CN104313113A - 一种副干酪乳杆菌直投式菌种中霉菌和酵母的定量检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种副干酪乳杆菌直投式菌种中霉菌和酵母的定量检测方法，属于微生物检验技术领域。该检测方法包括下述顺序的检验步骤：称取5g副干酪乳杆菌直投式菌种至盛有95g灭菌生理盐水的锥形瓶中，震荡2min后静置30min，制得1:20的样品匀液；取10g样品匀液通过孔径1um的滤膜进行第一次抽滤，滤膜放入20-50g无菌生理盐水中稀释，将稀释后的样品匀液全部通过孔径1um的滤膜进行第二次抽滤，同样进行第三次抽滤，最后按10倍递增稀释样品并倒无菌平板28±1℃培养5天计数。本发明定量检测的方法避免了直接用国标法检验由于受乳酸菌的影响，使检测结果更加准确。
Description
技术领域
本发明属于微生物检验技术领域，具体涉及一种副干酪乳杆菌直投式菌种中霉菌和酵母的检测方法。
背景技术
直投式酸奶发酵剂（Directed Vat Set,DVS）是指一系列高度浓缩和标准化的冷冻干燥发酵剂菌种，可直接加入到热处理的原料乳中进行发酵，而无需对其进行活化、扩培等其它预处理工作。直投式发酵剂的活菌数一般为1010-1012CFU/g，由于直投式发酵剂的活力强、类型多，生产厂家可以根据需要任意选择，从而丰富了乳酸菌产品的品种。直投发酵剂不需要扩大培养，可直接使用，产品质量相对稳定，成为目前大型乳品企业的首选。乳酸菌直投式菌种基本是国外进口，有一百多年的生产历史，质量相对稳定，由于直投式菌种价格相对较贵，打开后如不及时使用，会导致活力下降并且容易污染，故对乳酸菌直投式菌种进厂检验相对较少，偶尔抽检一下活菌数，霉菌酵母含量直接用国标法检测，没有对直投式菌种进行预处理，由于乳酸菌对霉菌酵母的抑制作用，检测结果不准确。在实际生产中，偶尔有部分批次产品生产过程中产酸弱，同时伴随保质期过程有鼓盖现象，无法查找到产品出质量问题的原因。目前国内对直投式菌种的研究论文有90多篇，基本围绕乳酸菌遗传稳定性、传代培养、菌株选育、分离鉴定、生化特性等，而对直投式菌种纯度的定量检验方法没有相应报道。
发明内容
针对现有技术存在的上述不足，本发明的目的在于提供一种副干酪乳杆菌直投式菌种中霉菌和酵母的定量检测方法，主要解决直接用国标法检测会受稀释倍数、抑制作用等因素的干扰而使检测结果有很大误差的问题。
为实现上述发明目的，本发明是通过下述技术方案来实现的：一种副干酪乳杆菌直投式菌种中霉菌和酵母的定量检测方法，其特征在于：包括下述顺序的检测步骤：
（1）样品处理：
A 样品制备：称取5g副干酪乳杆菌直投式菌种至盛有95g灭菌生理盐水的锥形瓶中，震荡2min后静置30min，制得1:20的样品匀液；
B 第一次抽滤：固定好滤器，将10g上述步骤A制得的样品匀液通过孔径1um的滤膜过滤，然后将过滤好的滤膜放入20-50g灭菌生理盐水的锥形瓶中，充分振摇，制得第一次抽滤后的样品匀液；
C 第二次抽滤：固定好滤器，将上述步骤B制得的第一次抽滤后的样品匀液全部通过孔径1um的滤膜过滤，然后将过滤好的滤膜放入20-50g灭菌生理盐水的锥形瓶中，充分振摇，制得第二次抽滤后的样品匀液；
D 第三次抽滤：固定好滤器，将上述步骤C制得的第二次抽滤后的样品匀液全部通过孔径1um的滤膜过滤，然后将过滤好的滤膜放入计算好的灭菌生理盐水质量的锥形瓶中，充分振摇，制成稀释度为1×10-2的样品匀液；
E 制备培养皿：取1g上述步骤D制得的稀释度为1×10-2的样品匀液，注入9g灭菌生理盐水的试管中，充分振摇，制得稀释度为1×10-3的样品匀液，按此操作程序，制备10倍系列稀释样品匀液，每递增稀释1次，换用一次无菌吸管；在进行10倍递增稀释的同时，每个稀释度分别吸取1g样品匀液于2个无菌平皿，及时将15—20g冷却至46-50℃的孟加拉红培养基倾注平皿，转动平皿使其混合均匀；
（2）培养：待琼脂凝固后，将平皿倒置，28±1℃培养5天，观察并记录；
（3）菌落计数及报告：选取菌落数在10-150CFU之间的平板进行计数，一个稀释度使用两个平板，取两个平板菌落数的平均值，乘以稀释倍数报告。
与现有技术相比，本发明具有的有益效果有：
1、本发明根据乳酸菌与霉菌酵母不同的形态大小，通过抽滤的微过滤形式，避免了乳酸菌抑制霉菌酵母生长的干扰因素，使检测结果更加准确。酵母细胞的大小是（1-5）um×(5-30)um、霉菌孢子的大小是（2-10）um，副干酪乳杆菌直投式菌种由于采用冷冻真空干燥工艺，菌株宽度一般小于1um。根据不同菌株分子大小不同的特性，通过1um微膜抽滤将副干酪乳杆菌和霉菌酵母分离开，即霉菌和酵母留在滤膜上，副干酪乳杆菌分离在滤液中。
2、本发明通过定量检验，首次将直投式菌种中是否有霉菌和酵母检测出来，避免了副干酪乳杆菌对检测过程的干扰。
3、本发明的实施将有效的控制国外进口直投式菌种的产品质量，保证乳酸菌发酵产品在生产过程中的稳定性，同时避免了产品保质期发生鼓盖的质量问题。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明作进一步的说明，但不限于该实施例。
实施例1
一种副干酪乳杆菌直投式菌种样品中霉菌和酵母的检测方法，其特征在于：包括下述顺序的工艺步骤：
A 样品制备：称取5g副干酪乳杆菌直投式菌种至盛有95g灭菌生理盐水的锥形瓶中，先用拍击式震荡器震荡2min，后在无菌环境中静置30min，制得质量比为1:20的样品匀液；
B 第一次抽滤：首先用无菌镊子夹起灭菌滤膜边缘部分，将粗糙面向上，贴放在已灭菌的滤床上，固定好滤器，取10g上述步骤A制得的样品匀液，通过孔径1um的滤膜过滤，然后将过滤好的滤膜放入20g灭菌生理盐水的锥形瓶中，充分振摇，制得第一次抽滤后的样品匀液；
C 第二次抽滤：固定好滤器，取上述步骤B制得第一次抽滤后的样品匀液，通过孔径1um的滤膜过滤，然后将过滤好的滤膜放入20g灭菌生理盐水的锥形瓶中，充分振摇，制得第二次抽滤后的样品匀液；
D 第三次抽滤：固定好滤器，取上述步骤C制得第二次抽滤后的样品匀液，通过孔径1um的滤膜过滤，然后将过滤好的滤膜放入49.2g灭菌生理盐水的锥形瓶中，充分振摇，制得稀释度为1×10-2的样品匀液；
E 制备培养皿：取1g上述步骤D制得的稀释度为1×10-2的样品匀液，注入9g灭菌生理盐水的试管中，充分振摇，制得1×10-3稀释度的样品匀液，按此操作程序，制备10倍系列稀释样品匀液，每递增稀释1次，换用一次无菌吸管；在进行10倍递增稀释的同时，每个稀释度分别吸取1g样品匀液于2个无菌平皿，同时分别取1g样品稀释液加入2个无菌平皿作空白对照，及时将15—20g冷却至46-50℃的孟加拉红培养基倾注平皿，转动平皿使其混合均匀；
（2）培养：待琼脂凝固后，将平皿倒置，28±1℃培养5天，观察并记录。
（3）菌落计数及报告：肉眼观察，必要时可用放大镜，记录各稀释倍数和相应的霉菌和酵母数目，以菌落形成单位CFU表示；选取菌落数在10-150CFU之间的平板进行计数，一个稀释度使用两个平板，取两个平板菌落数的平均值，乘以稀释倍数报告。菌落数计数结果见表1。
对比例A
一种副干酪乳杆菌直投式菌种样品中霉菌和酵母的国标检测法，包括下述顺序的步骤：
（1）在100级的洁净工作台进行过滤操作，称取10g副干酪乳杆菌直投式菌种至盛有90g灭菌生理盐水的锥形瓶中，用拍击式震荡器震荡2min，后在无菌环境中静置30min，制得质量比为1:10的样品匀液。
（2）取1g步骤（1）制得的1:10样品匀液，注入9g灭菌生理盐水的试管中，充分振摇，制得1:100的稀释液，按此操作程序，制备10倍系列稀释样品匀液，每递增稀释1次，换用一次无菌吸管；根据对样品污染状况的估计，选择1×10-2、1×10-3、1×10-4 、1×10-5稀释度的样品匀液，每个稀释度分别吸取1g样品匀液于2个无菌平皿，同时分别取1g稀释液加入2个无菌平皿作空白对照，及时将15—20g冷却至46-50℃的孟加拉红培养基倾注平皿，转动平皿使其混合均匀。
（3）培养、菌落计数及报告均同实施例1，菌落数计数结果见表1。
对比例B
一种副干酪乳杆菌直投式菌种样品中霉菌和酵母的对照检测法，包括下述顺序的步骤：
（1）在100级的洁净工作台进行过滤操作,称取10g副干酪乳杆菌直投式菌种至盛有90g灭菌生理盐水的锥形瓶中，用拍击式震荡器震荡2min，后在无菌环境中静置30min，制得质量比为1:10的样品匀液。
（2）第一次抽滤：首先用无菌镊子灭菌滤膜边缘部分，将粗糙面向上，贴放在已灭菌的滤床上，固定好滤器，取10g上述步骤(1)制得的样品匀液通过孔径1um的滤膜过滤，然后将过滤好的滤膜放入99.1g灭菌生理盐水的锥形瓶中，充分振摇，制得第一次抽滤后稀释度为1×10-2的样品匀液。
（3）第二次抽滤：同样固定好滤器，取10g上述步骤(2)制得的第一次抽滤后的样品匀液，通过孔径1um的滤膜过滤，然后将过滤好的滤膜放入99.3g灭菌生理盐水的锥形瓶中，充分振摇，制得第二次抽滤后释度为1×10-3的样品匀液。
（4）固定好滤器，取10g上述步骤(3)制得第二次抽滤后的样品匀液通过孔径1um的滤膜过滤，然后将过滤好的滤膜放入99.4g灭菌生理盐水的锥形瓶中，充分振摇，制得释度为1×10-4的样品匀液。
（5）取1g上述步骤（4）制得稀释度为1×10-4的样品匀液，注入9g灭菌生理盐水的试管中，充分振摇，制得1×10-5稀释度的样品匀液，按此操作程序，制备10倍系列稀释样品匀液，每递增稀释1次，换用一次无菌吸管；选择1×10-2、1×10-3、1×10-4、1×10-5稀释度的样品匀液，每个稀释度分别吸取1g样品匀液于2个无菌平皿，同时分别取1g样品稀释液加入2个无菌平皿作空白对照，及时将15—20g冷却至46-50℃的孟加拉红培养基倾注平皿，转动平皿使其混合均匀。
（6）培养、菌落计数、结果报告都同实施例1，菌落数计数结果见表1。
表1：不同稀释度样品培养出的霉菌和酵母菌落数计数结果
从表中1对比例A可以看出，相同样品用国标法检测，由于受副干酪乳杆菌的影响，霉菌酵母检测不出来，即对比例A样品匀液的1×10-2、1×10-3、1×10-4、1×10-5稀释度的霉菌和酵母菌落检测结果都为0，而样品经1um滤膜抽滤处理后，除去了副干酪乳杆菌对霉菌酵母的抑制作用，排除检测过程的干扰因素，实施例1样品匀液的检测结果是：稀释度为1×10-2的两个平皿的霉菌和酵母菌落数平均为18个，其中酵母菌落数12个、霉菌菌落数6个，稀释度为1×10-3两个平皿霉菌和酵母菌落数平均为7，不在10—150 CFU计数范围以内，因此选1×10-2稀释度中的菌落数来计数，即该样品中霉菌和酵母菌数为1800CFU/g。
实施例1和对比例B的区别：对比例B按常规的微生物检测方法，将样品按10倍稀释法逐级递增，结果对比例B检测不出有霉菌和酵母，原因是样品中霉菌和酵母数量较少，因此要使检测结果更加准确，必须对样品进行处理，同时处理的样品要全部抽滤。第一次样品稀释采用1:20的稀释倍数完全是为了抽滤操作方法考虑，在实验中也试用过1:10的稀释倍数，但由于浓度高，滤膜孔细，操作特别困难，稀释倍数大，霉菌酵母不易检测出来。经过反复试验，第一次样品稀释采用1:20的比例是比较合理的。
Claims (1)
1. 一种副干酪乳杆菌直投式菌种中霉菌和酵母的定量检测方法，其特征在于：包括下述顺序的检测步骤：
（1）样品处理：
A 样品制备：称取5g副干酪乳杆菌直投式菌种至盛有95g灭菌生理盐水的锥形瓶中，震荡2min后静置30min，制得1:20的样品匀液；
B 第一次抽滤：固定好滤器，将10g上述步骤A制得的样品匀液通过孔径1um的滤膜过滤，然后将过滤好的滤膜放入20-50g灭菌生理盐水的锥形瓶中，充分振摇，制得第一次抽滤后的样品匀液；
C 第二次抽滤：固定好滤器，将上述步骤B制得的第一次抽滤后的样品匀液全部通过孔径1um的滤膜过滤，然后将过滤好的滤膜放入20-50g灭菌生理盐水的锥形瓶中，充分振摇，制得第二次抽滤后的样品匀液；
D 第三次抽滤：固定好滤器，将上述步骤C制得的第二次抽滤后的样品匀液全部通过孔径1um的滤膜过滤，然后将过滤好的滤膜放入计算好的灭菌生理盐水质量的锥形瓶中，充分振摇，制成稀释度为1×10-2的样品匀液；
E 制备培养皿：取1g上述步骤D制得的稀释度为1×10-2的样品匀液，注入9g灭菌生理盐水的试管中，充分振摇，制得稀释度为1×10-3的样品匀液，按此操作程序，制备10倍系列稀释样品匀液，每递增稀释1次，换用一次无菌吸管；在进行10倍递增稀释的同时，每个稀释度分别吸取1g样品匀液于2个无菌平皿，及时将15—20g冷却至46-50℃的孟加拉红培养基倾注平皿，转动平皿使其混合均匀；
（2）培养：待琼脂凝固后，将平皿倒置，28±1℃培养5天，观察并记录；
（3）菌落计数及报告：选取菌落数在10-150CFU之间的平板进行计数，一个稀释度使用两个平板，取两个平板菌落数的平均值，乘以稀释倍数报告。
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