元プロットであり、高さは蛍光輝度に相当し、１２時間時点での測定値を示す。 試行Ｆのポイント−バイ−ポイントＩＦサーチ走査の３次元プロットであり、高さは蛍光輝度に相当し、１６時間時点での測定値を示す。 試行Ｆのポイント−バイ−ポイントＩＦサーチ走査の３次元プロットであり、高さは蛍光輝度に相当し、２４時間時点での測定値を示す。 試行Ｆの２４時間以降のＢＡＰの拡大図である。 対応するコロニーの位置を示す１２時間の時点におけるサーチ走査から得た蛍光輝度の等高線図である。

本発明は様々な形態で実施することができる。本発明は本明細書に記載した実施形態に限定されるものと解釈すべきではない。そうではなく、これらの実施形態は本開示が詳細で完全なものとなり、本発明の範囲が当業者に十分伝わるようにするために提示するものである。例えば、一実施形態に関して例示した特徴を他の実施形態に組み込むことができ、特定の一実施形態に関して例示した特徴をその実施形態から削除することもできる。また、本開示に照らせば、本明細書に示した実施形態に対する本発明から逸脱しない様々な変更及び追加が当業者には理解されるであろう。

別段の定めがない限り、本明細書で使用する技術用語及び科学用語はすべて本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書では、発明の説明で使用する用語は特定の実施形態を説明するためのものであって本発明を限定するものではない。

［定義］
本明細書で使用する「a」、「an」又は「the」は１つ又は２つ以上のものを意味する可能性がある。例えば「細胞（a cell）」という場合は単一の細胞を意味することも複数の細胞を意味することもある。

また、本明細書で使用する「及び／又は（and/or）」という表現は、列挙した関連アイテムの１つ又は複数を対象とする任意の可能な組合せに加えて選択肢（「又は（or）」）として解釈した場合の組合せの欠如も指し、それらをすべて包含するものである。

更に、本明細書で使用する「約（about）」という用語は、化合物又は作用物質の量、投与量、時間、温度といった測定可能な値を指すときは、指定された量の±２０％、±１０％、±５％、±１％、±０．５％又は±０．１％のばらつきを含むものとする。

本明細書で使用する「微生物」という用語は、一般に単細胞であり、研究室で繁殖及び取扱い可能な有機体を包含する。このような有機体としてはグラム陽性又はグラム陰性バクテリア、イースト、カビ、寄生虫及びモリキューテスが挙げられるが、これらに限定されるものではない。本発明のグラム陰性バクテリアの非限定的な例としては下記の属のバクテリアが挙げられるが、これらに限定されるものではない：シュードモナス属、エシェリキア属、サルモネラ属、赤痢菌属、エンテロバクター属、クレブシエラ属、セラチア属、プロテウス属、カンピロバクター属、ヘモフィルス属、モルガネラ属、ビブリオ属、エルシニア属、アシネトバクター属、ステノトロフォモナス属、ブレブンディモナス属、ラルストニア属、アクロモバクター属、フゾバクテリウム属、プレボテラ属、ブランハメラ亜属、ナイセリア属、バークホルデリア属、シトロバクター属、ハフニア属、エドワードシエラ属、アエロモナス属、モラクセラ属、ブルセラ属、パスツレラ属、プロビデンシア属及びレジオネラ属。本発明のグラム陽性バクテリアの非限定的な例は、以下の属のバクテリアを含む：腸球菌、連鎖球菌、ブドウ球菌、バチルス属、パエニバチルス属、乳酸桿菌属、リステリア属、ペプトストレプトコッカス属、プロピオン酸菌属、クロストリジウム属、バクテロイデス属、ガードネレラ属、コクリア属、ラクトコッカス属、ロイコノストック属、ミクロコッカス、マイコバクテリウム属及びコリネバクテリウム属。本発明のイースト及びカビの非限定的な例としては下記の属のイースト及びカビが挙げられるが、これらに限定されるものではない：カンジダ属、クリプトコックス属、ノカルジア属、アオカビ属、アルタナリア属、ロドトルラ属、アスペルギルス属、フザリウム属、サッカロミセス属及びトリコスポロン属。本発明の寄生虫の非限定的な例としては下記の属の寄生虫が挙げられるが、これらに限定されるものではない：トリパノソーマ属、バベシア属、リーシュマニア属、マラリア原虫属、ブケリア属（Wucheria）、ブルギア属、オンコセルカ属及びネグレリア属。本発明のモリキューテスの非限定的な例としてはマイコプラズマ属及びウレアプラズマ属のモリキューテスが挙げられる。

本明細書で使用する「コロニー」、「マイクロコロニー」という表現は、多数の微生物又は微生物集団であって、相互に近接して存在し、表面に存在し、そして、単一の祖先微生物のインサイチュ複製によるクローン子孫であるものを指す。一般的に、「コロニー」は、人の眼で見ることができ、典型的には、直径が約５０μｍ、６０μｍ、８０μｍ又は１００μｍよりも大きい。しかし、本明細書で使用する場合には、特記しない限り、「コロニー」という用語は５０μｍ以上の直径を有するコロニーと、５０μｍ以下の直径を有する「マイクロコロニー」の両方を含むことを意味する。他の実施形態では、本願発明は「マイクロコロニー」内の微生物を、走査し、検出し、キャラクタリゼーションし、及び／又は、同定することを目的とする。本明細書における「マイクロコロニー」は、約２μｍ〜約５０μｍ、又は、約１０μｍ〜約５０μｍの範囲でありうる。「マイクロコロニー」は、一般的に裸眼で見るには小さすぎる（例えば、直径約５０μｍ未満）。

本明細書で使用する「走査（scan）」又は「走査する（scanning）」という用語は、予め設定した領域をシステマチック若しくは予め設定したパターンで検査すること、又はランダムに検査し、これにより、検査対象（例えば、微生物コロニー）を見つけることを指す。
例えば、集束光をシステマチック若しくは所定のパターンで、又はランダムに表面上で移動させて、固体又は半固体培地を「走査」して、微生物コロニーを検出し、見つけ出し、さもなければ感知することができる。本実施形態によれば、光源は約０．５ｍｍ未満、約０．２ｍｍ未満、又は０．１ｍｍ未満の直径のビーム直径を有することが典型的である。他の実施形態では、ビーム直径は約５μｍ〜約５００μｍ、約１０μｍ〜約１００μｍ、又は約２０μｍ〜約８０μｍである。

一実施形態では、「走査」は、固体又は半固体培地のポイント−バイ−ポイントの「走査」を含む。この実施形態によれば、光源（例えば、レーザービーム）を固体又は半固体培地上の第１ポイントに移動させ、走査及び解析ステップを実施して、存在しうるあらゆる微生物コロニーの検出及び／又はキャラクタリゼーションを行う。或いは、固体又は半固体培地を光源に対して移動して、固体又は半固体培地のポイント−バイ−ポイント走査を実施することができる。続いて、光源（例えば、レーザービーム）、又は、固体又は半固体培地を移動して、培地の第２ポイントを走査及び／又は解析することができる。このような、ポイント−バイ−ポイント走査のプロセスを所定の検査領域のポイント−バイ−ポイント検査が完了するまで継続することができる。検査領域は、固体又は半固体培地（例えば、培地プレート）の全体又はこれらの一部分であり得る。

他の実施形態では、直線軌道（例えば、培地を横断する長い直線）に沿うポイント−トゥ−ポインによって、ポイント−バイ−ポイント検査を実施することができる。その後、光源又は培地を第２の直線に移動させ、当該第２の直線の直線軌道に沿ってポイント−バイ−ポイント検査を実施することができる。このポイント−バイ−ポイント及びライン・バイ・ライン検査パターン（又は、グリッド型走査）を所定の検査領域が完了するまで継続することができる。検査領域は、固体又は半固体培地（例えば、培地プレート）全表面又はそれらの一部であり得る。他の実施形態では、走査は連続走査（すなわち、連続ポイント−バイ−ポイント走査）である。

本発明は、固体又は半固体培地上の微生物を検出、モニタリング、キャラクタリゼーション、及び／又は同定する方法を提供する。これらの迅速な方法を用いると、微生物の検出、キャラクタリゼーション及び／又は同定を従来技術よりも迅速に行うことができ、それにより（例えば感染又は感染の疑いがある被験者の）より迅速な診断が可能となり、また（例えば食品、給水及び製薬の）汚染物質のキャラクタリゼーション及び／又は同定も可能となる。試料の採取から微生物のキャラクタリゼーション／同定に至る本発明の方法に含まれる各ステップを非常に短い時間枠で実行して臨床的に意義のある実用的な情報を取得することができる。いくつかの実施形態では、本発明の方法を約７２時間未満、例えば約１８、１２、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、又は１時間未満で実行することができる。ある実施形態では、同定ステップを６０分未満、例えば約５０、４０、３０、２０、１０、５、４、３、２、又は１分未満で実行することができる。本方法は、本明細書に記載したあらゆる微生物をキャラクタリゼーション及び／又は同定するために用いることができる。一実施形態では、微生物はバクテリアである。他の実施形態では、微生物はイーストである。別の実施形態では、微生物はカビである。本方法は、様々な種類の微生物、例えば、異なる種、族、科、目、類、門、及び／又は界の微生物を、検出、モニタリング、キャラクタリゼーション及び／又は同定するために用いることができる。一実施形態では、本発明による方法は、試料中、例えば混合培地に存在する異なる種類の微生物の一部又は全てをキャラクタリゼーション及び／又は同定することを可能とする。他の実施形態では、本方法を、２種類以上の異なる種類のバクテリア、２種類以上の異なる種類のイースト、２種類以上の異なる種類のカビ、又はバクテリア、イースト、及び／又はカビの２種類以上の異なる種類の混合物をキャラクタリゼーション及び／又は同定するために用いることができる。複数の種類の微生物のそれぞれについての検出は、同時又は略同時に行うことができる。また、本方法は部分的又は全体的に自動化可能であり、したがって、感染性のある物質を扱うリスク及び／又は試料を汚染するリスクを低減することができる。

本発明の第１の観点は、固体又は半固体培地上の微生物を検出及びキャラクタリゼーションする方法に関連し、該方法は
（ａ）培地上の１以上のコロニーを解析して、コロニー内の微生物の自家蛍光（ＩＦ）測定値特性を生成するステップと、
（ｂ）生成された測定値に基づいてコロニー内の微生物のキャラクタリゼーション及び／又は同定を行うステップとを含むことを特徴とする。

本発明の他の観点は、固体又は半固体培地上の微生物を検出及びキャラクタリゼーション及び／又は同定する方法に関連し、該方法は、
（ａ）１以上の微生物コロニーを含むことが既知である又は含む可能性がある培地を走査して培地上のコロニーを検出するステップと、
（ｂ）ステップ（ａ）で検出した１以上のコロニーを解析して、コロニー内の微生物の自家蛍光（ＩＦ）測定値特性を生成するステップと、
（ｃ）生成された測定値に基づいてコロニー内の微生物の検出、キャラクタリゼーション、及び／又は同定を行うステップとを含むことを特徴とする。

本発明の更に他の観点は、試料内の微生物をキャラクタリゼーション及び／又は同定する方法に関連し、該方法は、
（ａ）固体又は半固体培地上の試料に存在する微生物を培養して少なくとも１つのコロニーを生成するステップと、
（ｂ）倍地上の１以上のコロニーを解析して、微生物の自家蛍光（ＩＦ）測定値特性を生成するステップと、
（ｃ）生成された測定値に基づいてコロニー内の微生物をキャラクタリゼーション及び／又は同定するステップとを含むことを特徴とする。

本発明の追加の観点は、試料内の微生物の存在を検出する方法に関連し、該方法は
（ａ）微生物を含むことが既知である又は含む可能性がある試料を取得するステップと、
（ｂ）固体又は半固体培地上の試料に存在する微生物を培養するステップと、
（ｃ）培地を走査して自家蛍光（ＩＦ）測定値を生成して、培地上に存在するあらゆるコロニーを検出するステップであり、生成された測定値によって検出された１つ以上のコロニーの存在によって試料内に微生物が存在することが示唆されることを特徴とするステップと、を含むことを特徴とする。

本発明の方法によって試験可能な試料（すなわち試験試料）は、微生物の存在及び／又は増殖が疑われる又は疑われる可能性がある臨床試料と非臨床試料の両方を含み、また微生物の有無を定期的に又は臨時に検査する物質の試料も含む。利用する試料の量は方法の汎用性及び／又は感度に応じて大きく変化する可能性がある。試料調製は当業者に既知の任意の数の技法を利用して実行することができる。

試験可能な臨床試料としては、典型的には臨床検査室又は研究所で試験される任意のタイプの試料が含まれ、例えば血液、血清、血漿、血液分画、関節液、尿、精液、唾液、糞便、脳脊髄液、胃内容物、膣分泌物、組織ホモジェネート、骨髄穿刺液、骨ホモジェネート、痰、吸引液、ぬぐい液（swab）及びぬぐい液残滓（swab rinsate）、他の体液等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。

本発明は研究用途ならびに獣医学及び医学用途に適用される。臨床試料が採取可能な適切な被検者は一般には哺乳類の被験者であるが、どのような動物であってもよい。本明細書で使用する「哺乳類」という用語には、それらに限らないが、人間、人間以外の霊長類、牛、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウマ、ネコ、イヌ、ウサギ、齧歯動物（例えばラット又はマウス）等が含まれる。人間の被験者には新生児、乳児、幼児、成人及び老人の被験者を含む。試料が採取可能な被験者としては哺乳類、鳥類、爬虫類、両生類及び魚類が挙げられるが、これらに限定されるものではない。

試験可能な非臨床試料としては、食品、飲料、医薬品、化粧品、水（例えば飲料水、非飲料水及び廃水）、海水バラスト、空気、土壌、汚水、植物材料（例えば種、葉、茎、根、花、果実）、血液製剤（例えば血小板、血清、血漿、白血球分画等）、ドナー臓器又は組織試料、生物戦試料（biowarfare sample）等を含めた物質が挙げられるが、これらに限定されるものではない。本方法は工業環境の汚染レベル、工程管理、品質管理等をモニタリングするための実時間試験にも特に適している。

試料体積は、培地に蒔いた場合に１又は複数のコロニーを生成するのに十分な程度に大きい必要がある。適切な体積は、試料のソース及び試料中の微生物の予想レベルに依存する。例えば、感染創傷由来の臨床ぬぐい液は体積あたりの微生物レベルが汚染を試験する飲料水試料よりも高く、このため、飲料水試料に比較して少ない体積のぬぐい液材料が必要となる。一般的に、試料の量は少なくとも約５０ｍｌ、例えば、１００ｍｌ、５００ｍｌ、１０００ｍｌ又はそれ以上である。他の実施形態では、試料は約５０ｍｌ未満、例えば、約４０ｍｌ、３０ｍｌ、２０ｍｌ、１５ｍｌ、１０ｍｌ、５ｍｌ、４ｍｌ、３ｍｌ、又は２ｍｌ未満である。ある実施形態では、試料の量は約１ｍｌ以下、例えば、約７５０μｌ、５００μｌ、２５０μｌ、１００μｌ、５０μｌ、２５μｌ、１０μｌ、５μｌ、１μｌ、０．５μｌ、０．１μｌ未満である。試料量が多い実施形態では、（例えば、フィルター膜を介して）試料をろ過し、及び／又は従来既知の方法（例えば、遠心分離、蒸発等）によって濃縮し、体積を減少させ、及び／又は試料中のあらゆる微生物を収集する。フィルター膜上で収集した微生物を、再懸濁して固体若しくは半固体培地上に、又は、半固体培地上に直接載置可能なフィルター膜上に蒔くことができる。

試験対象の試料を適切な培地上に蒔き、微生物の増殖につながる条件下で培養する。培地は、試料内に存在する／存在が疑われる微生物の種類に基づいて選択することができる。様々な微生物についての適切な増殖培地は当業者によく知られている。増殖培地は、適切な栄養素を含み、微生物の動きを制限する（すなわち、局所的な増殖をもたらす）任意の培地でありうる。幾つかの実施形態では、培地は半固体培地、例えば、寒天培地、ゼラチン培地、アルギン酸培地、カラギーナン培地、又はペクチン培地である。適切な培地は、当業者によく知られている様々な機能を有する培地であり、例えば、多目的培地、選択的培地、鑑別培地（differential media）及び／又は色素産生培地（chromogenic media）を含むが、これらに限定されない。培地は、有意義な測定（例えば、ＩＦ測定）を得られるように、選択及び／又は調節する。適切な半固体培地は、例えばＡＣ寒天、アセトバクター寒天、アクリフラビン−セフタジジム寒天、アクチノミセス寒天、放線菌単離寒天、アエロモナス単離寒天、嫌気性寒天、嫌気性血液寒天、嫌気性ＴＶＬＳ寒天、ＡＰＴ寒天、Ａｓｈｂｙ’ｓマンニトール寒天、アスペルギルス鑑別寒天、ＡＳＳ寒天、アウレウス寒天、アザイド血液寒天、Ｂ．Ｔ．Ｂラクトース寒天、バシルス寒天、ベアードパーカー寒天、ＢｉＧＧＹ寒天、バイルエスクリンアジド寒天、ブリリアントグリーン胆汁酸塩澱粉寒天、亜硫酸ビスマス寒天、血液寒天ＳＬＭＢ、ＢＰＬ寒天、脳心臓浸出物寒天、ブリューワー寒天、ブリリアントグリーン寒天、ブリリアントグリーン胆汁寒天、ブリリアントグリーンフェノールレッド乳糖ショ糖寒天、ＢＲＯＬＡＣＩＮ寒天、ＢＲＯＬＡＣＩＮ ＭＵＧ寒天、ブルセラ寒天、ＢＳＭ寒天、緩衝炭末イースト抽出物（ＢＣＹＥ）寒天、カルシウムカゼイン寒天、カンピロバクター選択寒天、カンジダ同定寒天、カゼインイーストマグネシウム寒天、ＣＡＳＯ寒天、ＣＡＴＣ寒天、セレウス選択寒天、セトリミド寒天、チャップマンストーン寒天、チャイナブルー乳糖寒天、厚膜胞子（Ｃｈｌａｍｙｄｏｓｐｏｒｅ）寒天、クリステンセンクエン酸塩寒天、クリステンセン尿素寒天、クエン酸塩寒天、ＣＬＥＤ寒天、クロストリジウム寒天、クロストリジウムディフィシル寒天、大腸菌寒天、コロンビア寒天、コロンビア血液寒天、コーンミール寒天、コーンミールペプトンイースト寒天、ＣＰＣ−寒天、クランプ寒天、ツァペック・ドックス寒天、Ｄ．Ｔ．Ｍ．寒天、デイビスミニマル寒天、ＤＣＬＳ寒天、デオキシコール酸クエン酸塩寒天、デオキシリボヌクレアーゼテスト寒天、ＤＥＶ ＥＮＤＯ寒天、ＤＥＶゼラチン寒天、ＤＥＶ栄養寒天、デキストロースカゼインペプトン（Ｄｅｘｔｒｏｓｅ ｃａｓｅｉｎｐｅｐｔｏｎｅ）寒天、デキストロース澱粉寒天、ＤＨＬ寒天、ジクロランローズベンガル寒天、トルイジン含有ジフテリア毒性（ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ）寒天、デオキシリボヌクレアーゼ試験寒天、大腸菌寒天、病原性大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７ ＭＵＧ寒天、ＥＣＣ寒天、ＥＣＣ選択寒天、ＥＣＤ寒天、ＥＣＤ ＭＵＧ寒天、ＥＭＢ寒天、エンドウ寒天、エンテロバクターサカザキ寒天、エンテロコッカスフェシウム寒天、エンテロコッカス選択寒天、Ｅｓｃｕｌｉｎ 鉄寒天、Ｅｕｇｏｎｉｃ寒天、Ｆｕｎｇａｌ寒天、Ｆｕｎｇｏｂｉｏｔｉｃ寒天、ガスナー寒天、ガスナーラクトース寒天、ゼラチン鉄培地、ゼラチン塩寒天、Ｇｅｒｍ ｃｏｕｎｔ寒天、グルコースブロモクレゾールパープル寒天、ＧＳＰ寒天、ヘクトエンエンテリック寒天、カナマイシンエスクリンアザイド寒天、カナマイシンカンピロバクター寒天、ＫＦストレプトコッカス寒天、Ｋｉｎｇ寒天、クレブシエラ選択寒天、クリグラー寒天、ＫＲＡＮＥＰ寒天、Ｋｕｎｄｒａｔ寒天、ラクトバチルスブルガリカス寒天、乳糖ＴＴＣ寒天、ＬＢ寒天、Ｌｅｉｆｓｏｎ寒天、Ｌｅｖｉｎｅ ＥＭＢ寒天、リステリア寒天、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏ ｃｏｎｆｉｒｍａｔｏｒｙ寒天、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ寒天、リステリア選択寒天、リトマスラクトース寒天、ＬＬ寒天、ＬＰＭ寒天、ＬＳ鑑別（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ）寒天、Ｌ−トップ寒天、ルーリア寒天、リジンアルギニン鉄寒天、リジン鉄寒天、Ｍ腸球菌寒天、Ｍ−１７寒天、マッコンキー寒天、クリスタルバイオレット、塩化ナトリウム、及び０．１５％胆汁酸塩含有マッコンキー寒天、マッコンキーＭＵＧ寒天、マッコンキーソルビトール寒天、麦芽寒天、麦芽抽出物寒天、マンニトール塩フェノールレッド寒天、マクブライド寒天、マックラングトアベ寒天、Ｍ−ＣＰ寒天、肉−肝臓寒天、膜フィルタエンテロコッカス選択寒天、膜ラクトースグルクロニド寒天、Ｍ−エンドー寒天、Ｍ−エンドー寒天（ＬＥＳ）、ＭｅＲｅＳａ寒天、Ｍ−ＦＣ寒天、ミドルブルック７Ｈ１０寒天、ミドルブルック７Ｈｌ １寒天、ミルク寒天、ミティス‐サリバリウス寒天、ＭＭ寒天、修正緩衝炭末寒天、ＭＯＸ寒天、ＭＲＳ寒天、ＭＳ．Ｏ１５７寒天、Ｍ−ＴＥＣ寒天、ミューラーヒントン寒天、ＭＵＧトリプトン大豆寒天、マイコプラズマ寒天、ノーブル寒天、栄養寒天、Ｎｕｔｒｉｅｎｔゼラチン、ＯＦ試験栄養寒天、ＯＧＹ寒天、ＯＧＹＥ寒天、オレンジ血清寒天、オックスフォード寒天、ＰＡＬＣＡＭリステリア選択寒天、ペンタクロロローズベンガルイースト抽出物寒天、ペプトンイースト抽出物寒天、ペプトナイズドミルク寒天、パーフリンジェンス寒天、フェノールレッドデキストロース寒天、フェノールレッドラクトース寒天、フェノールレッドマルトース寒天、フェノールレッド蔗糖寒天、フェノールレッド酒石酸塩寒天、フェノールフタレインリン酸塩寒天、フェニルアラニン寒天、プレートカウント寒天、プレートカウントＭＵＧ寒天、ＰＬＥＴ寒天、ＰＭインジケータ寒天、ポテトデキストロース寒天、ポテトブドウ糖ローズベンガル寒天、ポテトブドウ糖蔗糖寒天、Ｐｒｉｌ（登録商標）マンニトール寒天、シュードモナス寒天、Ｒ−２Ａ寒天、ラカ−レイ寒天、エンテロコッカス簡易（Ｒａｐｉｄ ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｉ）寒天、クロストリジウム増菌寒天、米抽出物寒天、ロゴサ寒天、ロゴサＳＬ寒天、ローズベンガル寒天、ローズベンガルクロラムフェニコール寒天、Ｓ．Ｆ．Ｐ寒天、寒天、サブロー２％ブドウ糖寒天、サブロー４％ブドウ糖寒天、サブローデキストロース寒天、クロラムフェニコール含有サブローグルコース寒天、サルモネラ寒天、Ｏｅｎｏｚによるサルモネラ寒天、サルモネラクロモゲン寒天、ＳＤ寒天、選択寒天、病原性菌選択寒天、ＳＦＰ寒天、Ｓ−Ｇａｌ（登録商標）／ＬＢ寒天、シャプトン寒天、シモンズクエン酸塩寒天、スキムミルク寒天、ソルビン酸寒天、スピリットブルー寒天、ＳＰＳ寒天、ＳＳ−寒天、標準栄養分寒天ｎｏ．１、ブドウ球菌寒天、ストレプトコッカス選択寒天、ストレプトコッカスサーモフィルス単離寒天、硫酸塩ＡＰＩ寒天、硫酸鉄寒天、ＴＢＸ寒天、ＴＣＢＳ寒天、ＴＣＭＧ寒天、Ｔｅｒｇｉｔｏｌ（登録商標）−７寒天、サイヤーマーティン寒天、Ｔｈｅｒｍｏａｃｉｄｕｒａｎｓ寒天、チンスダール寒天、トマトジュース寒天、トリブリチン寒天、トリプルシュガー鉄寒天、トリプティックソイ（ｔｒｙｐｔｉｃ ｓｏｙａ）寒天、トリプトン寒天、トリプトンドウ糖抽出物寒天、トリプトンブドウ糖イースト抽出物寒天、トリプトン大豆イースト抽出物寒天、トリプトンイースト抽出物寒天、トリプトース寒天、ＴＳＣ寒天、ＴＳＮ寒天、ユニバーサルビール寒天、ＵＴＩ寒天、ビブリオ寒天、腸炎ビブリオ蔗糖寒天、バイオレットレッド胆汁寒天、バイオレットレッド胆汁ブドウ糖寒天、バイオレットレッド胆汁ラクトース寒天、バイオレットレッド胆汁ラクトースデキストロース寒天、ビタミンＢ_１２培養寒天、フォーゲルジョンソン寒天、ＶＲＢ ＭＵＧ寒天、ウイルキンソン チャルグレン嫌気性寒天、ウィルソンブレア寒天、ＷＬ鑑別寒天、ＷＬ栄養素寒天、ワート寒天、ＸＬＤ寒天、ＸＬＴ４寒天、イースト寒天、イースト抽出物寒天、イーストモルト寒天、イーストマンニトール寒天、エルシニア単離寒天、エルシニア選択寒天、ＹＧＣ寒天、ＹＰＡＤ寒天、ＹＰＤＧ寒天、ＹＰＧ寒天及びＹＴ寒天。一実施形態では、固体又は半固体培地を、更に１種又は複数種の追加の添加物であって、固体又は半固体培地上の微生物コロニーの固有蛍光（ＩＦ）値を強めるか増加させる添加物を含んで構成することも可能である。固有蛍光を強めるために適した添加物には、１種又は複数種のタンパク質加水分解物、アミノ酸、肉及び野菜抽出物、炭水化物源、緩衝剤、蘇生剤（resuscitating agent）、増殖因子、酵素補助因子、無機塩類、補助金属（metal supplement）、還元化合物、キレート剤、感光剤、消光剤、還元剤、酸化剤、洗剤、界面活性剤、殺菌剤、選択剤、代謝阻害剤、又はこれらの組み合わせが含まれる。

他の実施形態では、培地は、例えば半固体培地の上面に載置するフィルター（例えば、フィルター膜又はガラスファイバーフィルター）であってもよい。他の実施形態では
フィルターを液体培地に曝した（例えば、浸した）材料（例えば、吸収パッド）の上に載置する。幾つかの実施形態では、試料（例えば、体積の大きい試料）をフィルターを通過させ、試料内に存在するあらゆる微生物を収集する。そして、フィルターを増殖培地の上面に載置して、適切な条件下で培養して微生物を増殖させることができる。適切なフィルター膜は、当業者によく知られており、微生物を収集することに適しており、且つ／又は、微生物の増殖をサポートすることができる、あらゆる膜を含む。膜材料は、例えば、セルロース、セルロース混合エステル、ニトロセルロース、ポリビニルクロライド、ナイロン、ポリテトラフルオロエチレン、ポリスルフォン、ポリエステルスルフォン、ポリカーボネートブラック、ブラック混合エステル（black mixed ester）、及びこれらのあらゆる組み合わせを含むが、これらに限定されない。フィルターは、液体をろ過するのに適し、且つ／又は、微生物の収集に適した細孔の大きさを有し、その大きさは例えば、酵母に対しては約１〜約２５μｍであり、細菌に対しては約０．０５μｍ〜約２μｍ、例えば、０．２μｍ〜約１μｍである。

ある実施形態では、例えば、普通微生物寒天プレートのようなプレートに培地を構成することができる。幾つかの実施形態では、プレートは例えばプレートあたり２、４、６、８、１２、２４、３２、４８、６４、９６、１２８個以上のウェルを有する複数の試料を試験するためのマルチウェルプレートである。プレートは、例えば、ポリスチレン又はガラスのような微生物の増殖に適したあらゆる材料で構成される。プレートは本来、蓋を有する。蓋がしてある時にコロニーの解析を行う場合は、蓋及び／又はプレートは紫外線、可視光、及び／又は近赤外スペクトルに対して透過性である少なくとも１つの領域を有し、蓋及び／又はプレートを通じて解析できるようにする。

本発明による方法では、「固体又は半固体培地上の試料内に存在する微生物を増殖する」、「培地上に試料を載置する」という表現は、あらゆる方法で試料を培地に接触させて、試料内に存在する微生物が増殖してコロニーを生成できるようにすることを含む。ある実施形態では、試料を固体又は半固体培地の表面に載置する。他の実施形態では、試料を液状の培養基と混合して（例えば、プレートに流し込み）凝固させ、増殖した全てのコロニーを培地内に埋没させることができる。他の実施形態では、試料を脱水培地と混合して、培地を再度水に戻して、凝固させることができる。

一実施形態では、固体又は半固体培地は容器の底部にあり、当該容器は培地上の液体に懸濁された微生物を含む。容器を操作（例えば、遠心分離）して倍地上に微生物を移動させることができる。そして、液体を除去して培地を培養してコロニーを成長させる。例えば、血液試料を液体増殖培地と、固体又は半固体培地を底部に含む血液培養管に入れることができる。その後、（任意に赤血球を溶解した後に）培養管を遠心分離して固体又は半固体培地上に微生物を移動させ、液体を除去し、増殖した微生物を本発明による方法に従って検出及び／又は同定する。

試料を培地上に（例えば、液体試料を標準的微生物手法を用いて培地上に広げる、及び／又は、フィルター膜を半固体培地上に配置することにより）移動させた後、培地を試料内に存在する微生物の成長に適した条件下で培養する。適切な条件は当業者によく知られているが、これは、微生物及び培地に依存する。培地は、約２０度〜約５０度、例えば、約２５度〜約４５度、例えば約３７度で培養することができる。培養時間は、（視覚的又は分光学的に）検出可能なコロニーが出現するのに十分な時間であり、この時間は、微生物、温度、培地、栄養素レベル、及びその他の成長速度を決定する条件に依存する。幾つかの実施形態では、培養時間１２時間以下、例えば、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、又は１時間以下である。ある実施形態では、増殖が遅い条件下又は増殖の遅い微生物（例えば、マイコバクテリア）を用いた場合、では、培養時間は約１２時間以上、例えば約１８、２４、３６、４８、又は７２時間以上である。幾つかの実施形態では、培地をインキュベータ内で培養し、インキュベータから培地を１回以上取り出して、装置内に配置して、培地上で増殖するコロニーを検出及び／又は同定する。他の実施形態では、培地を、例えば温度調節プレートホルダ等のコロニーを検出及び／又は同定するために用いる装置内で直接培養することもできる。

１つの観点では、本発明は、固体又は半固体培地上の微生物コロニーの解析に関連し、コロニーを構成する微生物を同定するＩＦ測定値を取得する。１つの実施形態では、解析は蛍光分光分析法による。解析は、非侵襲的方法にて行うことができる。すなわち、培地上で手をつけない状態でコロニーを解析することができる。他の実施形態では、プレートは培地を含み、解析の間コロニーは密閉（例えば、蓋を外さずに）されたままである。この実施形態によれば、プレート又はその一部は、光（例えば、例えば近赤外（ＮＩＲ；７００ｎｍ〜１４００ｎｍ）、紫外（ＵＶ；１９０ｎｍ〜４００ｎｍ）及び／又は可視（ＶＩＳ；４００ｎｍ〜７００ｎｍ）光スペクトルの少なくとも一部分）を透過する任意の材料で構成することができる。適切な材料の例としては、それらに限らないが、アクリル、メタクリレート、石英、溶融シリカ、サファイヤ、環状オレフィンコポリマー（ＣＯＣ）及び／又はシクロオレフィンポリマー（ＣＯＰ）（例えば、Ｚｅｏｎｅｘ（登録商標）（カリフォルニア州サンディエゴ、Ｚｅｏｎｅｘ（登録商標）社）が挙げられる。微生物を非侵襲的方法で検出及び同定する能力は、任意に同定プロセスの間プレートを密閉に維持することや、手順の一部又は全てを自動化することと組み合わせることができ、これにより、感染性及び／又は有害性の微生物を含む恐れがある試料を取り扱うことによるリスクを低減するとともに、試料を汚染するリスクを低減することができる。更に、ペレットを更に処理（例えば、懸濁及び再プレート化及び／又は他の同定アッセイ）することなく直接解析して微生物を同定することができる機能は、同定の迅速性を大きく増大することができる。他の実施形態では、コロニーを溶液に懸濁して、解析前に任意に培地から除去する。他の実施形態では、インサイチュ解析後にコロニーを溶液に懸濁して、更なる解析を実施する。例えば、ラテックス凝集法試験又は自動化表現型同定試験のような、単離微生物に適用可能であるが培地上のコロニーには適用不可の技術を懸濁微生物に対して実施することができる。

幾つかの実施形態では、分光分析を用いて微生物の自家蛍光特性、例えば、染色液、色素、結合剤等のような追加の試薬が存在しない場合における微生物内の特性を分析することができる。他の実施形態では、分光分析はＩＦの分析に加えて微生物の複数の外因性蛍光特性、例えば追加の薬剤を用いることによってのみ検出することができる特性を分析するために用いることができる。分光分析解析法は微生物の複数の自家蛍光又は外因性蛍光を検出及び／又は同定するために効果的であるとして当業者に既に知られているあらゆる方法で実施可能である。例えば、前面蛍光（この場合、励起及び放出された光が同じ光学表面にて入射及び放射され、試料が光学的に厚い場合には、励起光が試料内にて非常に短い距離を進む（例えば、Ｅｉｓｉｎｇｅｒ，Ｊ及びＪ．Ｆｌｏｒｅｓ、「Ｆｒｏｎｔ−ｆａｃｅ ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｒｙ ｏｆ ｌｉｑｕｉｄ ｓａｍｐｌｅｓ」、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．９４：１５（１９８３）参照））を用いてペレット内の微生物を同定することができる。他の形式の測定、例えばエピ蛍光、反射、吸収及び／又は散乱測定も本発明二で採用することができる。

本発明の第１の観点では、（例えば、光ファイバーを用いて）分光光度計に機能的に連結されたレンズ系又は顕微鏡設備のような合焦光学系を利用して分光分析を実施して、紫外、可視、及び赤外帯域での観察を実施する。一実施形態では、培地（例えば、プレート内の培地）を顕微鏡ステージに載置して、当該ステージ上にて励起源によって解析し更に（例えば、顕微鏡を通じて）視覚的に観察することができる。一実施形態では、プレートを手動で操作してプレート自体、又はプレートが固定されている顕微鏡ステージを移動させて、解析対象のコロニー位置に移動させることができる。他の実施形態では、顕微鏡ステージを自動で制御して（例えば、電動ステージ）、ステージに取り付けられたプレートを（操作対象の全部分をカバーするように構成される設定パターンで）操作できるようにする。他の実施形態では、培地を静止保持してレーザーのような合焦光線で培地を横断的に操作して、放出光をイメージング又は非イメージング検出器で検出する。更なる実施形態では、顕微鏡は温度制御（例えば、水浴）を有するプレート培養器を備え、プレートを顕微鏡の下に置き、培地上における培養中に解析できるようにすることが可能である。

一実施形態では、励起源を単一のコロニーに向けてＩＦ測定を行うことができる。照射時点のコロニーのサイズは、正確な測定が可能である限り、いかなるサイズであっても良い。一実施形態では、人間の眼で検出できない場合にコロニーを解析することができる。例えば、コロニーはその大きさが約１０，０００以下の微生物を含むコロニー、例えば約５０００、１０００、５００、４００、３００、２００又は１００以下の微生物を含むコロニーを解析することができる。他の実施形態では、直径約１０００μｍ以下又は（コロニーが円形でない場合）最も長い範囲の長さ約１０００μｍ以下のコロニーを解析することができる。例えば、約９００、８００、７００、６００、５００、４００、３００、２００、１００、５０、又は２５μｍ以下の場合にもコロニーを解析することができる。一実施形態では、励起ビームは解析対象のコロニーよりも直径が小さく、ビーム全体をコロニーに向け、培地がＩＦ測定を実質的に阻害しないようにすることができる。ある実施形態では、励起ビームは直径約１０００μｍ以下、例えば約９００、８００、７００、６００、５００、４００、３００、２００、１００、５０、又は２５μｍ以下である。励起ビームのサイズや放射ビームのサイズは、例えばピンホールを用いることで制御することができる。幾つかの実施形態では、励起ビームをコロニーの中心に導く。他の実施形態では、励起ビームをコロニーの他の部分（例えば、端部又は端部付近）に導くが、当該部分では微生物はコロニーの中心部とは異なる成長及び／又は代謝状態にある。更なる実施形態では、例えば、共焦点顕微鏡を用いて励起ビームをコロニー内の所定の深さに導く。

コロニー照射源又は励起源は当業者に知られているような多数の適切な光源から選択されうる。利用可能なデータを提供するあらゆる帯域の電磁スペクトルを用いることが可能である。紫外、可視、及び／又は近赤外スペクトルや、電磁スペクトルの他帯域の放射を行う光源を用いることが可能であり、これらは当業者に既知である。例えば、光源は、紫外光を生成する重水素又はキセノンアークランプや、可視／近赤外励起光を生成するタングステンハロゲンランプのような連続スペクトルランプとすることができる。これらの光源は放射帯域が広く、当業者間によく知られている光学干渉フィルタ、プリズム、及び／又は光学グレーチングを使用することで特定の励起波長のスペクトル帯域を低減することができる。

或いは、発光ダイオード及び／又はレーザのような複数の狭帯域光源を空間的に重ね合わせて多重波長励起源を構成することも可能である。例えば、発光ダイオードは１９０ｎｍ〜９００ｎｍ超の波長が可能であり、ソースは２０〜４０ｎｍ（半値全幅）のスペクトル帯域幅を有する。紫外線ないし近赤外波長の離散波長のレーザーが利用可能であり、当業者に既知の方法で多重化して採用することができる。

走査モノクロメータのようなスペクトル弁別手段を用いることで、あらゆる光源のスペクトル選択性を改善することができる。当業者に知られているように音響光学的可変フィルター、液晶可変フィルター、光学干渉フィルターのアレイ、プリズム分光器等、及びこれらのあらゆる組み合わせのような、他の弁別方法を採用することも可能である。スペクトル分光器の選択に当たって、可変域や選択性の程度を考慮する。例として、例えば、弁別器は、１０ｎｍの選択性で波長域３００〜８００ｎｍを利用することができる。一般的にこれらのパラメータによって、可変域と選択性を達成するために必要とされる最適な技術が定まる。

典型的に、光源は試料を励起し、その後、所定の時点又は継続的に試料から傾向が発せられるのを測定する。同様に、励起源と試料の相互作用に由来する反射光を測定して、検出及び／又はキャラクタリゼーションのための適切なデータを生成する。

試料からの放射をスペクトル弁別のためのあらゆる適切な手段（幾つかの実施形態では分光計）によって測定する。分光計は走査モノクロメータであり、特定の放射波長を検出して光電子倍増管によってモノクロメータからからの出力を検出するか、及び／又は、分光計をイメージング分光器として構成して、その出力を電荷結合素子（ＣＣＤ）のようなイメージング検出器アレイによって検出する。一実施形態では、弁別器は（光電子倍増管アバランシェフォトダイオード、ＣＣＤ検出器アレイ、及び／又は電子倍増ＣＣＤ（ＥＭＣＣＤ）検出器アレイのような）光検出手段によって蛍光及び／又は散乱信号を観察できるようにする。

分光技術を使用して、好ましくは励起発光マトリクス（ＥＥＭ）測定値として提供される測定値を取得する。本明細書で使用するＥＥＭは、励起と発光波長の両方の関数として蛍光物質の発光スペクトル発光強度と定義し、フルスペクトル又はそのサブセットを含む。この場合のサブセットは単一又は複数の励起／発光対を含む可能性がある。また、固定の励起波長を有するＥＥＭの断面を使用して特定の励起波長の発光スペクトルを示し、固定の発光波長を有するＥＥＭの断面を使用して試料の励起スペクトルを示すこともできる。一実施形態では、複数のＥＥＭを２つ以上の特定の励起‐発光波長対、例えば少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、５０又はそれ以上の特定の励起‐発光波長対で測定する。幾つかの実施形態では、測定された励起発光波長のペア数は、微生物の正確な種を決定するために十分な数であり、例えば、約５〜約３０ペア、例えば、約１０〜約２０波長ペアである。他の実施形態では励起発光波長ペア数は、少なくとも部分的には微生物を同定するのに十分な数であり、例えば、何らかの動作を行うために十分な有効情報を得るために十分な数であり、例えば、以下に記載するような分類群を同定するために十分な情報を得るために十分な数である。例えば、分類群のような、何らかの動作を行うために十分な有効情報を得るための励起発光波長ペアの適切な数は、約２〜約８ペア、例えば、約３〜約５ペアであっても良い。

本発明によれば、対照測定値（control measurement）を既知の微生物のコロニーと見なし、したがって測定したテストデータと該当する微生物のキャラクタリゼーションとの相関付けを当業者に既知の様々な数学的方法を使用して行うことが可能となる。例えば、当業者に既知のソフトウェアシステムを利用して試料からのデータとベースラインすなわち対照測定値とを比較することができる。より詳細には、データの分析をいくつかの多変量分析法、例えば一般判別分析（ＧＤＡ）、部分最小二乗法判別分析（ＰＬＳＤＡ）、部分最小二乗回帰、主成分分析（ＰＣＡ）、平行因子分析（ＰＡＲＡＦＡＣ）、ニューラルネットワーク分析（ＮＮＡ）及び／又はサポートベクターマシン（ＳＶＭ）によって行うことができる。これらの方法を使用することにより、先述したような有機体のモニタリング、検出及び／又はキャラクタリゼーションを行うシステムを設計する際に、該当する未知の微生物を有機体の代謝、病原性及び／又は毒性に基づいて既存の命名法に基づく関連群及び／又は天然群に分類することができる。

また別の実施形態では、検出システムからの検出時間や培養率のような非分光測定値を、コロニーに由来する微生物のキャラクタリゼーション及び／又は同定に役立てることができる。更に、固体又は半固体培地の写真像から得られる測定値は、コロニーサイズ、形状、色、密度といったコロニー内の微生物のキャラクタリゼーション及び／又は同一性に関する有益な情報をもたらすことができる。

本発明のいくつかの実施形態では、コロニー中の微生物のキャラクタリゼーション及び／又は同定において必ずしも正確な種の同定を行う必要はない。キャラクタリゼーションは、生物学的粒子の広範なカテゴリ分け又は分類だけでなく単一の種の実際の同定も包含する。コロニーに由来する微生物の分類は、微生物の表現型及び／又は形態学的特徴の決定を含む可能性がある。例えば、生物学的粒子のキャラクタリゼーションは組成、形状、サイズ、クラスタリング及び／又は代謝のような観察可能な差異に基づいて達成することができる。いくつかの実施形態では、該当する生物学的粒子の分類を行うにあたって所与の生物学的粒子の特徴に関する予備知識の必要をなくすことができるが、経験的測定値との一貫性のある相関付けが必要となる。このため、本方法は特定の結合事象又は代謝反応に基づく方法よりも汎用性が高くなり、容易に適合可能となる。本明細書で使用する「同定」とは、未知の微生物がどの科、属、種及び／又は株に属するのか判定すること、例えば未知の微生物を科、属、種及び／又は株レベルで同定することを意味する。

いくつかの例において、キャラクタリゼーションはアクションを起こすのに十分有用な情報をもたらす分類モデルを包含する。本明細書で使用する好ましい分類モデルは、（１）グラム群、（２）臨床グラム群、（３）治療群、（４）機能群、及び（５）天然固有蛍光群のうちの１つ又は複数の群への分類を含む。

（１）グラム群：このグラム群分類では、各微生物をそれぞれのグラム染色反応及び全体のサイズに基づいて３種類の広範な分類カテゴリのうちの１つに含めることができる。前記群は下記のうちの１つ又は複数から選択される。（ａ）グラム染色で紺青色に染色するグラム陽性微生物、（ｂ）グラム染色で赤に染色するグラム陰性微生物及び（ｃ）グラム染色で紺青色に染色するイースト細胞（ただし、形態学的特徴及びサイズによってバクテリアと区別される非常に大きい円形の細胞）。

（２）臨床グラム群：このグラム群は形態学的特徴によって区別されるいくつかのサブカテゴリに更に分割することができる。これらのサブカテゴリは熟練した研究室技術者から報告された臨床的に意義のある情報をすべて含むため、陽性又は陰性グラム反応よりも高いレベルの同定を実現する。この特定の分類は下記の理由で非常に有用である。すなわち、グラム染色の品質及び／又はスミアを読み取る技術者の技術レベルに左右される懸念が、臨床的に意義のある等価な情報に自動化システムを導入することによって解消されるからである。より詳細には、この分類モデルに基づく微生物のサブカテゴリは下記のうちの１つ又は複数から選択することができる：（ａ）球菌（小さい円形細胞）、（ｂ）双球菌（互いに結合した２つの小さい円形細胞）、（ｃ）矩形の桿菌（ｒｏｄｓ）及び（ｄ）桿状の桿状菌（bacilli）。付加的な形態学的情報によって確認可能なサブカテゴリの例としては下記が挙げられる：（ｉ）グラム陽性球菌、（ｉｉ）鎖状のグラム陽性球菌、（ｉｉｉ）房状（すなわち「ブドウのような」房状）のグラム陽性球菌、（ｉｖ）グラム陽性双球菌、（ｖ）グラム陽性桿菌、（ｖｉ）内生胞子を含むグラム陽性桿菌、（ｖｉｉ）グラム陰性桿菌、（ｖｉｉｉ）グラム陰性球桿菌、（ｉｘ）グラム陰性双球菌、（ｘ）イースト及び（ｘｉ）糸状の菌類。

（３）治療群：治療群は、特定の標本タイプから単離したときに同じクラスの抗生物質又は抗生物質の混合物（「Sanford Guide to Antimicrobial Therapy 2008」参照）で処置される複数の微生物種を含む。多くの場合、臨床医が初期の経験的治療を標的療法に近付ける上で種レベルまでの同定は必要ない。というのも、２つ以上の種を１つ（又は複数）の同じ抗生物質で処置することができるからである。この分類レベルはこれらの「同じ処置の」微生物を単一の治療カテゴリに適宜含める。このキャラクタリゼーションレベルの例としては、高度耐性腸内細菌（ＥＢ）種と感受性ＥＢ種（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｐ．（エンテロバクター種）とＥ．ｃｏｌｉ（エシェリキアコリ））を区別する能力や、フルコナゾール耐性カンジダ種（Ｃ．ｇｌａｂｒａｔａ（カンジダグラブラータ）及びＣ．ｋｒｕｚｅｉ（カンジダクルセイ））と感受性カンジダ種（Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ（カンジダアルビカンス）及びＣ．ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ（カンジダパラプシロシス））を区別する能力等が挙げられる。

（４）機能群：本発明によれば、代謝、毒性及び／又は表現型特徴の組合せに基づくいくつかの群に微生物を含めることもできる。非発酵性の有機体を発酵性の有機体と明確に区別することができる。更に、溶血素を生産する微生物種を非溶血性種と別々に分類することができる。場合によっては、これらの群は属レベル（例えば腸球菌属、カンジダ属）と、より種に近いレベル（例えばコアグラーゼ陰性ブドウ球菌、α溶連菌、β溶連菌、コアグラーゼ陽性ブドウ球菌すなわちＳ．ａｕｒｅｕｓ（スタフィロコッカスアウレウス））とを区別して属レベル（例えば大腸菌、グラム陰性の非発酵性桿菌）よりも広範なカテゴリとなる。

（５）天然固有蛍光（Intrinsic Fluorescence（「ＩＦ」））群：微生物の群れを成す自然な傾向に基づき、微生物を生得的特徴及び／又は固有蛍光特徴によりカテゴリ分けすることもできる。これらの群のいくつかは治療群及び機能群のカテゴリに共通とすることができる。これらの分類は、特徴的なＩＦシグネチャ（IF signature）を有するＥ．ｆａｅｃａｌｉｓ（エンテロコッカスフェカリス）、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ（ストレプトコッカスピオゲネス）、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ（シュードモナスエルジノーサ）のような個々の種を含むことができ、且つ／又はＥ．ｃｏｌｉ−Ｋ．ｏｘｙｔｏｃａ（大腸菌‐クレブシエラオキシトカ）又はＥ．ａｅｒｏｇｅｎｅｓ（エンテロバクターエロゲネス）及びＣ．ｆｒｅｕｎｄｉｉ（シロトバクターフレンディ）群のような比較的保存されたＩＦシグネチャを有する有機体の小群を含むことができる。

同定を目的とする微生物の固有特性（固有蛍光等）の測定に加えて、本発明の方法は更に、同定プロセスに役立つ付加的な同定作用物質（identifier agent）の使用を含むことができる。親和性リガンドのような特定の微生物と結合する作用物質を使用することにより、微生物の分離、微生物のクラス又は種の同定（例えばユニークな表面タンパク質又は受容体との結合を利用）、及び／又は微生物の特徴（例えば抗生抵抗）の同定を行うことができる。有用な同定作用物質としては、それらに限らないが、単クローン及び多クローン抗体ならびにそれらの断片（例えばＳ．ａｕｒｅｕｓ同定のためのａｎｔｉ‐Ｅａｐ）、核酸プローブ、抗生物質（例えばペニシリン、バンコマイシン、ポリミキシンＢ）、アプタマー、ペプチド模倣体、ファージ由来の結合タンパク質、レクチン、宿主先天性免疫バイオマーカー（急性期タンパク質、ＬＰＳ結合タンパク質、ＣＤ １４、マンノース結合レクチン、トール様受容体）、宿主防御ペプチド（例えばデフェンシン、カテリシジン、プロテオグリン（proteogrin）、マガイニン）、バクテロシン（bacterocin）（例えばランチビオティクス（例えばナイシン、メルサシジン、エピデルミン、ガリデルミン及びプランタリシンＣ及びクラスＩＩペプチド）、バクテリオファージ及び核酸、脂質、炭水化物、多糖類、カプセル／粘液（slime）もしくはタンパク質又はそれらの任意の組合せに対して選択的な蛍光色素が挙げられる。作用物質自体が検出可能なシグナルを示さない場合は、作用物質をマーカーと共役させる（例えば可視状態にする又は蛍光性をもたせる）こと等により、作用物質を標識して検出可能なシグナルが提供されるようにすることができる。マーカーとしては、それらに限らないが、蛍光性化合物、発光性化合物、燐光性化合物、放射性化合物及び／又は比色化合物が挙げられる。作用物質は、本発明の方法の任意のステップ、例えば試料が倍地上にあるとき及び／又はコロニーを検出した後に微生物に添加することができる。いくつかの実施形態では、コロニー中の作用物質の存在及び／又は量をコロニーの解析中に判定することができる。他の有用な同定作用物質としては、微生物酵素の基質、キレート剤、洗浄剤、界面活性剤、消毒薬（例えばアルコール、漂白剤、過酸化水素）、毒性化合物（例えばアジ化ナトリウム、シアン化カリウム）、シクロヘキサミドのような代謝阻害剤等が挙げられる。同様に、微生物細胞生存度、代謝及び／又は膜電位の測定のための多くの蛍光性化合物を本発明の同定作用物質として使用することができる。

本発明の一態様において、本方法は更にコロニーから微生物を回収し付加的な試験を実行するステップを含むことができる。回収した微生物を適切な培地、例えば食塩水中に懸濁させることができる。懸濁の際は、微生物を更に当業者に知られる上述の所望の試験にかけることができる。特に、清浄な微生物試料を必要とする任意の試験を懸濁させた微生物に対して実行することができる。いくつかの実施形態では、付加的な同定試験／キャラクタリゼーション試験を実行することができる。同定試験の例としては、Ｖｉｔｅｋ（登録商標）２、増殖及び非増殖核酸試験（nucleic acid test：ＮＡＴ）、色素産生及びラテックス接着アッセイ、イムノアッセイ（例えば標識した第１又は第２抗体及び／又は他のリガンドを利用）、質量分析（例えばＭＡＬＤＩ‐ＴＯＦ質量分析）及び／又は赤外分光法（ＦＴＩＲ）やラマン分光法のような他の光学的技法が挙げられる。薬物耐性、耐性記録、及び／又は毒性因子のような付加的なキャラクタリゼーション試験も実行することができる。付加的なキャラクタリゼーションは、本方法の最初の同定ステップ中に開始した試験の一部とすることもできる。例えばメチシリン耐性Ｓ．ａｕｒｅｕｓの検出では、まず、コロニーの増殖に先立って蛍光標識したペニシリンを試料に加えることができる。そして、例えばコロニー内又はコロニーから回収した微生物内の結合したペニシリンの存在及び／又は量を判定することができる。ある実施形態では、同定ステップを実行可能な同一のシステム内（例えば、同じ装置内）で複数の追加試験を実施することができる。一実施形態では、特定の追加試験を多数の実施可能な試験から、行われる同定に基づいて選択することができる。

本発明の一態様では、方法ステップの一部又は全部を自動化することができる。本明細書で用いる用語「自動化」は、コンピュータ制御を意味する。一実施形態では、様々な蛍光発光検出及び相関ステップが自動化され、この方法によって得られた情報はデータベース構築に自動で利用される。更なる実施形態では、コロニーの検出及び解析のような方法に含まれる他のステップを自動化することもできる。方法ステップを自動化することによってより多くの試料をより迅速に試験することが可能となるだけでなく、有害性及び／又は感染性のある微生物を含む恐れがある試料を取り扱う際の人為的ミスのリスクを低減し、さらに、試料を汚染する機会及び／又は試料を扱う人と試料とが接触する機会を低減することができる。一実施形態では、本発明は固体又は半固体培地上の微生物を検出及び／又は同定するシステムに関し、このシステムは分光光度計及びレンズ系又は顕微鏡のような合焦光学系を備える。他の実施形態では、システムは更に培地表面を走査する機構及び／又は培地の環境（例えば、培養環境）を制御する機構を備える。

本発明の1つの観点は固体又は半固体培地上のコロニーの検出に関連するものである。検出後に、任意でコロニー内の微生物の同定／キャラクタリゼーションを行う。一実施形態では、試料を配置していた培地を手動で走査してコロニーの存在を調べる。一実施形態では、肉眼で視覚的にコロニーを検出する。他の実施形態では顕微鏡を用いてコロニーを検出する。例えば、培地は顕微鏡かで観察することができ、この場合、顕微鏡ステージに配置した培地を顕微鏡対物レンズの下で手動で動かして培地の一部分についてコロニーの存在を調べる。培地自体を手動で動かす（例えば、培地を含むプレートを移動させる）ことによって、又は、培地が配置されている顕微鏡ステージを動かすことによって、培地を動かすことが可能である。他の実施形態では、走査を自動で行うこともできる。一実施形態では、電動式顕微鏡ステージをプログラムして、対物レンズの下で培地表面を横断する探査パターンで動かして、培地の各部分が順番に観察できるようにすることができる。他の実施形態では、培地を静止保持してレーザーのような合焦光線で培地を横断的に操作して、放出光をイメージング又は非イメージング検出器で検出する。一実施形態では、励起光の大きさに応じて培地を等分して（例えば、約１００、２５０、５００、又は１０００μｍ^２以上）、顕微鏡ステージをインクリメント毎にステップ移動させて、各部分が対物レンズの下にきて解析できるようにすることができる。他の実施形態では、培地を大縮尺で（例えば、プレート全体又はプレート中の大きな部分（例えば、１／２、１／３、１／４１、１／１０以下））観察してコロニーを調べることができる。いずれの実施形態でも、コロニーの位置は培地の走査によって生成したマップに基づいて決定される。位置実施形態では、顕微鏡ステージをプログラムして、検出された各コロニーへと順番に移動させて各コロニーのＩＦスペクトルを取得する。一実施形態では、手動又は自動走査を定期的な間隔（例えば、０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、１０、又は１２時間後と又はそれ以上）で繰り返して、コロニーの出現及び／又は成長をモニタリングする。本発明の一実施形態では、可視光を用いて培地を走査してコロニー（例えば、顕微鏡かで観察可能な程度に大きいコロニー）を検出する。他の実施形態では、培地を照射してコロニーの自家発光特性（例えば、ＩＦ）を検出する。培地のバックグラウンドレベルを超えるＩＦのピークは、コロニーの存在を示唆する。例えば、（レーザーのような）走査励起ビームと、簡易な非イメージング検出器を用いて培地の蛍光マップを構築することができる。他の実施形態では、国際公開第０３／０２２９９９号パンフレット及び米国特許第５，９１２，１１５号、第６，１５３，４００号、第６，２５１，６２４号明細書に記載のように、イメージキャプチャ／取得装置（例えば、ＣＣＤリニアアレイ、ＣＣＤラインスキャンカメラ、ＣＣＤ２Ｄアレーカメラ、レーザスキャンカメラ、又はその他の装置のようなカメラ又はスキャナ）を用いた広域イメージングを利用することができる。

本発明のある実施形態では、検出方法は、検出された微生物の同定を伴って又は伴わずに試料内の微生物の存在を検出するために用いることができる。幾つかの実施形態では、検出方法を使用して試料（例えば、食品、医薬品、飲料水等）の微生物による汚染をモニタリングすることができる。一実施形態において、本方法は汚染の有無を絶えずモニタリングするために反復的に実行することができ、例えば１か月に一度、１週間に一度、１日に一度、１時間に一度又は他の時間パターンで実行することができる。別の実施形態では、試料を必要に応じて、例えば汚染が疑われるとき又は汚染が無いことを確認する必要があるときに試験することができる。更なる実施形態では、これらの検出方法を使用して臨床試料、例えば創傷又は血液培養物中の微生物の有無を調べることができる。例えば、特定の時点で血液培養物から試料を取り出し、その試料に対して検出方法を実行することにより血液培養物が陽性であるかどうかを判定することができる。一実施形態では、培養物の接種後のある設定時点、例えば接種の２４時間後に試料を採取して血液培養物が陽性であるかどうかを判定することができる。他の実施形態では、血液培養物から試料を定期的に、例えば１２、６、４、２、１又は０．５時間毎に採取して陽性検出可能な陽性血液培養物を短い時間で同定することができる。検出方法のいくつかの実施形態では、本明細書に記載するように、任意選択で検出ステップ後に同定／キャラクタリゼーション方法を実行することができる。他の実施形態、特に試料の反復的なモニタリングを含む実施形態では、検出方法を部分的に又は完全に自動化する。

ある実施形態では、本発明による方法を微生物ではなく動物又は植物細胞について実施することができる。特に、動物細胞（例えば、哺乳類細胞、鳥類細胞、昆虫細胞）若しくは植物細胞であって、コロニー、クランプ、若しくは他の３次元構造で成長するもの、又は３次元基板上で成長するものについて、本明細書に記載した技法を用いて検出、モニタリング、キャラクタリゼーション、及び／又は同定することができる。３次元コロニーで成長する適切な細胞は、例えば肝細胞、線維芽細胞、及び腫瘍細胞であるが、この限りではない。

下記の実施例では本発明について更に詳細に説明するが、下記の実施例は例示的なものであり本発明を決して限定するものではない。利用した技法は当業者に周知の標準的な技法又は後で具体的に説明する技法である。

［実施例１］
プレート及び膜上のコロニーからのスペクトルの取得

ブラックメンブレンが有る／無い場合に、血液寒天培地（ＢＡＰ；５％ヒツジ血液含有トリプシン大豆寒天）上からダイレクトにコロニーの有効スペクトルを得ることができるかを判定するために試験を実施した（表１)。表２に示すようにＥ．ｃｏｌｉ（ＥＣ）、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ（ＳＡ）、Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓ（ＥＦ）、及びＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ（ＰＡ）のコロニーを成長させて、光ファイバーアダプターによってＦｌｕｏｒｏｇ３分光計（ニュージャージー州エジソン、Ｈｏｒｉｂａ Ｊｏｂｉｎ Ｙｖｏｎ社）及びＰＭＴ検出器に接続されたＵＶ顕微鏡（×１０対物レンズ）を用いてスペクトルを取得した。スリット幅５ｎｍで５ｎｍごとに、励起（Ｅｘ）＝２６０〜５５０ｎｍ、発光（Ｅｍ）＝２８０〜６００ｎｍの波長域を通じてＥＥＭを取得した。示唆があった場所では、解析範囲を１ｍｍピンホールを照射パスに配置することで、観察領域を約０．１ｍｍに狭めた。ピンホールを使用しない場合、コロニーに投影される励起及び発光の光の円は、直径約１ｍｍほどであった。各試行にて含まれた試料を表２に示す。

膜：
無し＝ヒツジ血液観点（ＳＢＡ）
ポール＝ポール社製グリッド付きメトリセルブラックポリエーテルスルホンメンブレン（ＳＢＡ上）
ＷＰＣ＝ワットマン社製トラックエッチポリカーボネートブラックメンブレン（ＳＢＡ上）
ＷＭＥ＝ワットマン社製ブラック混合エステルメンブレン（ＳＢＡ上）

接種していないプレートについての試行Ａ２によるスペクトルを図１Ａ〜１Ｄに示す。各図において縦軸はＥｘの波長域であり、横軸はＥｍの波長域である。スペクトルは、微生物の存在しない状態のＢＡＰ（図１Ａ）、ポール社製メンブレン（図１Ｂ）、ＷＭＥメンブレン（図１Ｃ）、及びＷＰＣメンブレン（図１Ｄ）から取得した。最初の観察は、ＢＡＰと、ポール社製及びワットマン社製メンブレンの間のバックグラウンド蛍光の差について行った。予想外に、ブラックポールメンブレンは、膜で覆っていないＢＡＰの場合よりも、微生物懸濁液の分類に重要とされていたスペクトル領域にて強い蛍光を示した。しかし、ＷＭＥメンブレンは全ての中で最小のバックグラウンド蛍光を示した。

ＷＭＥメンブレン（ＢＡＰ上）上のコロニーの試行Ａ３からのスペクトルを図２Ａ〜２Ｃに示す。スペクトルは、ＥＣ３（図２Ａ）及びＳＡ１（図２Ｂ）から取得し、ＳＡ１のスペクトルからＥＣ３のスペクトルを差し引いた結果を図２Ｃに示す。コロニーのスペクトルは、Ｓ．ａｕｒｅｕｓとＥ．ｃｏｌｉとの明確な差異を示す。スペクトルの幾つかの部分はＥ．ｃｏｌｉのために高く、他の部分はＳ．ａｕｒｅｕｓのために高くなっているという事実は、差異は単純な輝度の大きさに違いとしてではなく、全体のパターンの差異として現れるということを示す。

膜の無いＢＡＰ上のコロニーの試行Ｂ１からのスペクトルを図３Ａ〜３Ｄに示す。スペクトルは、ＥＣ１（図３Ａ）、ＳＡ１（図３Ｂ）、ＥＦ１（図３Ｃ）、及びＰＡ１（図３Ｄ）から取得した。ブラックメンブレンの無いＢＡＰ上で直接測定したにも関わらず、様々な測定パラメータでＡ３スペクトルよりもかなり高輝度を示したが、相対的なパターンは各バクテリアの種のパターンに依然として類似している。

これらの実験は、バックグラウンド蛍光の低減のためにブラックメンブレンを用いる／用いないＢＡＰ上でダイレクトにコロニーの自家蛍光スペクトルを顕微鏡で取得することができ、観察されたパターンは様々な種類の微生物について特徴的であったということを示した。

［実施例２］
顕微鏡によるマイクロコロニーの走査

顕微鏡下で成長する電動ステージ上のコロニーをポイント−バイ−ポイントＩＦ測定を用いて位置合わせし、検出された各コロニーについてのＩＦスペクトルを自動で収集することができるか判定するために試験を実施した。ＵＶ顕微鏡を、蛍光励起源及び発光測定装置として機能するＦｌｕｏｒｏｌｏｇ３（ニュージャージー州エジソンＨＯＲＩＢＡ Ｊｏｂｉｎ Ｙｖｏｎ社）分光計に光ファイバーケーブルを介して接続した。この顕微鏡の電動ステージには、３６度に設定された循環温浴からの供給を受ける管が巻きつけられた小型プレート培養器が備えられている。培養器は水晶製カバースリップからなるＵＶ透過窓を備えている。図３に示すように、種々の寒天培地に拡散法（spread method）でＥ．ｃｏｌｉ ＡＴＣＣ ２５９２２（ＥＣ）及び／又はＳ．ａｕｒｅｕｓ ＡＴＣＣ ２５９２３（ＳＡ）を接種した。いくつかの試行では、ブラックワットマン混合エステル（ＷＭＥ）メンブレン又は炭のいずれかの光遮断素材を用い、培地自体からの蛍光を低減させた。

接種後、顕微鏡の電動ステージをプログラムして、探索グリッドで周期的に寒天プレートを横断して、１つ以上の励起／発光波長ペアで各ポイントにて蛍光を測定した。Ｆｌｕｏｒｏｌｏｇ３をプログラムして、スリット幅を１０μｍ、積分時間を５００ｍｓ（試行Ａ〜Ｅ）又は１０００ｍｓ（試行Ｆ〜Ｈ）に設定した。顕微鏡内の励起ビーム中にピンホールを配置して、寒天の表面に投影される励起ビームは約０．１ｍｍに絞った。このビームサイズに対応して、顕微鏡ステージを０．１ｍｍインクリメントでステップさせて、１０ステップで１ｍｍ進むようにした。発光ビームはピンホールで制限せず、顕微鏡は測定の間覆い、励起光によって生成されていない迷光が検出されないようにした。

試行Ｇ及びＨのために、アルゴリズムを開発して、成長するコロニーの位置を自動で算出できるようにした。試行Ｈのために、プログラムを更に改良して、検出された全てのコロニーが顕微鏡ステージが順番にそれらの位置に移動し、ＩＦスペクトルを収集するようにした。収集されたスペクトルは、全マトリクススキャンのサブセットであり、必要とされる取得時間を削減するために選択された３００ＥＥＭポイントを含んだ。さらに、時間の観点から装置を僅か１０コロニーのスペクトルを取得するようにプログラムした。

試行Ａでは装置に問題が生じ、６時間後に停止した。この間にコロニーは検出されなかった。

試行Ｂでは、８時間の時点でバックグラウンド蛍光を辛うじて上回る１つのコロニーが検出され、１０時間の時点で２つの明りょうに視認できるコロニーが検出され、１２時間以降には３つの明りょうに視認できるコロニーが検出された。コロニー信号とバックグラウンドとの差は、４４０〜５２５ｎｍ（およそバックグラウンドの４倍）で、３０５〜３６５ｎｍ（およそバックグラウンドの２倍）よりも大きかった。

試行Ｃでは、接種材料が少なかったため走査領域内でコロニーは検出されなかった。

試行Ｄでは８時間の時点で１つのコロニーが検出され、１０時間以降に３つのコロニーが検出された。

試行Ｅでは、最初視野内にコロニーが検出されなかった。１２時間の時点で１つのコロニーが視野の端にて成長し、１４時間以降に３つのコロニーが検出された。

試行Ｆは混合接種材料を含み、８時間までに１０個のＥＣと判定されたコロニーを生成し、１０時間までに３つのＳＡコロニーを生成し、１２時間以降に更に２つのＳＡコロニーを生成した。試行Ｆのポイント−バイ−ポイントＩＦサーチ走査の３次元プロットを図４Ａ〜４Ｆに示す。高さは蛍光輝度に相当する。プロットによれば、最初に検出されたコロニーを、６時間（図４Ａ）、８時間（図４Ｂ）、１０時間（図４Ｃ）、１２時間（図４Ｄ）、１６時間（図４Ｅ）、及び２４時間（図４Ｆ）で観察した。８時間時点で視認可能な全てのコロニーはＥ．ｃｏｌｉであり、１０時間以降に観察可能な追加のコロニーはＳ．ａｕｒｅｕｓであった。試行Ｆの２４時間以降のＢＡＰの拡大図にサーチ走査領域の矩形を付して図５Ａに示し、対応するコロニーの位置を示す１２時間の時点におけるサーチ走査から得た蛍光輝度の等高線図を図５Ｂに示す。

試行Ｇでは８時間の時点で１つのＥＣコロニーが、９時間の時点で２つのＥＣコロニーが検出された。１０時間及び１２時間の時点で装置にエラーが発生してデータの取得た停止したが、１２時間の時点で装置を再起動したときに、５つのコロニー（２つのＥＣコロニーと３つのＳＡコロニー）が検出された。コロニー検出アルゴリズムによって５つのコロニー全ての位置を同定することに成功した。

試行Ｈでは、３つのＥＣコロニーが検出されスペクトルが取得された時点である９時間以前に行った全ての走査で、赤外光が観察窓（observation window）に集中した。同一の３つのＥＣコロニーがその後の走査でも検出され、１３時間の開始時点で、４つのＳＡコロニーも検出されてスペクトルが取得された。

このような実験結果は、微生物を寒天プレート上で直接成長させている状態で、背景遮断膜又は炭の使用の有無に関わらず、自家蛍光を用いて微生物のマイクロコロニーの有無及び数を検出することができることを示した。さらに、位置合わせを行えば分類のためにマイクロコロニーのフルスペクトルを比較的簡単に簡単にインサイチュで取得できる。

［実施例３］
寒天プレート上の微生物コロニーの分類

試験を実施して、微生物コロニーがそれらが成長した寒天プレート上から直接取得したＩＦスペクトルによって分類可能であるか判定した。

それぞれ、波長２６０〜５８０ｎｍ、２６０〜６８０ｎｍの励起（Ｅｘ）及び発光（Ｅｍ）マトリックスにわたって、３３０個のＥＥＭポイントのサブセットを選択して、スペクトルを取得し所要取得時間を短縮した。更に、（Ｅｘ＝Ｅｍの場合の）全ての反射波長を読み込んだ。蛍光については、スリット幅は５ｎｍバンドパス、積分時間１０００ｍｓに設定した。各３００ポイントの取得を完了するために、およそ８．１分を要した。

表４に試験された微生物を示す。２０種のそれぞれについて６つの単離株を含み、トータルで１２０回の試験を行った。種とは異なるグループ分けとして用いられた、用語「臨床グラム（Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｇｒａｍ：ＣｌｉｎＧｒａｍ）は、グラム染色を解読する高い技術を有する観察者によって可能な分類レベルを意味し、これは単に陽性、陰性、又は酵母（表５）といった分類ではない。例えば、ブドウ球菌はクラスタ状のグラム陽性球菌であり、多くの連鎖球菌は鎖状のグラム陽性球菌である。

表５は、「Ｌｅａｖｅ‐ｏｎｅ‐ｏｕｔ」交差検定法を用いステップ前進線形判別分析法（Forward Stepwise Linear Discriminant Analysis）による分類モデリングの結果を示す。「Ｌｅａｖｅ‐ｏｎｅ‐ｏｕｔ」交差検定法を選択したのは、小さいデータセットを効率よく利用できるからであり、他の多くの試験のように２回試験を実施することなく、多くの「不明」試料を「教師」セットと同等に試験したかのように結果を推定できるからである。表中、「ＤＡステップ数」は判別分析ステップの完了数を示し、これは、示唆された結果を生成するために用いられたＥＥＭポイントの実際の数である場合とそうではない場合がある。典型的には、ステップ数はモデル中のＥｘＥｍポイントの数に等しいが、幾つかのステップでは、ポイントが移動したときにモデルポイント数は増えるというよりは少なくなる。

判別分析はデータ中のランダムな変動における誤った相関を抽出することができる。十分に「ノイズの多い」データポイントが相当数あった場合、交差検定は所与の分類モデルの真の成功率を推定するために重要である。概して、交差検定されていない結果はステップ数が増加するにつれて１００％正確であるとされがちであるが、交差検定された結果はピークに達した後に低下する。交差検定ピーク付近のステップ数のモデルが、所与のデータセットについて最適であると考えることができる。表５は、交差検定結果が最適な時点における、交差検定を行った場合及び行わなかった場合の各分類モデル試行結果を示す。

判別分析による各微生物についての分類は、他の選択が以下に近い選択であったかに関わらずモデルによって最初に選択された分類が微生物の実際の識別属性であった場合に正確と判断した。さらに、表５には、微生物の実際の識別属性がモデルによる上位３つの選択に入っていた微生物の数及び割合を示し、完全で無いにしろこれらの値は分類モデルの予測が良好であることを示す。

コロニーから得たスペクトルは微生物の分類可能性を明示する。隣接する２つのＥｘＥｍポイントをビニングすることで結果が改善されるということから示唆されるように、データには大抵ノイズが含まれる。２つの既知の要因、すなわちコロニー上の測定ビームの位置が不整合であることに由来すること、及び装置を経て検出器に到達する光量が少ないことがノイズの多いデータに寄与する。本例では、顕微鏡カメラで励起ビームをコロニーの中心に位置合わせすることは、可視化に利用することができる光は最適でなかったため難しい。実際、位置合わせがオフになっていたのを修正されたと見られる場合もあったが、他の位置合わせ誤差は気づかれないままであったように見られた。検出器に到達する蛍光エネルギーの量は微生物の懸濁液の１／１０００以下であったので、蛍光シグナル自体におけるノイズも大きかった。これは、光ファイバーと顕微鏡の構成は柔軟な研究ツールであるがこのような測定に最適化されたものではないからである。このようなタスクのために設計された光学系によってこのような問題は容易に解消することができる。

［実施例４］
ノイズの少ないコロニーの分類の改良

試験を実施して、位置合わせを改善し、光のスループットを増加させることで自家蛍光を用いた微生物コロニーの分類を改善することができるかを判定した。実施例３に記載の実験を同じ装置及び同じ微生物系統と、改良した方法を用いて反復した。同じ励起（Ｅｘ）及び蛍光（Ｅｍ）帯域（Ｅｘ＝２６０〜５８０ｎｍ、Ｅｍ＝２６０〜６８０ｎｍ）と、スペクトルの主要領域をカバーするとともに上述したようなサブセットよりも値のビニングを促進することができる異なる３１２の波長のサブセットを用いてスペクトルを取得した。サブセットを利用する主たる理由は本例における装置を用いてスペクトルを収集するための所要時間を短縮することにある。モノクロメータスリット幅を、これまでの５ｎｍから７ｎｍバンドパスに広げ、測定される蛍光をおよそ２倍に増加させた。積分時間を１０００ｍｓに維持し、各回の取得は約９．８分で完了した。

表６は、「Ｌｅａｖｅ‐ｏｎｅ‐ｏｕｔ」交差検定法を用いステップ前進線形判別分析法（Forward Stepwise Linear Discriminant Analysis）による分類モデリングの結果を示す。上述のように、他の選択が以下に近い選択であったかに関わらずモデルによって最初に選択された分類が微生物の実際の識別属性であった場合に分類が正確であると判断した。主レベルの分類性能を各データポイント（ビニング無し）、ＥｘＥｍマトリクス上で「Ｌ」の字に隣接する３つの蛍光読取値をビニングした値、矩形状に隣接する４つの隣接するＥＥＭポイントをビニングした値に基づいて示す。また、臨床グラムレベルの分類は「３Ｌ」でビニングした値を用いて示す。

蛍光読取値と増加させた光のスループットとを結びつけるために方法を変更することで、実際に分類成功率が改善された。主たる改善の中でも、位置合わせの改善は光のスループットを増加させることよりも性能向上への寄与が大きかった。さらに、各コロニー内で２以上の位置からの蛍光読取値を取得することで更に分類精度を向上させることができる。本例における装置の制約により、スペクトル解像度を損なうことも走査時間をほとんど増加させることも無く、信号を適度に２倍に増加させることが可能となるに過ぎず、依然として蛍光スペクトル内に読み取りノイズがかなり存在する。

隣接ポイントをビニングすることで、分類成功率に影響を及ぼす他の要因に正の影響を与えることなく読取ノイズを部分的に改善することができるが、これによってスペクトル解像度は減少してしまう。ビニングによる補助は、最適化システムにおいて読み取りノイズを改善するためにはスペクトル解像度が幾らか犠牲となることを示唆する。しかし、ビニングによる改善は、これらのデータ及び従来の方法の結果の間の差異ほど大きくは無い。このことは測定の位置合わせがより大きな役割を果たすことを示す。当業者に利用可能な自動位置合わせ及び最適化光学系によって分類成功率をさらに改善することができる。

上記の説明は本発明を例示するものであり、本発明を限定するものと解釈すべきではない。本発明は添付の特許請求の範囲で定義されるものであり、各請求項には均等物も含まれる。本明細書に列挙した刊行物、特許出願、特許、特許文献及び他の参考文献はすべて、参照する文及び／又は段落の教示内容全体が本明細書に援用されるものとする。

Claims (9)

1. 固体又は半固体培地上の微生物を検出及び同定する方法であって、
   （ａ）１以上の微生物コロニーを含むことが既知である又は含む可能性がある固体又は半固体培地を走査して前記培地上のあらゆるコロニーを検出するステップと、
   （ｂ）前記ステップ（ａ）で検出した１以上のコロニーを、１０００μｍより小さい直径を有する励起ビームによって、直接、解析して、前記コロニー内の微生物の自家蛍光（ＩＦ）測定値特性を生成するステップと、
   （ｃ）前記自家蛍光（ＩＦ）測定値に基づき、励起発光マトリクス（ＥＥＭ）を判定するステップを含み、該ＥＥＭは少なくとも２つの異なる波長ペアを含み、
   （ｄ）前記ＥＥＭを既知の微生物のＥＥＭのデータベースと分類モデリング分析によって比較するステップを含み、
   （ｅ）前記分類モデリング分析に基づいて前記コロニー内の前記微生物の同定を行うステップとを含み、該同定は、科、属、種、及び／又は株を決定することを意味することを特徴とする方法。
2. 請求項１に記載の方法であり、前記走査は、前記固体又は半固体培地の表面のポイント−バイ−ポイント走査であることを特徴とする、方法。
3. 請求項１に記載の方法であり、前記コロニーは直径５０μｍ未満のマイクロコロニーであることを特徴とする、方法。
4. 請求項１に記載の方法であり、解析する前記ステップは非侵襲的であることを特徴とする、方法。
5. 請求項１に記載の方法であり、前記培地又は試料に対して微生物を種に同定するための同定作用物質を添加するステップを更に含み、コロニー又は該コロニーから回収した微生物内の前記同定作用物質の有無に部分的に基づいて同定を行い、
   前記同定作用物質は、親和性リガンドであることを特徴とする、方法。
6. 請求項１に記載の方法であり、前記固体又は半固体培地は１種以上の前記微生物の成長に有益な栄養素及び１種以上の添加物を含有し、前記１種以上の添加物は前記固体又は半固体培地上の前記微生物コロニーの自家蛍光測定値を強化することを特徴とする、方法。
7. 請求項６に記載の方法であり、前記１種以上の添加物は、タンパク質加水分解物、アミノ酸、肉及び野菜抽出物、炭水化物源、緩衝剤、蘇生剤、増殖因子、酵素補助因子、無機塩類、補助金属、還元化合物、キレート剤、感光剤、消光剤、還元剤、酸化剤、洗剤、界面活性剤、殺菌剤、選択剤、代謝阻害剤を含む群から選択されることを特徴とする、方法。
8. 請求項１に記載の方法であり、前記コロニーの解析は、エピ蛍光の測定ステップを含むことを特徴とする、方法。
9. 請求項１に記載の方法であり、前記コロニーの解析は、反射光を測定するステップを含むことを特徴とする、方法。

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