CN113493815A - 一种水质中微生物的测定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及微生物检测技术领域，具体涉及一种水质中微生物的测定方法，包括以下步骤；1)培养基的制备；2)接种：菌落总数的接种以无菌操作方法用灭菌吸管吸取1ml充分混匀的水样，注入灭菌平皿中，倾注约15ml融化并冷却到40‑50℃的营养琼脂培养基，旋摇平皿，使水样与培养基充分混匀。同时做平行及空白对照；总大肠菌群的接种为取10ml水样接种到10ml双料乳糖蛋白胨培养液中；3)培养；4)记录及结果观察：菌落总数结果采用直接计数；总大肠菌群若初发酵有产酸产气现象则进行进一步分离培养，在EMB平板上有典型菌落特征则进行证实试验并对照MPN表查询，确定最终检测结果。
Description
技术领域
本发明涉及微生物检测技术领域，具体涉及一种水质中微生物的测定方法。
背景技术
水质检测过程中，微生物主要检测指标包括菌落总数、总大肠菌群、耐热大肠菌群、大肠埃希氏菌群等，该类指标的检测结果能够反应水质是否存在污染或者卫生安全，是人类饮水安全的基本保障。
然而，偏远(僻)地区水质微生物检测项目在采样的过程中，采样方式、采样设备及盛装水质样品的采样得严格按照相关国家标准要求操作的前提下，运输距离及储藏方式等因素是否对微生物的检测结果是否存在影响，成为问题。
发明内容
有鉴于此，本申请提供一种水质中微生物的测定方法，针对目前的检测方法的采样的过程中，采样方式、采样设备及盛装水质样品的采样袋严格按照相关国家标准要求操作的前提下，运输距离及储藏方式等因素是否对微生物的检测结果是否存在影响。
为解决以上技术问题，本发明提供的技术方案是1.一种水质中微生物的测定方法，包括以下步骤：
1)培养基的制备：菌落总数的培养基为营养琼脂，大肠菌群的培养基主要为乳糖蛋白胨、EMB平板等制备过程同营养琼脂；
2)接种：菌落总数的接种以无菌操作方法用灭菌吸管吸取1ml充分混匀的水样，注入灭菌平皿中，倾注约15ml融化并冷却到40-50℃的营养琼脂培养基，旋摇平皿，使水样与培养基充分混匀。同时做平行及空白对照；大肠菌群的接种为取10ml水样接种到10ml双料乳糖蛋白胨培养液中，取1ml水样接种到10ml 单料乳糖蛋白胨培养液中，另取1ml水样注入到9ml灭菌生理盐水中，混匀后吸取1ml(即0.1ml水样)注入到10ml单料乳糖蛋白胨培养液中，每一稀释度接种5管；
3)培养：将上述样品置36℃±1℃培养箱内，菌落总数培养48h，大肠菌群培养培养24h士2h；
4)记录及结果观察：菌落总数结果采用直接计数；大肠菌群若初发酵有产酸产气现象则进行进一步分离培养，在EMB平板上有典型菌落特征则进行证实试验并对照MPN表查询，确定最终检测结果。
本申请与现有技术相比，其详细说明如下：本发明解决了生活饮用水水质在不同运输距离及储藏条件下中微生物指标到达实验室进行检测，其结果是否具有一定的稳定性，提供一定的数据支撑及理论依据，同时，在野外及偏远地区涉及微生物该类别相关项目的检测及操作时，具有理论指导意义。本发明优化了不同水质在不同的储藏温度和时间条件下，评价出对不同微生物指标结果的影响情况，测试结果更加可靠，对野外偏僻地区以及距离较远地区微生物相关项目的检测具有指导意义。
具体实施方式
为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明。
实施例1
一种水质中微生物的测定方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)培养基的制备：菌落总数的培养基为营养琼脂，大肠菌群的培养基主要为乳糖蛋白胨、EMB平板等制备过程同营养琼脂，在做好培养基验收的前提下根据供应商所提供的说明书进行高压灭菌处理即可；大肠菌群的培养基主要为乳糖蛋白胨、EMB平板等制备过程同营养琼脂；
2)接种：菌落总数的接种以无菌操作方法用灭菌吸管吸取1ml充分混匀的水样，注入灭菌平皿中，倾注约15ml融化并冷却到40℃的营养琼脂培养基，旋摇平皿，使水样与培养基充分混匀。同时做平行及空白对照；大肠菌群的接种为取10ml水样接种到10ml双料乳糖蛋白胨培养液中，取1ml水样接种到10ml 单料乳糖蛋白胨培养液中，另取1ml水样注入到9ml灭菌生理盐水中，混匀后吸取1ml(即0.1ml水样)注入到10ml单料乳糖蛋白胨培养液中，每一稀释度接种5管；
3)培养：将上述样品置35℃培养箱内，菌落总数培养48h，大肠菌群培养培养22h；
4)记录及结果观察：菌落总数结果采用直接计数；大肠菌群若初发酵有产酸产气现象则进行进一步分离培养，在EMB平板上有典型菌落特征则进行证实试验并对照MPN表查询，确定最终检测结果。
实施例2
一种水质中微生物的测定方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)培养基的制备：菌落总数的培养基为营养琼脂，大肠菌群的培养基主要为乳糖蛋白胨、EMB平板等制备过程同营养琼脂，在做好培养基验收的前提下根据供应商所提供的说明书进行高压灭菌处理即可；大肠菌群的培养基主要为乳糖蛋白胨、EMB平板等制备过程同营养琼脂；
2)接种：菌落总数的接种以无菌操作方法用灭菌吸管吸取1ml充分混匀的水样，注入灭菌平皿中，倾注约15ml融化并冷却到45℃的营养琼脂培养基，旋摇平皿，使水样与培养基充分混匀。同时做平行及空白对照；大肠菌群的接种为取10ml水样接种到10ml双料乳糖蛋白胨培养液中，取1ml水样接种到10ml 单料乳糖蛋白胨培养液中，另取1ml水样注入到9ml灭菌生理盐水中，混匀后吸取1ml(即0.1ml水样)注入到10ml单料乳糖蛋白胨培养液中，每一稀释度接种5管；
3)培养：将上述样品置36℃培养箱内，菌落总数培养48h，大肠菌群培养培养24h；
4)记录及结果观察：菌落总数结果采用直接计数；大肠菌群若初发酵有产酸产气现象则进行进一步分离培养，在EMB平板上有典型菌落特征则进行证实试验并对照MPN表查询，确定最终检测结果。
以实施例2为例，本发明具体操作如下：
选取偏远地区的不同水质为样本，分别编号为1-50号，通过不同运输温度条件和不同时间条件下，对以上编号按照相关标准要求，其对不同微生物指标检测结果的影响的相关性。
研究对象
微生物种类：限边远地区的水样中菌落总数、大肠菌群、耐热大肠菌群(粪大肠菌群)、大肠埃希氏菌群的接种。
水质：指地表水、地下水和生活饮用水。
边远地区：指距离实验室较远，采样后无法按微生物接种时限将样品送达实验室检验的地区。(24h内送达实验室的水样)
主要设备
冰箱、生化培养箱、超净工作台、水浴锅、漩涡式混匀器等相关实验器材。
耗材
一次性消毒手套、口罩、帽子，75％医用酒精，脱脂棉、记号笔、记录本、废物收集袋等。
方法依据
《生活饮用水标准检验方法微生物指标》(GB/T5750.12-2006)。
操作步骤
一、采样：所有水样均依照无菌操作程序采样，同一水样均采取两份
二、实验过程及结果
1、培养基的制备：菌落总数的培养基为营养琼脂，在做好培养基验收的前提下根据供应商所提供的说明书进行高压灭菌处理即可；大肠菌群的培养基主要为乳糖蛋白胨、EMB平板等制备过程同营养琼脂。
2、接种：菌落总数的接种以无菌操作方法用灭菌吸管吸取1ml充分混匀的水样，注入灭菌平皿中，倾注约15ml融化并冷却到45℃左右的营养琼脂培养基，旋摇平皿，使水样与培养基充分混匀。同时做平行及空白对照；大肠菌群的接种为取10ml水样接种到10ml双料乳糖蛋白胨培养液中，取1ml水样接种到 10ml单料乳糖蛋白胨培养液中，另取1ml水样注入到9ml灭菌生理盐水中，混匀后吸取1ml(即0.1ml水样)注入到10ml单料乳糖蛋白胨培养液中，每一稀释度接种5管。
3、培养：将上述样品置36℃±1℃培养箱内，菌落总数培养48h，大肠菌群培养培养24h士2h。
4、记录及结果观察：菌落总数直接进行计数报告即可，大肠菌群若初发酵有产酸产气着则进行分离培养，在EMB平板上有典型菌落着进行证实试验并查询MPN表进行结果报告即可
实验结果
在保证影响检测结果的环境因素不变的前提下，不同保存温度和不同运送时间，限时接种培养后的菌落总数的结果(表一)；大肠菌群的结果(表二)；耐热大肠菌群的结果(表三)；大肠埃希氏菌(表四)。其中表一为随机抽取编号为01～50的50个水样，表二～表三为编号01～10的10个水样。(温度20℃湿度：48％)
表一 菌落总数(单位：cfu/ml)
按照生活饮用水菌落总数项目判定值为100cfu/mL为衡量指标，无论是水质检测判定标准结果为合格还是不合格，在冷藏温度为4℃的条件下，50组不同采样点位的，8小时到达实验室和24小时到达实验室其菌落总数检测结果进行比较，其数值差异性不大。
但不同水质在常温保存条件下，其菌落总数在保存4小时内到达实验室的检测结果，如果小于判定标准值结果且检测值小于50cfu/mL为合格时，其保存8小时内到达实验室测定值普遍是4小时内到达实验室测定值的2-3倍；如果保存4小时内到达实验室的检测值小于判定标准值结果且检测值大于50 cfu/mL小于100cfu/mL为合格时，保存8小时内到达实验室，其样品的检测结果基本都大于判定标准100cfu/mL的限值，且结论为不合格，与保存4小时内到达实验室检测结果比较，呈现出0-4倍差异性非常大的变化，然而，保存16 小时内到达实验室检测结论基本与8小时内到达实验室检测结论一致，但检测数值是保存8小时内到达实验室的0-2倍情况，且变化倍数的差异不明显。由表一可知，编号为1-50号。
表二 总大肠菌群(MPN/100ml)
(注：表二中样品编号1～10和表一中样品编号1～10一一相对应)
从10组水质的总大肠菌群检测结果可以看出，如果常温保存条件下，4h 内送达实验室的检测结果<2MPN/100mL时，不论是8h、16h内到达实验室，还是4℃冷藏条件下，8、24小时到达实验室其检测结果都没有发生变化，甚至，总大肠菌群有检出的情况下，4℃冷藏条件下，保存8小时检测和保存24小时检测其检测结果如第3组和第6组显示，分别与常温保存4小时进行检测其结果基本没有发生变化。
但在常温条件下保存，第3组和第6组水质在保存4h条件下，其检测结果分别＜50和＞50时，保存8h和保存16h检测结果是保存4h的1-1.5倍和2-3 倍。
表三 耐热大肠菌群(粪大肠菌群)
因为总大肠菌群有检出的情况时，需进一步检测耐热大肠菌群和大肠埃希氏菌，因此3组和6组有检出总大肠菌群，需对该组进行耐热大肠菌群检测。由表可以看出，如果常温保存条件下，保存4h进行检测，其检测结果不会因为保存时间为8h、16，还是4℃冷藏条件下，保存8、24小时其检测结果发生变化。
表四 大肠埃希氏菌
(注：样品编号01、02、04、05、07、08、09、10未检出总大肠菌群，依照 GB/T5750.12-2006中相关规定不用再检耐热大肠菌群和大肠埃希氏菌。)
因为3组和6组有检出总大肠菌群，因此对该组进行大肠埃希氏菌检测，其结论跟大肠菌群的结论一致，在常温保存条件下，保存4h进行检测，其检测结果不会因为保存时间为8h、16，还是4℃冷藏条件下，保存8、24小时其检测结果发生变化。
实施例3
一种水质中微生物的测定方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)培养基的制备：菌落总数的培养基为营养琼脂，大肠菌群的培养基主要为乳糖蛋白胨、EMB平板等制备过程同营养琼脂，在做好培养基验收的前提下根据供应商所提供的说明书进行高压灭菌处理即可；大肠菌群的培养基主要为乳糖蛋白胨、EMB平板等制备过程同营养琼脂；
2)接种：菌落总数的接种以无菌操作方法用灭菌吸管吸取1ml充分混匀的水样，注入灭菌平皿中，倾注约15ml融化并冷却到50℃的营养琼脂培养基，旋摇平皿，使水样与培养基充分混匀。同时做平行及空白对照；大肠菌群的接种为取10ml水样接种到10ml双料乳糖蛋白胨培养液中，取1ml水样接种到10ml 单料乳糖蛋白胨培养液中，另取1ml水样注入到9ml灭菌生理盐水中，混匀后吸取1ml(即0.1ml水样)注入到10ml单料乳糖蛋白胨培养液中，每一稀释度接种5管；
3)培养：将上述样品置37℃培养箱内，菌落总数培养48h，大肠菌群培养培养24h；
4)记录及结果观察：菌落总数结果采用直接计数；大肠菌群若初发酵有产酸产气现象则进行进一步分离培养，在EMB平板上有典型菌落特征则进行证实试验并对照MPN表查询，确定最终检测结果。
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (1)
1.一种水质中微生物的测定方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)培养基的制备：菌落总数的培养基为营养琼脂，大肠菌群的培养基主要为乳糖蛋白胨、EMB平板等制备过程同营养琼脂；
2)接种：菌落总数的接种以无菌操作方法用灭菌吸管吸取1ml充分混匀的水样，注入灭菌平皿中，倾注约15ml融化并冷却到40-50℃的营养琼脂培养基，旋摇平皿，使水样与培养基充分混匀。同时做平行及空白对照；大肠菌群的接种为取10ml水样接种到10ml双料乳糖蛋白胨培养液中，取1ml水样接种到10ml单料乳糖蛋白胨培养液中，另取1ml水样注入到9ml灭菌生理盐水中，混匀后吸取1ml(即0.1ml水样)注入到10ml单料乳糖蛋白胨培养液中，每一稀释度接种5管；
3)培养：将上述样品置36℃±1℃培养箱内，菌落总数培养48h，大肠菌群培养培养24h士2h；
4)记录及结果观察：菌落总数结果采用直接计数；大肠菌群若初发酵有产酸产气现象则进行进一步分离培养，在EMB平板上有典型菌落特征则进行证实试验并对照MPN表查询，确定最终检测结果。
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- 2021-03-18 CN CN202110299468.5A patent/CN113493815A/zh active Pending
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA2745872A1 (en) * | 2008-12-16 | 2010-07-08 | Biomerieux, Inc. | Methods for the characterization of microorganisms on solid or semi-solid media |
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Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 中华人民共和国卫生部、中国国家标准化管理委员会: "生活饮用水标准检验方法-微生物指标", 《中华人民共和国国家标准》 * |
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20211012 |
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| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |