CN109468260A - 一种大豆灰斑病病原菌快速大量产孢的培养方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种大豆灰斑病病原菌快速大量产孢的培养方法，属于植物病原菌诱导产孢技术领域，首先配制产孢培养基，主要成分为V8蔬菜汁，碳酸钙，琼脂粉，25％乳酸和超纯水，然后将活化好的大豆灰斑病病原菌接种于培养基上，25‑28℃恒温培养箱暗培养8‑14天，再用无菌水洗脱分生孢子，显微镜下计量孢子数；本发明大大提高了大豆灰斑病病原菌产孢效率，具有菌落生长快，产孢量大，致病力持久，操作简单，稳定性好等优点，缩短了大豆灰斑病抗性品种鉴定周期，节约了人力物力，具有较高的应用价值，并为大豆灰斑病病害发生规律和防控手段的深入研究提供科学、有效的技术支撑。

Description

一种大豆灰斑病病原菌快速大量产孢的培养方法
技术领域
本发明涉及一种大豆灰斑病病原菌产孢的方法，属于植物病原菌诱导产孢技术领域。
背景技术
大豆灰斑病(Cercospora sojina Hara)是一种多循环性的世界性病害，以发病早、传播速度快、危害重为特点，特别是在大豆成株期流行性暴发，在阴冷潮湿的地区可造成感病品种减产5％-60％，严重影响大豆的产量和品质。
大豆灰斑病属于真菌病害，由大豆尾孢菌(Cercospora)侵染引起，孢子萌发和菌丝生长对温度都有一定的范围要求，空气湿度大的环境也利于该病的发生。大豆灰斑病病菌在现有的马铃薯琼脂培养基培养技术条件下，存在病菌生长速度缓慢，产孢时间长，易杂菌污染，不产孢或产孢数量少，孢子致病力下降等问题，不但阻碍了大豆灰斑病病原菌生活史和病害发生规律的研究，而且不利于开展对抗病品种进行鉴定筛选等相关工作。
因此，如何获得足量的、致病力稳定的分生孢子成为了当前大豆灰斑病理论研究和实践工作中首要解决的问题及技术难点。改进和提高现有大豆灰斑病病原菌产孢技术体系，可加快培育优良抗病品种，促进大豆产业的健康发展，同时也为灰斑病科学有效的防治方法提供了更有力的技术支撑。
发明内容
针对上述存在的问题，本发明提出了一种大豆灰斑病病原菌快速大量产孢的培养方法，不但可以有效解决传统方法不能很好的满足病原菌生长发育产生分生孢子的技术难题，而且具有菌落生长快、产孢量大、致病力持久等优点，可显著缩短抗性大豆品种的鉴定周期，加快培育优良大豆新品种，为进一步相关科研工作奠定了良好的基础。
为了实现上述的目的，本发明采用以下的技术方案：
一种大豆灰斑病病原菌快速大量产孢的培养方法，包括以下操作步骤：
1)病原菌菌种的活化：采用常规的组织分离法将大豆灰斑病病原菌进行单孢分离，取分离得到的大豆灰斑病病原菌保存于4℃冰箱备用，待使用时，取出置于32-35℃酒精浴槽中轻微晃动60s，然后将菌丝块与适量的无菌水研磨制成菌丝悬浮液，再在菌种活化培养基上加入0.2-0.25mL菌丝悬浮液，用曲玻棒涂抹均匀，活化培养，得病原菌备用；
2)产孢培养基的制备：取V8蔬菜汁(采用美国进口V8蔬菜汁，市售采购即可)，向其中加入适量碳酸钙混合溶解，将得到的V8蔬菜汁碳酸钙溶液以4000r/min离心10min，取上清液，然后加入超纯水定容至1000mL，再向其中加入琼脂粉，将其在高压灭菌锅内灭菌20min，取出冷却后在超净台内将其分装在培养皿中，同时每个培养皿加入25wt％乳酸，即得产孢培养基；
3)病原菌接种：取已经活化好的病原菌接种于产孢培养基上，然后放入25-28℃恒温培养箱中，黑暗条件下培养8-14天；
4)洗孢计数：在产孢培养皿中倒入适量无菌水，轻磨菌落，洗下分生孢子，用无菌纱布过滤后在显微镜下计量孢子数。
优选的，步骤1)中菌丝悬浮液中菌丝块与无菌水的质量体积比为1:2-4。
优选的，步骤1)菌种活化培养基采用马铃薯葡萄糖琼脂培养基。
优选的，步骤1)中活化培养时间为6-8天，温度为24-26℃。
优选的，以1000mL大豆灰斑病菌产孢培养基为基准，步骤2)产孢培养基中各原料取量为：120-150mLV8蔬菜汁、1.0-2.0g碳酸钙、15-20g琼脂粉、25wt％乳酸15-25μl、超纯水余量。
优选的，步骤2)中离心操作温度为26-28℃；高压灭菌锅中温度为120-125℃，压力为0.11-0.12MPa。
优选的，步骤3)中产孢培养基为倒置放入恒温培养箱中，且倒置前先用封口膜封好培养皿。
由于采用上述的技术方案，本发明的有益效果是：
1、相比传统的大豆灰斑病病原菌产孢技术，本发明的病原菌菌落平均生长速率更快，产孢量显著增加，有效的解决了大豆灰斑病菌生长发育产生分生孢子少的技术难题；
2、本大豆灰斑病病原菌产孢的方法步骤简单，操作方便，污染率低，且重复性高，稳定性好，可有效的缩短抗性品种鉴定周期，加快培育优良大豆品种，并为大豆灰斑病病原菌生活史、病害发生规律和防治方法等相关研究提供了充分的基础条件。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施案例中与传统产孢培养技术(对照)培养10天后菌落生长对比情况(左一为对照)；
图2为传统产孢培养技术(对照)培养10天后在10(目镜)×10(物镜)视野内观察到的分生孢子情况；
图3为本发明实施案例1中产孢培养技术培养10天后在10(目镜)×10(物镜)视野内观察到的分生孢子情况；
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。基于本发明的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
1、传统产孢培养技术/方法(对照)：
将200g马铃薯去皮切碎，文火煮30min，滤出残渣，加入20g琼脂粉和20g葡萄糖，溶解后定容至1000mL，高压灭菌20min，分装在培养皿中。将活化后的灰斑病菌种接种于培养基中，培养箱培养10-14天，洗脱孢子，镜检孢子数。
2、本方案产孢培养技术/方法
实施案例1：
1)病原菌菌种的活化：采用常规的组织分离法将大豆灰斑病病原菌进行单孢分离，将分离得到的大豆灰斑病病菌保存于4℃冰箱，使用前先取出置于32-35℃酒精浴槽中轻微晃动60s，然后用适量的无菌水研磨菌丝块制成悬浮液(菌丝块与无菌水的质量体积比为1:2)，取0.2mL悬浮液，用灭过菌的曲玻棒均匀涂抹于事先配好的病原菌活化培养基(马铃薯葡萄糖琼脂培养基)上，用封口膜将培养皿封好后倒置放入恒温培养箱，25℃培养6天，待用；
2)产孢培养基的制备：取120mL的V8蔬菜汁，加入碳酸钙1.5g，将得到的V8蔬菜汁碳酸钙溶液放入离心管中，4000r/min 26℃条件下离心10min，取上清液，加入超纯水定容至1000mL，然后加入15g琼脂粉，将其在高压灭菌锅内121℃，0.12Mpa条件下消毒20min，冷却后(温度约45℃)，在超净台内将其分装在直径9cm的培养皿中，厚度为0.3cm，同时每个培养皿加入灭过菌的25％乳酸20μl，待接菌用；
3)病原菌接种：用灭过菌的打孔器取活化好的病原菌接种于培养基上，用封口膜将培养皿封好后放入26℃恒温培养箱中，黑暗条件下培养10天；
4)洗孢计数：将适量无菌水倒入培养皿中，轻磨琼脂块上的菌落，用双层纱布过滤两次，洗下分生孢子，在显微镜下计量孢子数。
实施案例2：
1)病原菌菌种的活化：采用常规的组织分离法将大豆灰斑病病原菌进行单孢分离，将分离得到的大豆灰斑病病菌保存于4℃冰箱，使用前先取出置于32-35℃酒精浴槽中轻微晃动60s，然后用适量的无菌水研磨菌丝块制成悬浮液(菌丝块与无菌水的质量体积比为1:3)，取0.2mL悬浮液，用灭过菌的曲玻棒均匀涂抹于事先配好的病原菌活化培养基(马铃薯葡萄糖琼脂培养基)上，用封口膜将培养皿封好后倒置放入恒温培养箱，25℃培养6天，待用；
2)产孢培养基的制备：取140mL的V8蔬菜汁，加入碳酸钙1.7g，将得到的V8蔬菜汁碳酸钙溶液放入离心管中，4000r/min 26℃条件下离心10min，取上清液，加入超纯水定容至1000mL，然后加入16.4g琼脂粉，将其在高压灭菌锅内123℃，0.12Mpa条件下消毒20min，冷却后(温度约45℃)，在超净台内将其分装在直径9cm的培养皿中，厚度为0.3cm，同时每个培养皿加入灭过菌的25％乳酸18μl，待接菌用；
3)病原菌接种：用灭过菌的打孔器取活化好的病原菌接种于培养基上，用封口膜将培养皿封好后放入26℃恒温培养箱中，黑暗条件下培养12天；
4)洗孢计数：将适量无菌水倒入培养皿中，轻磨琼脂块上的菌落，用双层纱布过滤两次，洗下分生孢子，在显微镜下计量孢子数。
实施案例3：
1)病原菌菌种的活化：采用常规的组织分离法将大豆灰斑病病原菌进行单孢分离，将分离得到的大豆灰斑病病菌保存于4℃冰箱，使用前先取出置于32-35℃酒精浴槽中轻微晃动60s，然后用适量的无菌水研磨菌丝块制成悬浮液(菌丝块与无菌水的质量体积比为1:4)，取0.2mL悬浮液，用灭过菌的曲玻棒均匀涂抹于事先配好的病原菌活化培养基(马铃薯葡萄糖琼脂培养基)上，用封口膜将培养皿封好后倒置放入恒温培养箱，25℃培养8天，待用；
2)产孢培养基的制备：取150mL的V8蔬菜汁，加入碳酸钙2.0g，将得到的V8蔬菜汁碳酸钙溶液放入离心管中，4000r/min 26℃条件下离心10min，取上清液，加入超纯水定容至1000mL，然后加入18.6g琼脂粉，将其在高压灭菌锅内122℃，0.11Mpa条件下消毒20min，冷却后(温度约45℃)，在超净台内将其分装在直径9cm的培养皿中，厚度为0.3cm，同时每个培养皿加入灭过菌的25％乳酸15μl，待接菌用；
3)病原菌接种：用灭过菌的打孔器取活化好的病原菌接种于培养基上，用封口膜将培养皿封好后放入26℃恒温培养箱中，黑暗条件下培养12天；
4)洗孢计数：将适量无菌水倒入培养皿中，轻磨琼脂块上的菌落，用双层纱布过滤两次，洗下分生孢子，在显微镜下计量孢子数。
3、致病力检测
为了进一步验证传统产孢方法与本发明产孢方法在孢子致病力上的差异，按照如下步骤进行了致病力检测：
a.想洗下的分生孢子中加入无菌水，调至孢子悬浮液浓度5×105个/mL，孢子悬浮液中加入蔗糖25g/L；
b.在室内播种经过多年多点已验证的具有6个不同抗灰斑病级别的大豆材料各10份，每份10株，采用叶面喷雾法进行接种，保持室内温度在25-28℃，相对湿度80％-90％，两天后重复接种一次，观察12-20天，该试验的每份材料均设置三次重复以确保结果的准确性。根据病斑系数计算抗性级别，最后分析其致病力的差异，数据如下表格：
表1传统方法与本发明(实施案例1)的效果差异统计
表1中的“菌落直径”、“增长速率”、“产孢量”和“污染率”均为在产孢培养基培养10天后的统计数据，“抗病级别”为对大豆植株接种大豆灰斑病菌孢子悬浮液18天后鉴定出的抗感材料份数。
结果表明，与传统大豆灰斑病病原菌产孢方法相比，本发明的优势为菌落生长更快，是传统生长速率的1.32倍；产孢量显著增加，是传统方法产孢量的19倍，污染率降低了7个百分点，有效的解决了大豆灰斑病菌生长发育产生分生孢子少的技术难题；在孢子致病力方面，本发明在已知的经过多年多点验证过的60份不同抗病级别的大豆材料中，鉴定出的感病材料基本与已知的感病材料份数一致，而传统方法鉴定出的感病材料相对较少，说明本发明要比传统方法培养的分生孢子致病力更持久。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“示例”、“具体示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
以上公开的本发明优选实施例只是用于帮助阐述本发明。优选实施例并没有详尽叙述所有的细节，也不限制该发明仅为的具体实施方式。显然，根据本说明书的内容，可作很多的修改和变化。本说明书选取并具体描述这些实施例，是为了更好地解释本发明的原理和实际应用，从而使所属技术领域技术人员能很好地理解和利用本发明。本发明仅受权利要求书及其全部范围和等效物的限制。

Claims (7)

1.一种大豆灰斑病病原菌快速大量产孢的培养方法，其特征在于，包括以下操作步骤：
1)病原菌菌种的活化：采用常规的组织分离法将大豆灰斑病病原菌进行单孢分离，取分离得到的大豆灰斑病病原菌保存于4℃冰箱备用，待使用时，取出置于32-35℃酒精浴槽中轻微晃动60s，然后将菌丝块与适量的无菌水研磨制成菌丝悬浮液，再在菌种活化培养基上加入0.2-0.25mL菌丝悬浮液，用曲玻棒涂抹均匀，活化培养，得病原菌备用；
2)产孢培养基的制备：取V8蔬菜汁，向其中加入适量碳酸钙混合溶解，将得到的V8蔬菜汁碳酸钙溶液以4000r/min离心10min，取上清液，然后加入超纯水定容至1000mL，再向其中加入琼脂粉，将其在高压灭菌锅内灭菌20min，取出冷却后在超净台内将其分装在培养皿中，同时每个培养皿加入25wt％乳酸，即得产孢培养基；
3)病原菌接种：取已经活化好的病原菌接种于产孢培养基上，然后放入25-28℃恒温培养箱中，黑暗条件下培养8-14天；
4)洗孢计数：在产孢培养皿中倒入适量无菌水，轻磨菌落，洗下分生孢子，用无菌纱布过滤后在显微镜下计量孢子数。
2.根据权利要求1所述的大豆灰斑病病原菌快速大量产孢的培养方法，其特征在于：步骤1)中菌丝悬浮液中菌丝块与无菌水的质量体积比为1:2-4。
3.根据权利要求1所述的大豆灰斑病病原菌快速大量产孢的培养方法，其特征在于：步骤1)菌种活化培养基采用马铃薯葡萄糖琼脂培养基。
4.根据权利要求1所述的大豆灰斑病病原菌快速大量产孢的培养方法，其特征在于：步骤1)中活化培养时间为6-8天，温度为24-26℃。
5.根据权利要求1所述的大豆灰斑病病原菌快速大量产孢的培养方法，其特征在于：以1000mL大豆灰斑病菌产孢培养基为基准，步骤2)产孢培养基中各原料取量为：120-150mLV8蔬菜汁、1.0-2.0g碳酸钙、15-20g琼脂粉、25wt％乳酸15-25μl、超纯水余量。
6.根据权利要求1所述的大豆灰斑病病原菌快速大量产孢的培养方法，其特征在于：步骤2)中离心操作温度为26-28℃；高压灭菌锅中温度为120-125℃，压力为0.11-0.12MPa。
7.根据权利要求1所述的大豆灰斑病病原菌快速大量产孢的培养方法，其特征在于：步骤3)中产孢培养基为倒置放入恒温培养箱中，且倒置前先用封口膜封好培养皿。
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