CN108570489A - 一种检测乳中所污染的产气微生物的方法 - Google Patents

一种检测乳中所污染的产气微生物的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开的一种检测乳中所污染的产气微生物的方法，包括如下步骤：(1)将各种产气微生物分别接种于各自产气微生物适用的培养基中培养，记录各种产气微生物在不同时间产气情况；(2)将待测乳样分别加入各种培养基的试管中，所述培养基为步骤(1)中接种前的培养基，观察含有各种培养基试管中的产气情况，根据步骤(1)记录的各种产气微生物在不同时间产气情况，即可判断出待测乳样中产气微生物的种类。本发明的优点在于，最长可以在48h内判断待测乳样中产气微生物的种类并对其进行计数，以便更快排查污染源和污染原因，更快确定引起胀包的微生物并及时采取有效措施以控制和减少损失。

Description

一种检测乳中所污染的产气微生物的方法
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体为一种检测乳中所污染的产气微生物的方法。
背景技术
乳制品在运输储存过程中可能产生胀包现象，对于物理因素引起的胀包很容易判断，但是由微生物因素引起的胀包现象却很难判断是哪种微生物引起的，也很难对可能存在的产气微生物定量。
食品包括乳制品中常见的产气微生物有酵母、细菌两大类。要对引起乳制品包装胀包的微生物进行检测，现有技术需要对乳中所污染的微生物进行平板培养、分离单菌落再培养，然后进行定性检测才能得知具体是哪种微生物(酵母、细菌)产气，并且要对所分离的微生物进行平板计数才能确定其数量。该方法一般需要5-7d才能得到定性定量结果，操作比较繁琐且耗时。
随着技术的发展，Ros-chumillas等研究了在未进行前增菌的条件下进行DNA纯化后酵母菌的检测，检测限为103CFU/mL。Bleve等用实时荧光定量PCR检测酵母菌的肌动蛋白基因，能检测到10CFU/mL纯酵母，但只能检测到食品中103CFU/mL-102CFU/mL的酵母菌，实时荧光定量PCR检测灵敏度高，检测啤酒酵母和非啤酒酵母的报道较多。申建忠采用基于纳米复合材料新型电化学免疫传感器用于乳制品中大肠杆菌的监测研究，表明在一定浓度范围内大肠杆菌检出限在80CFU/mL。马冬等利用PCR技术检测乳品中大肠杆菌，在进行人工增菌后检出限达到1CFU/mL。以上方法都需要事先判断产气菌是否大肠杆菌，才能进行后面的定量检测。常规的PCR技术和荧光定量PCR技术在检测前也需要复杂的前处理，而且检测费用昂贵。
现有技术中对乳这种复杂体系中可能存在的产气微生物进行分离及判定是比较困难的，且繁琐耗时，尤其是对于一些发酵乳制品如酸奶、发酵乳和发酵乳饮料等，其样品本身含有大量的发酵菌株或其他非产气菌株，会更增加检测试验的操作难度和复杂度。因此，在微生物技术领域中研究开发产气微生物的快速检测和计数方法是亟待解决的问题。
发明内容
为解决现有技术中不能快速检测出乳中所污染的产气微生物、以及也不能快速对乳中所污染的产气微生物定性定量的技术问题，本发明提供了一种检测乳中所污染的产气微生物的方法，其实现的目的为，最长可以在48h内判断乳中所污染的产气微生物的种类并对其进行计数，以便更快排查污染源和污染原因，更快确定引起胀包的微生物并及时采取有效措施以控制和减少损失。
为了实现上述目的，本发明公开的技术方案为，本发明提供的一种检测乳中所污染的产气微生物的方法，包括如下步骤：
(1)将各种产气微生物分别接种于各自产气微生物适用的培养基中培养，记录各种产气微生物在不同时间产气情况；
(2)将待测乳样分别置入各种培养基的试管中，所述培养基为步骤(1)中接种前的培养基，观察含有各种培养基试管中的产气情况，根据步骤(1)记录的各种产气微生物在不同时间产气情况，即可判断出乳中所污染的产气微生物的种类。
本发明所述乳包括原料乳、乳制品、含乳食品，采用本发明方法都可将胀袋乳及相关乳制品中所污染的产气微生物检测出来，本发明方法相较于传统分离培养及计数方法，更简便快捷、更灵敏，检测限可达到n×100/mL(n<10)，相当于平板培养技术的n×100CFU/mL(n<10)。最长48h即可判断出产气微生物的种类，也避免了在检测时需要将乳中所污染的微生物分离困难的问题。
进一步的，所述步骤(2)在观察含有各种培养基试管中产气情况时，根据微生物菌群最可能数检索表直接得出乳中所污染的产气微生物数。采用本发明方法检测乳中所污染的产气微生物，还可以对检测出的微生物进行定量。
进一步的，所述步骤(1)中将各种产气微生物分别接种于各自产气微生物适用的培养基之前，先将产气微生物进行菌株活化，活化的方法为：将各种产气微生物在各自产气微生物适用的固体培养基中活化培养，获得的菌落挑选单菌落再接种于各自的液体培养基中。
进一步的，所述步骤(1)和步骤(2)观察培养基试管中产气情况的方法为，在培养基试管中分别倒置一个杜氏小管，使杜氏小管排尽空气，充满培养基中的液体。采用杜氏小管观察产气情况最为简便和直观。
进一步的，所述步骤(1)中的产气微生物包括大肠杆菌、酵母菌。大肠杆菌、酵母菌为常见的胀袋乳品中产气微生物，所以采用这两种菌培养记录产气情况，更为快捷地帮助确定胀袋乳品中所污染的产气微生物的种类。
进一步的，所述步骤(1)中产气微生物为大肠杆菌，大肠杆菌所用的培养基为LB培养基，培养的温度35-37℃，培养时间为20-50h。
进一步的，所述步骤(1)中产气微生物为酵母菌，酵母菌所用的培养基为PDB培养基，培养的温度29-31℃，培养时间为20-50h。
所选择的培养基、培养条件参数适宜大肠杆菌、酵母菌培养，以便更好的观察产气情况。
进一步的，所述步骤(2)中将待测乳样分别加入LB培养基、PDB培养基中，加入LB培养基中培养的温度35-37℃，培养时间为20-50h；加入PDB培养基中培养的温度29-31℃，培养时间为20-50h，根据步骤(1)记录的大肠杆菌、酵母菌在不同时间产气情况，即可判断出乳中所污染的产气微生物的种类。大肠杆菌、酵母菌为常见的胀袋乳品中产气微生物，选择这两种菌的培养基可以直接将乳中所污染的产气微生物的种类范围缩小，有助于迅速检测出乳中所污染的产气微生物的种类。
本发明的积极进步效果在于：1.可快速判断乳中所污染的产气微生物的种类，有利于尽快查找污染源和污染原因，从而进行有效控制；
2.最长48小时可出结果，如果样品中菌数超过102CFU/mL，则24小时内即可检出；
3.同时可对产气微生物进行定量计数。
本发明的微生物快速检测与计数方法操作简单，方便快速，不需要菌落分离及平板计数，成本低，在乳品质量安全检测与控制中具有十分广阔的应用前景。
具体实施方式
下面通过具体的实施例对本发明做进一步的详细描述。本发明所用试剂和原料样品均市售可得，并且在没有特殊说明情况下，均采用的是现有技术。
实施例一：本发明提供的一种检测乳中所污染的产气微生物的方法，包括如下步骤：
(1)将各种产气微生物分别接种于各自产气微生物适用的培养基中培养，记录各种产气微生物在不同时间产气情况；
(2)将待测乳样分别加入各种培养基的试管中，所述培养基为步骤(1)中接种前的培养基，观察含有各种培养基试管中的产气情况，根据步骤(1)记录的各种产气微生物在不同时间产气情况，即可判断出乳中所污染的产气微生物的种类。
本发明在所述步骤(2)在观察含有各种培养基试管中产气情况时，根据微生物菌群最可能数检索表直接得出该待测乳样中产气微生物数。
进一步的，所述步骤(1)中将各种产气微生物分别接种于各自产气微生物适用的培养基之前，先将产气微生物进行菌株活化，活化的方法为：将各种产气微生物在各自产气微生物适用的固体培养基中活化培养，获得的菌落挑选单菌落再接种于各自的液体培养基中。
所述步骤(1)和步骤(2)观察培养基试管中产气情况的方法为，在培养基试管中分别倒置一个杜氏小管，使杜氏小管排尽空气，充满培养基中的液体。
所述步骤(1)中的产气微生物包括大肠杆菌、酵母菌。所述步骤(1)中产气微生物为大肠杆菌，大肠杆菌所用的培养基为LB培养基，培养的温度35℃，培养时间为46h；所述步骤(1)中产气微生物为酵母菌，酵母菌所用的培养基为PDB培养基，培养的温度29℃，培养时间为46h。所述步骤(2)中将待测乳样分别加入LB培养基、PDB培养基中，加入LB培养基中培养的温度35℃，培养时间为46h；加入PDB培养基中培养的温度29℃，培养时间为46h，根据步骤(1)记录的大肠杆菌、酵母菌在不同时间产气情况，即可判断出乳中所污染的产气微生物的种类。
观察产气结果可知，产气细菌(大肠杆菌)，在经过40小时恒温培养即可得到菌落最可能数值大于1.1×107/mL，在此基础上继续逐级稀释，与平板计数结果(1.6×107CFU/mL)数量级一致。所产气泡体积小于杜氏小管容积的1/5。产气微生物(酵母菌)在经过44小时恒温培养即可得到菌落最可能数值(4.3×107/mL)，与平板计数结果(4.1×107CFU/mL)数量级一致。所产气泡体积超过杜氏小管容积1/3甚至充满杜氏小管。由该结果可知，大肠杆菌与酵母菌都具有产气的生理现象，两株酵母菌产气能力明显较强，而大肠杆菌在经过40小时以上的恒温培养后气泡大小程度基本保持不变。由此可根据在不同培养基产气现象判断产气微生物是哪种。
所以根据上述产气结果，本发明步骤(2)中分别采用LB培养基、PDB培养基进行培养，判断产气菌是哪一种。如果在LB培养基中产气的菌则可判断为细菌(如大肠杆菌)；如果在PDB培养基中产气的菌则判断为酵母。在对乳中产气微生物计数时采用的是微生物最可能数检索表。
将胀袋待测样品以无菌吸管吸取1mL样品加入盛有9mL无菌水的试管中，充分混匀，制成1∶10的样品匀液；
再用无菌吸管吸取1∶10样品匀液1mL，沿管壁缓缓注入盛有9mL无菌水的试管中，充分混匀，制成1∶100的样品匀液；
最后，根据样品微生物生长状况估计，按上述操作，依次制成10倍递增系列稀释样品匀液。每递增稀释1次，换用一只无菌吸管，从制备样品匀液至样品接种完毕，全程不超过15mi n，每个浓度重复平行三个试管，根据上述大肠杆菌最可能数检索表查询到大肠杆菌最可能数。
实施例二：本发明提供的一种检测乳中所污染的产气微生物的方法，包括如下步骤：
(1)将各种产气微生物分别接种于各自产气微生物适用的培养基中培养，记录各种产气微生物在不同时间产气情况；
(2)将待测乳样分别加入各种培养基的试管中，所述培养基为步骤(1)中接种前的培养基，观察含有各种培养基试管中的产气情况，根据步骤(1)记录的各种产气微生物在不同时间产气情况，即可判断出乳中所污染的产气微生物的种类。
本发明在所述步骤(2)在观察含有各种培养基试管中产气情况时，根据微生物菌群最可能数检索表直接得出乳中所污染的产气微生物数。
进一步的，所述步骤(1)中将各种产气微生物分别接种于各自产气微生物适用的培养基之前，先将产气微生物进行菌株活化，活化的方法为：将各种产气微生物在各自产气微生物适用的固体培养基中活化培养，获得的菌落挑选单菌落再接种于各自的液体培养基中。
所述步骤(1)和步骤(2)观察培养基试管中产气情况的方法为，在培养基试管中分别倒置一个杜氏小管，使杜氏小管排尽空气，充满培养基中的液体。
所述步骤(1)中的产气微生物包括大肠杆菌、酵母菌。所述步骤(1)中产气微生物为大肠杆菌，大肠杆菌所用的培养基为LB培养基，培养的温度37℃，培养时间为50h；所述步骤(1)中产气微生物为酵母菌，酵母菌所用的培养基为PDB培养基，培养的温度31℃，培养时间为50h。所述步骤(2)中将待测乳样分别加入LB培养基、PDB培养基中，加入LB培养基中培养的温度37℃，培养时间为50h；加入PDB培养基中培养的温度31℃，培养时间为50h，根据步骤(1)记录的大肠杆菌、酵母菌在不同时间产气情况，即可判断出乳中产气微生物的种类。
以下采用试验测试本发明的方法的准确性：
简单体系中产气微生物的快速检测与计数
人工接种至LB：记为样品A；
人工接种至PDB：记为样品B。
(1)菌株活化
将各株菌在合适的培养基中活化培养，获得的菌落挑选单菌落分别接种于5mL LB培养基和5mL PDB培养基中，分别置于37℃和30℃培养24小时，获得初始菌液。
(2)样品稀释如实施例一所述
(3)接种如实施例一所述
(4)观察现象汇报结果
根据产气结果可判断，在经过44小时恒温培养即可观测到产气现象，在LB培养基中产气的菌为细菌，所产气泡体积小于杜氏小管容积的1/5。在PDB培养基中产气的为酵母，所产气泡体积超过杜氏小管容积1/3甚至充满杜氏小管。
判断样品A为细菌(大肠杆菌)，B为酵母菌。分别采用大肠杆菌、酵母菌最可能数检索表查得菌落最可能数值(大肠杆菌大于1.1×107/mL，酵母菌为4.3×107/mL)，与平板计数结果(大肠杆菌为1×107CFU/mL，酵母菌为3.6×107CFU/mL)数量级一致。
本次试验验证了本发明方法的准确、可靠性。
实施例三：本实施例为采用本发明方法检测液体乳体系(巴氏杀菌乳、超高温灭菌乳即UHT乳)中产气微生物的种类与计数：
将大肠杆菌分别接种于两种乳体系：巴氏杀菌乳为样品A，UHT乳为样品B；
将酵母菌分别接种于两种乳体系：巴氏杀菌乳为样品C，UHT乳为样品D；
(1)菌株活化
如实施例二获得初始菌液，将两种菌分别按不同比例单独接种于两种乳体系中。
(2)样品稀释步骤如实施例一
(3)接种
将稀释好的3个浓度梯度样品接种于相应菌株适宜的培养基的试管中(10％接种量)，每个稀释梯度做3组平行实验，接种时间控制在15mi n以内，并对初始菌液平板稀释计数。
(4)观察现象汇报结果
根据产气结果可知，在模拟乳样品中，20小时即可观测到样品A和B产气，在经过48小时后所产气泡体积基本不变，而样品C和D则在28小时后开始产气，随培养时间增加所产气泡体积不断增加，因此此方法可快速检测乳样品中产气微生物。在LB培养基中产气的菌为细菌，所产气泡体积小于杜氏小管容积的1/5。在PDB培养基中产气的为酵母，所产气泡体积超过杜氏小管容积1/3甚至充满杜氏小管。
判断样品A和B为细菌(大肠杆菌)，样品C和D为酵母菌。菌落最可能数结果(样品A为3.6×103/mL，B为2.9×102/mL，C为1.1×103/mL，D为7.4×100/mL)与平板计数结果(A为3×103CFU/mL，B为1.8×102CFU/mL，C为3.9×103CFU/mL，D为3.8×100CFU/mL)数量级一致。
实施例四：本实施例为采用本发明方法检测发酵乳(低温酸奶、常温酸奶即巴氏杀菌热处理酸牛乳)中产气微生物的种类与计数：
大肠杆菌分别接种于两种乳体系：低温酸奶为样品A，常温酸奶为样品B；
酵母菌分别接种于两种乳体系：低温酸奶为样品C，常温酸奶为样品D
(1)菌株活化
如实施例二获得初始菌液，将两种菌分别按不同比例单独接种于两种乳体系中。
(2)样品稀释步骤如实施例一
(3)接种如实施例三中所述
(4)观察现象汇报结果
根据产气结果可知，在模拟发酵乳体系中，20小时即可观测到样品A和B产气，在经过48小时后所产气泡体积基本不变，而样品C和D则在40小时后开始产气，随培养时间增加所产气泡体积不断增加，因此此方法可快速检测乳样品中产气微生物。在LB培养基中产气的菌为细菌，所产气泡体积小于杜氏小管容积的1/5。在PDB培养基中产气的为酵母，所产气泡体积超过杜氏小管容积1/3甚至充满杜氏小管。
判断样品A和B为细菌(大肠杆菌)，样品C和D为酵母菌。菌落最可能数结果(样品A为4.6×102/mL，B为1.8×102/mL，C为9.2×100/mL，D为9.2×100/mL)与平板计数结果(A为1.8×102CFU/mL，B为1.8×102CFU/mL，C为3.8×100CFU/mL，D为3.8×100CFU/mL)数量级一致。
实施例五：本实施例为采用本发明方法对发酵乳饮料(益生菌活菌数达到4×108CFU/mL以上的高活菌型发酵乳饮料)中人工接种产气微生物的快速检测与计数：
大肠杆菌分别接种于乳饮料：记为样品A；
酵母菌分别接种于乳饮料：记为样品B。
(1)菌株活化
如实施例二获得初始菌液，将两种菌分别按不同比例单独接种于乳品体系中。
(2)样品稀释步骤如实施例一
(3)接种如实施例三中所述
(4)观察现象汇报结果
根据产气结果可知，在模拟发酵乳饮料体系中，16小时即可观测到样品A产气，在经过48小时后所产气泡体积基本不变，样品B则在24小时后开始产气，随培养时间增加所产气泡体积不断增加，因此此方法可快速检测乳样品中产气微生物。在LB培养基中产气的菌为细菌，所产气泡体积小于杜氏小管容积的1/5。在PDB培养基中产气的为酵母，所产气泡体积超过杜氏小管容积1/3甚至充满杜氏小管。
判断样品A为细菌(大肠杆菌)，B为酵母菌。菌落最可能数(A为1.1×103/mL，B为1.1×103/mL)与平板计数结果(A为3×103CFU/mL，B为3.9×103CFU/mL)数量级一致。
上述实施例中表明，本发明方法可快速检测乳中所污染的产气微生物种类是细菌还是酵母；并可直接对产气微生物计数，计数检测限可达到n×100/mL(n<10)，相当于平板培养技术的n×100CFU/mL(n<10)。无需在用传统平板计数，节省了大量时间。通过产气微生物检测可指导生产过程中判断产气微生物繁琐困难的问题，结果准确可靠。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种检测乳中所污染的产气微生物的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：
(1)将各种产气微生物分别接种于各自产气微生物适用的培养基中培养，记录各种产气微生物在不同时间产气情况；
(2)将待测乳样分别加入各种培养基的试管中，所述培养基为步骤(1)中接种前的培养基，观察含有各种培养基试管中的产气情况，根据步骤(1)记录的各种产气微生物在不同时间产气情况，即可判断出待测乳样中产气微生物的种类。
2.根据权利要求1所述的检测乳中所污染的产气微生物的方法，其特征在于，所述步骤(2)在观察含有各种培养基试管中产气情况时，根据微生物菌群最可能数检索表直接得出乳中产气微生物数。
3.根据权利要求1所述的检测乳中所污染的产气微生物的方法，其特征在于，所述步骤(1)中将各种产气微生物分别接种于各自产气微生物适用的培养基之前，先将产气微生物进行菌株活化，活化的方法为：将各种产气微生物在各自产气微生物适用的固体培养基中活化培养，获得的菌落挑选单菌落再接种于各自的液体培养基中。
4.根据权利要求1所述的检测乳中所污染的产气微生物的方法，其特征在于，所述步骤(1)和步骤(2)观察培养基试管中产气情况的方法为，在培养基试管中分别倒置一个杜氏小管，使杜氏小管排尽空气，充满培养基中的液体。
5.根据权利要求1所述的检测乳中所污染的产气微生物的方法，其特征在于，所述步骤(1)中的产气微生物包括细菌(如大肠杆菌)、酵母菌。
6.根据权利要求1或5所述的检测乳中所污染的产气微生物的方法，其特征在于，所述步骤(1)中产气微生物为大肠杆菌，大肠杆菌所用的培养基为LB培养基，培养的温度35-37℃，培养时间为20-50h。
7.根据权利要求1或5所述的检测乳中所污染的产气微生物的方法，其特征在于，所述步骤(1)中产气微生物为酵母菌，酵母菌所用的培养基为PDB培养基，培养的温度29-31℃，培养时间为20-50h。
8.根据权利要求1或5所述的检测乳中所污染的产气微生物的方法，其特征在于，所述步骤(2)中将待测乳样分别加入LB培养基、PDB培养基中，加入LB培养基中培养的温度35-37℃，培养时间为20-50h；加入PDB培养基中培养的温度29-31℃，培养时间为20-50h，根据步骤(1)记录的大肠杆菌、酵母菌在不同时间产气情况，即可判断出乳中所污染的产气微生物的种类。
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CN112501241A (zh) * 2020-12-03 2021-03-16 云南中烟工业有限责任公司 一种唾液产气微生物的分离方法

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