CN103045714B - 用于检测棉花纤维上携带的微生物的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种用于检测棉花纤维上携带的微生物的方法。该方法是将一定重量的棉花纤维浸入一定体积的无菌水中，在合适转速条件下摇床培养一段时间得到浸泡液母液，使用无菌水进行梯度稀释得到相应浓度的稀释液，将该稀释液分别接种在不同的选择性培养基上培养，根据稀释液在选择性培养基上的生长情况，鉴定棉花纤维上携带的微生物的种类，并计算微生物的数量。该方法具有较强的操作性和实用性，简单易行。
Description
技术领域
本发明涉及一种用于检测棉花纤维上携带的微生物的方法。
背景技术
棉花是我国重要的战略物质，它不仅涉及2-3亿棉农的切身利益，还关系到流通领域几十万人、纺织工业1900万人的就业问题。但棉花病害是制约棉花生产和品质的重要因素，我国常年因病害造成的损失达15％～20％。
引致棉花病害发生的病原物包括多种真菌、细菌、放线菌等，其中尤以真菌和细菌病原所致病害最重。一般认为棉花种子、病株残体、棉铃壳和棉籽饼等可携带多种微生物，是传播多种棉花病害的主要途径，而忽略了棉花纤维是否带菌的问题。
我国每年需进口600多万吨原棉以满足国内需求。如果棉花纤维上携带病原菌，一些病原菌将通过原棉进口进入中国，对我国的棉花生产带来巨大威胁。如棉花枯萎病、黄萎病均是由真菌引起的病害。我国引起枯萎病的真菌生理小种和美国的生理小种有明显差异，引起黄萎病的病原菌大丽轮枝菌致病力也存在较大差异，如美国的黄萎病病原菌分为落叶型T-1和非落叶型SS-4两个生理小种，前一种的致病力比后一种强10倍。
因此建立棉花纤维上携带的微生物的检测方法，对于加强病害检疫、杜绝国外病原微生物的侵入，确保我国棉花生产安全具有重要意义。
我国现有的微生物检测方法是对土壤微生物的检测，该检测方法包括培养基制备、微生物的分离计数、土壤悬液的制备、微生物培养和微生物数量的统计分析(见《土壤微生物研究法》第54-58页记载的“稀释平板法”，中国科学院南京土壤研究所微生物室编著，1985年，科学出版社出版)。在土壤悬液的制备方面具体操作为：称取10g土样，放入100ml无菌水中，置于200rpm的摇床上震荡半个小时，得到10-1土壤悬液。准确吸取1ml 10-1土壤悬液注入9ml无菌水中并反复吹吸，得到10-2土壤稀释液，照此方法依次稀释制备10-3-10-11稀释度的土壤稀释液。吸取1ml 10-4土壤稀释液接种细菌培养基、吸取1ml 10-2土壤稀释液接种放线菌培养基、吸取10-4土壤稀释液接种真菌培养基并各重复3次。但是该方法只适于制备土壤悬液，不能用于棉花纤维上携带的微生物的检测，原因是：(1)土壤和棉花纤维的密度大小差距较大，土壤菌悬液制备时需要的土壤重量较大，而相同质量的棉花纤维体积太大，具体操作起来不方便(我们在实验中发现，0.5g棉花纤维就能完全吸干10ml无菌水)；(2)对原始母液的稀释倍数也不一样，因为土壤的重量大，菌悬液的稀释倍数可稍微高一些，而棉花纤维的重量小，如果稀释倍数太高，其中某些含量较少的菌种会因不在菌落培养数之内而造成误差甚至出现错误，而如果稀释倍数太小，相对重量而言，无菌水太少不能完全浸没棉花纤维，引起棉花纤维上微生物不能完全脱离纤维，造成实验错误。
我国对棉花纤维上携带的微生物的研究较少，检测的方法尚属空白。因此亟需建立棉花纤维上携带的微生物的检测方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于检测棉花纤维上携带的微生物的方法。
本发明用于检测棉花纤维上携带的微生物的方法包括以下步骤：
(1)称取一定量的待测棉花纤维样品，计算所述棉花纤维样品的样品含水率；
(2)称取与步骤(1)中的所述待测棉花纤维样品等量的待测棉花纤维，并用无菌水浸泡，摇床培养1-3小时(优选2小时)，得到浸泡液母液；
(3)取部分所述浸泡液母液，使用无菌水进行梯度稀释得到稀释液；
(4)分别将0.1-0.3ml(优选0.3ml)稀释液接种在不同的选择性培养+基上，并在28℃-30℃的温度下进行培养；
(5)根据所述稀释液在所述不同的选择性培养基上的生长情况，鉴定所述棉花纤维上携带的微生物的种类；以及
(6)记录选择性培养基上的菌落数，然后求平板上菌落数的平均值，并根据下式计算所述棉花纤维样品的每克干样中微生物的数量
在本发明用于检测棉花纤维上携带的微生物的方法中：
其中步骤(1)中的样品含水率根据下式计算：
其中，W1为称取的棉花纤维样品的重量；W2为将称取的W1重量的棉花纤维样品放置在40℃烘箱中，热烘2小时后称量的重量。
其中步骤(2)的具体操作为：
将与步骤(1)中所述待测棉花纤维样品等量的待测棉花纤维置于一定量的无菌水中，手动摇晃至待测棉花纤维全部浸湿，置于转速为100-150rpm/min(优选120rpm/min)的摇床上培养1-3小时(优选2小时)，得到浸泡液母液；待测棉花纤维与无菌水的用量比例为0.1-0.3g∶10ml，优选0.1g∶10ml。
其中步骤(3)中的梯度稀释的倍数可由以下预实验步骤确定。
所述预实验步骤包括：
(i)称取一定量的待测棉花纤维，用无菌水将所述待测棉花纤维浸泡，其中所述待测棉花纤维与无菌水的用量比例为0.1-0.3g∶10ml(优选0.1g∶10ml)，摇床培养1-3小时(优选2小时)，得到浸泡液母液，然后使用无菌水对所述浸泡液母液进行梯度稀释，分别得到不同稀释倍数的稀释液；
(ii)将每一种所述不同稀释倍数的稀释液分别接种于不同的选择性培养基上，并在28℃-30℃的温度下进行培养；
(iii)计数不同的选择性培养基上的菌落数；以及
(iv)选择腐生好氧性细菌的选择性培养基、腐生厌氧性细菌的选择性培养基、放线菌的选择性培养基、好氧性纤维素分解菌的选择性培养基或厌氧性纤维素分解菌的选择性培养基上菌落数在20-200之间，真菌的选择性培养基上菌落数在10-100之间的稀释倍数用于本发明所述方法的步骤(3)。
其中，所述预实验步骤(i)中所述不同稀释倍数可为100倍、1000倍或10000倍等。步骤(ii)中的培养时间根据不同的选择性培养基而不同，例如对腐生好氧性细菌和腐生厌氧性细菌的选择性培养基的培养可为3-5天；对真菌的选择性培养基的培养可为5-7天；对放线菌的选择性培养基的培养可为7-10天；对好氧性纤维素分解菌和厌氧性纤维素分解菌的选择性培养基的培养可为5-7天。
其中步骤(4)中对不同的选择性培养基进行培养的时间根据不同的选择性培养基而不同，具体时间基本与上述预实验中步骤(ii)列举的各选择性培养基的培养时间相同。
其中步骤(5)的鉴定方法为根据不同微生物菌落特征进行鉴定。
其中步骤(6)的计数方法为平板计数法，即肉眼观察，记录整个平板上的菌落数。
本发明提供的用于检测棉花纤维上携带的微生物的方法具有较强的操作性和实用性，简单易行。
附图说明
附图为将待测棉花纤维样品的稀释液接种在不同的选择性培养基上的微生物生长情况。
图1为将待测棉花纤维样品的稀释液接种在腐生好氧性细菌的选择性培养基上3天后的微生物生长情况，所用的棉花纤维样品是中298，稀释倍数为1000倍。
图2为将待测棉花纤维样品的稀释液接种在腐生厌氧性细菌的选择性培养基上3天后的微生物生长情况，所用的棉花纤维样品是中3306-8，稀释倍数为1000倍。
图3为将待测棉花纤维样品的稀释液接种在真菌的选择性培养基上6天后的微生物生长情况，所用的棉花纤维样品是smdt，稀释倍数为100倍。两个培养皿的稀释倍数相同。
图4为将待测棉花纤维样品的稀释液接种在放线菌的选择性培养基上7天后的微生物生长情况，所用的棉花纤维样品是中095543，稀释倍数为100倍。两个培养皿的稀释倍数相同。
图5为将待测棉花纤维样品的稀释液接种在好氧性纤维素分解菌的选择性培养基上6天后的微生物生长情况，所用的棉花纤维样品是中103，稀释倍数为1000倍。
图6为将待测棉花纤维样品的稀释液接种在厌氧性纤维素分解菌的选择性培养基上6天后的微生物生长情况，所用的棉花纤维样品是中095505，稀释倍数为100倍。
具体实施方式
下面将结合附图对本发明作进一步的详细描述，以使本领域技术人员能够实践本发明。应当理解，可以采用其他实施方式，并且可以做出适当的改变而不偏离本发明的精神或范围。为了避免对于使本领域技术人员能够实践本发明来说不必要的细节，说明书可能省略了对于本领域技术人员来说已知的某些信息。因此，以下详细描述不应以限制性的意义来理解，且本发明的范围仅由所附权利要求界定。
在本发明用于检测棉花纤维上携带的微生物的方法中，稀释液的接种一般采用混合菌种接种，其接种步骤为：
吸取一定量的适当稀释倍数的稀释液于灭菌培养皿中，所述灭菌培养皿已注入选择性培养基，并且选择性培养基已凝固；
然后立即用玻璃刮刀将稀释液均匀涂抹于培养基表面。
所述一定量的适当稀释倍数的稀释液例如可为300μl，灭菌培养皿的直径例如可为9cm，所述选择性培养基的量例如可为15-20ml。培养温度例如可为28℃-30℃。
本发明用于检测棉花纤维上携带的微生物的方法中所使用的选择性培养基例如可以为腐生好氧性细菌的选择性培养基、腐生厌氧性细菌的选择性培养基、真菌的选择性培养基、放线菌的选择性培养基、好氧性纤维素分解菌的选择性培养基和厌氧性纤维素分解菌的选择性培养基以及本领域公知的其他选择性培养基。
本发明所述选择性培养基的组成可参考《土壤微生物研究法》，中国科学院南京土壤研究所微生物室编著，1985年，科学出版社出版。
例如，在本申请的发明中，所用到的选择性培养基根据《土壤微生物研究法》记载的内容，分别如下：
腐生好氧性细菌的选择性培养基：“牛肉膏蛋白胨培养基”；
腐生厌氧性细菌的选择性培养基：“高泽有机氮琼脂”培养基；
真菌的选择性培养基：“马丁氏培养基”；
放线菌的选择性培养基：“改良高氏1号培养基”；
好氧性纤维素分解菌的选择性培养基：“赫奇逊氏培养基”；以及
厌氧性纤维素分解菌的选择性培养基：“依姆歇涅茨基氏培养基”。
本发明用于检测棉花纤维上携带的微生物的方法中，鉴定棉花纤维上携带的微生物的种类的方法为：如果肉眼观察到本发明所述的某种选择性培养基上有微生物生长，则鉴定到待测棉花纤维样品含有此种微生物。例如，如果观察到接种了本发明所述待测棉花纤维样品的稀释液的腐生好氧性细菌的选择性培养基上有微生物生长，则鉴定到待测棉花纤维样品含有腐生好氧性细菌。
实施例1：预实验
进行预实验以确定各类微生物在棉花纤维上的数量及稀释倍数，所述预实验步骤包括：
(i)取6种待测棉花纤维(由中国农业科学院棉花研究所遗传育种研究室提供，品种名称分别为中103、smdt、中095505、中298、中3306-8和中095543)，分别称取0.1g；
(ii)用无菌水将所述棉花纤维浸泡，其中所述棉花纤维与无菌水的用量比例为0.1g∶10ml，控温摇床(型号：06112742；生产厂家：美国NBS；出厂编号：600515684)培养2小时，得到浸泡液母液，然后使用无菌水对浸泡液母液进行梯度稀释，分别得到100倍、1000倍、10000倍等不同稀释倍数的稀释液；
(iii)将每一种稀释液分别接种于不同的选择性培养基上(腐生好氧性细菌选择性培养基、腐生厌氧性细菌选择性培养基、真菌选择性培养基、放线菌选择性培养基、好氧性纤维素分解菌选择性培养基、厌氧性纤维素分解菌选择性培养基)并在28℃-30℃的温度下培养一段时间(对腐生好氧性细菌的选择性培养基和腐生厌氧性细菌的选择性培养基培养3天；对真菌的选择性培养基培养6天；对放线菌的选择性培养基培养7天；对好氧性纤维素分解菌的选择性培养基和厌氧性纤维素分解菌的选择性培养基培养6天)；
(iv)计数不同的选择性培养基上的菌落数，选择腐生好氧性细菌的选择性培养基、腐生厌氧性细菌的选择性培养基、放线菌的选择性培养基、好氧性纤维素分解菌的选择性培养基或厌氧性纤维素分解菌的选择性培养基上菌落数在20-200之间，真菌的选择性培养基上菌落数在10-100之间的稀释倍数用于正式实验。
预实验结果如表1所示，根据表1所示实验结果确定各样品测定微生物数量时浸泡液母液的稀释倍数如下：
测定中103棉花纤维上携带的腐生好氧性细菌、腐生厌氧性细菌、好氧性纤维素分解菌、厌氧性纤维素分解菌的稀释倍数均是1000倍；
测定smdt、中095505、中298和中095543棉花纤维上携带的腐生好氧性细菌、腐生厌氧性细菌的稀释倍数为1000倍，测定好氧性纤维素分解菌、厌氧性纤维素分解菌的稀释倍数为100倍；
测定中3306-8棉花纤维上携带的腐生好氧性细菌、腐生厌氧性细菌、厌氧性纤维素分解菌的稀释倍数为1000倍，测定好氧性纤维素分解菌的稀释倍数为100倍；
在接种浸泡液母液的情况下，未培养出放线菌和真菌菌落，说明本实验的几种棉花纤维样品携带的放线菌和真菌数量较少。
实施例2：检测棉花纤维上携带的微生物的种类及数量
称取两部分同等重量的待测棉花纤维样品，其中一部分用来检测棉花纤维样品的样品含水量，另一部分用来检测棉花纤维样品携带的微生物。本实验共包括6种棉花纤维材料，共检测6种可培养微生物。
(1)样品含水率测定：分别称取0.1g待测棉花纤维样品，放置在40℃烘箱(型号：DGG-9070AD；生产厂家：上海森信；出厂编号：06112742)中，热烘2小时后称重；然后根据下式计算样品含水率。
每样品重复3次测定含水率，取平均值。6种待测棉花纤维样品的含水率测定结果如表2所示。
表2：棉花纤维样品含水率
(2)以0.1g棉花纤维材料进行微生物的种类的鉴定及数量的计算：
①称取待测棉花纤维0.1g，置于装有10ml无菌水的50ml三角瓶中浸泡，手动摇晃至待测棉花纤维全部浸湿，在120rpm/min的摇床上培养；
②摇床培养2小时后，即为稀释100倍的浸泡液母液；
③取1ml浸泡液母液到9ml无菌水中，依次按10倍法稀释；各样品用于接种各细菌的浸泡液母液的稀释倍数如上述预实验中所确定的。由于各样品所携带的放线菌和真菌数量较少，因此接种放线菌和真菌的稀释倍数均取100倍，即直接采用浸泡液母液即可。
④分别吸取0.3ml的适当稀释倍数的稀释液于直径9cm的灭菌培养皿中，所述灭菌培养皿已注入选择性培养基15-20ml，并且所述选择性培养基已凝固；然后立即用玻璃刮刀将稀释液均匀涂抹于培养基表面；
⑤将接种了稀释液的培养皿，用封口膜封住，倒置于28℃-30℃恒温箱(型号：GZP-250A；生产厂家：南京恒裕；出厂编号：GA20705)中培养，培养时间根据不同微生物的种类而不同，腐生好氧性细菌和腐生厌氧性细菌均为3天，真菌为6天，放线菌为7天，好氧性纤维素分解菌和厌氧性纤维素分解菌均为6天；
⑥根据如附图所示选择性培养基上微生物生长的情况，鉴定微生物的种类，例如，图1表示在腐生好氧性细菌的选择性培养基上，腐生好氧性细菌的生长；图2表示在腐生厌氧性细菌的选择性培养基上，腐生厌氧性细菌的生长；
⑦计数选择性培养基上的菌落数，取平均值，并根据下述公式计算所述棉花纤维样品的每克干样中微生物的数量：
实验结果：
待测棉花纤维样品的稀释液接种在不同的选择性培养基上的微生物生长情况参见附图1-6。不同棉花纤维上的菌落计数的平均结果如表3所示。
表3：棉花纤维样品上的菌落平均数
根据表2和表3中的数据计算不同棉花纤维上携带的微生物数量，如表4所示。
表4.不同棉花纤维样品上微生物数量的检测结果(×106)
结果表明：不同的棉花纤维上携带的微生物数量中腐生好氧性细菌和腐生厌氧性细菌较多，其次为好氧性纤维素分解菌和厌氧性纤维素分解菌，未检测到放线菌和真菌。在接种原液的情况下，未培养出放线菌和真菌菌落，说明样品携带的放线菌和真菌数量较少；并且不同材料之间携带的微生物的数量也存在较大的差异。
本发明方法是以每个样品进行三次重复测定，每次重复中同一样品设置四份，也就说每个样品的每种微生物数量是经过12次重复检测得到的，均在符合的范围内，说明本方法重复性高，是可行的。
以上实施例说明，利用本方法检测棉花纤维上携带的微生物是可行的，可根据所要检测的微生物的种类选择相应的培养基来进行检测。
本发明利用6种选择性培养基，成功地对6种待测棉花纤维(中103、smdt、中095505、中298、中3306-8和中095543)上携带的6种微生物进行了检测。当然，可使用的选择性培养基和可检测的棉花纤维不限于本申请中实践的这些。本发明成功地建立了对棉花纤维上携带的微生物的检测方法。
综上所述，以上仅为本发明的较佳实施例而已，并非用于限定本发明的保护范围，因此，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (6)
1.一种用于检测棉花纤维上携带的腐生好氧性细菌和/或腐生厌氧性细菌的方法，所述方法包括以下步骤：
(1)称取一定量的待测棉花纤维样品，计算所述棉花纤维样品的样品含水率；
(2)称取与步骤(1)中的所述待测棉花纤维样品等量的待测棉花纤维，并用无菌水浸泡，摇床培养2小时，得到浸泡液母液，其中待测棉花纤维与无菌水的用量比例为0.1g：10ml；
(3)取部分所述浸泡液母液，使用无菌水进行梯度稀释得到稀释液；
(4)分别将0.1ml稀释液接种在用于腐生好氧性细菌和/或腐生厌氧性细菌的选择性培养基上，并在28℃-30℃的温度下进行培养3-5天；
(5)根据所述稀释液在所述选择性培养基上的生长情况，鉴定所述棉花纤维上携带的腐生好氧性细菌和/或腐生厌氧性细菌；以及
(6)记录选择性培养基上的菌落数，然后求平板上菌落数的平均值，并根据下式计算所述棉花纤维样品的每克干样中腐生好氧性细菌和/或腐生厌氧性细菌的数量
2.如权利要求1所述的方法，其中步骤(1)中的样品含水率根据下式计算：
其中，W1为称取的棉花纤维样品的重量；W2为将称取的W1重量的棉花纤维样品放置在40℃烘箱中，热烘2小时后称量的重量。
3.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(2)的具体操作为：
将与步骤(1)中所述待测棉花纤维样品等量的待测棉花纤维置于一定量的无菌水中，手动摇晃至待测棉花纤维全部浸湿，置于转速为120rpm/min的摇床上培养2小时，得到浸泡液母液。
4.如权利要求1所述的方法，其中步骤(3)中的梯度稀释的倍数由以下预实验步骤确定，所述预实验步骤包括：
(i)称取一定量的待测棉花纤维，用无菌水将所述待测棉花纤维浸泡，其中所述待测棉花纤维与无菌水的用量比例为0.1g：10ml，摇床培养2小时，得到浸泡液母液，然后使用无菌水对所述浸泡液母液进行梯度稀释，分别得到不同稀释倍数的稀释液；
(ii)将每一种所述不同稀释倍数的稀释液分别接种于所述选择性培养基上，并在28℃-30℃的温度下进行培养3-5天；
(iii)计数所述选择性培养基上的菌落数；以及
(iv)选择腐生好氧性细菌的选择性培养基、腐生厌氧性细菌的选择性培养基上菌落数在20-200之间的稀释倍数用于本发明所述方法的步骤(3)。
5.如权利要求4所述的方法，其中所述预实验步骤(i)中所述不同稀释倍数为100倍、1000倍或10000倍。
6.如权利要求1所述的方法，其中步骤(6)的计数方法为平板计数法，即肉眼观察，记录整个平板上的菌落数。
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