CN113897296A - 一种人工快速培养芹菜尾孢菌及其接种物制备的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种人工快速培养芹菜尾孢菌及其接种物制备的方法。它是先将芹菜尾孢菌用固体培养基25‑28℃培养5~6d，菌体生长旺盛时用灭菌的打孔器制备成直径3‑5mm的菌块，将菌块接种于灭菌后黄豆培养基上并适当混匀，在28℃培养5~6d。将获得培养物用等体积无菌水充分搅拌混合后，过滤菌丝进行离心，制备成浓度为1×106个孢子/mL孢子悬浮液接种物。该接种物应用范围是用于由芹菜尾孢菌引起的作物病害接种，芹菜尾孢叶斑病抗性鉴定，防治芹菜尾孢叶斑病的杀菌剂药效试验，杀菌剂对芹菜尾孢菌的毒力测定等。本发明的方法操作简便，产孢时间短，产孢量大，致病力强，对于芹菜尾孢叶斑病的有效治理有实际意义。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种人工快速培养芹菜尾孢菌及其接种物制备的方法。
背景技术
芹菜尾孢（Cercospora apii）是一种重要的植物病原真菌，被发现可为害热带及亚热带等地区的伞形花科蔬菜。它主要危害植物的叶片，形成典型的病斑，也可侵染茎，严重时造成落叶、早衰等现象。近年来，我国芹菜等尾孢叶斑病的危害逐年加重，在幼苗期和成株期均能发病，以成株期受害较为严重，主要危害芹菜叶片，也可危害叶柄和茎，一般发病率在20%~40%，严重达60%以上，导致芹菜产量和质量严重下降，成为芹菜生产发展的重要限制因素。近年来随着芹菜栽培面积的增大，该病有逐年加重的趋势，造成了严重经济损失。气候适宜的条件下，芹菜尾孢叶斑病短期即可爆发，使芹菜生产遭受严重的损失。芹菜尾孢叶斑病的病原是芹菜尾孢菌, 是危害芹菜生产的一种重要病害。该病原菌潜育期短,传播快, 侵染力强, 对植物破坏性大。
芹菜尾孢叶斑病菌以附着在种子表面和侵入种皮内的菌丝及残留病株和土壤中菌丝与孢子越冬，初侵染源主要为带菌种子或残留病株。在环境条件适宜时，菌丝体产生分生孢子，通过气流传播至寄主植物上，在水滴存在的条件下从寄主表皮直接侵入，引起初次侵染。播种带病种子，出苗后即可染病，并在受害的部位产生新一代分生孢子，借气流风雨传播，进行多次再侵染，周而复始一直延续到秋末，危害逐步加重。重茬年限越长，病菌积累越多，发病越重。该病菌在5℃-35℃间均可生长温度，生长适温为20℃-30℃，发病适温为22～30℃，相对湿度85%～95%。芹菜尾孢菌在目前常用真菌培养基上均能生长发育并能产孢，只是菌丝生长缓慢，产孢量低。菌丝生长缓慢，产孢量低是制约芹菜尾孢叶斑病研究的瓶颈。为了顺利进行芹菜尾孢叶斑病人工接种抗病性鉴定，关键是在短期内繁殖大量的芹菜尾孢叶斑病菌孢子，因此，掌握芹菜尾孢叶斑病菌的孢子产生最佳条件是进行芹菜尾孢菌研究的先决条件。
由于芹菜尾孢菌不易保存，一般通过转接来保存较长时间，试验结果表明，长时期在同一培养基中培养，对其致病性有影响。芹菜尾孢菌常规培养保存，不断用繁殖菌丝连续培养多代，会造成菌株生活力退化，营养条件是致病力分化的重要因子，芹菜尾孢菌长时间在同一环境条件下生长，其致病性会逐渐发生变异，从而导致致病力的分化。进行抗病性鉴定前，有必要进行复壮，以消除因生活力衰退造成的试验误差。研究利用固体培养基如马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）、葡萄糖硝酸培养基（GNA）、马铃薯蔗糖琼脂培养基（PSA）和察贝克培养基（Czapek's）培养基上生长，10d菌落半径为12.25mm-14.00mm之间；在燕麦培养基（Oatmeal）、玉米培养基（Cornmeal）上次之，10d菌落半径仅为7mm-9.67mm之间；淀粉培养基（Starch）和水琼脂培养基（WaterAgar）上生长缓慢，且菌丝稀疏，10d半径增加值仅在4mm-5.5mm之间。形成菌丝体和孢子量少，致病力较弱。本发明人工培养方法得到的接种物孢子不仅数量多，时间短，且致病力强。
发明内容
本发明的目的是为解决芹菜尾孢菌快速形成大量孢子接种物的问题，为此，本发明提供了一种人工快速培养芹菜尾孢菌及其接种物制备的方法,其特征在于：
（1）芹菜尾孢菌制备方法：先将芹菜尾孢菌用PDA培养基25-28℃培养5-6d，菌体生长旺盛时用灭菌的打孔器制备成直径3mm-5mm的菌块，将菌块接种于灭菌后黄豆培养基中并适当混匀；
（2）孢子悬浮液接种物制备方法：将获得芹菜尾孢菌培养物用等体积无菌水充分搅拌混合后，过滤菌丝进行离心，制备成浓度为1×106个孢子/mL孢子悬浮液接种物；
所述的PDA培养基指的是：马铃薯琼脂葡萄糖培养基，其配制步骤：称取200g马铃薯，20g葡萄糖，15g琼脂；将马铃薯放于蒸馏水中煮30min后，进行过滤定容到1L，边搅拌边加入葡萄糖、琼脂，煮沸后装入锥形瓶中进行121℃高温蒸汽灭菌30min，灭菌完毕后即可使用；
所述的黄豆培养基指的是：将黄豆内添加芹菜汁制作而成，其配制步骤：称取1000g黄豆，芹菜叶100g；将1000g黄豆放于蒸馏水中充分浸泡24h沥干水分备用，将芹菜叶加入100mL蒸馏水后进行粉碎、过滤，制成芹菜浸出汁100mL，将芹菜浸出汁100mL加入备用黄豆中，充分搅拌后装入锥形瓶中进行121℃高温蒸汽灭菌30min，灭菌完毕后即可使用。
其中将用PDA培养基培养5d-6d芹菜尾孢菌菌块，接种于灭菌后黄豆培养基上并适当混匀，让芹菜尾孢菌菌块均匀分布于黄豆培养基中，菌块：黄豆培养基=5块：100mL，黄豆上表面附着满黑褐色芹菜尾孢霉层即培养完毕，为其菌丝和孢子培养物。
本发明进一步公开了人工快速培养芹菜尾孢菌及其接种物制备方法，用于芹菜尾孢菌引起的作物病害接种、芹菜尾孢叶斑病抗性方面的应用。特别是用于防治芹菜尾孢叶斑病的杀菌剂田间药效试验以及室内毒力测定方面。实验结果显示采用人工快速培养芹菜尾孢菌及其接种物制备方法，所获得孢子悬浮液接种物接种芹菜苗，致病力强，需要的孢子悬浮液量少，发病时间短，该方法不仅可以形成大量孢子，而且对菌株具有复壮作用。
本发明更加详细的描述如下：
本发明提供一种人工快速培养芹菜尾孢菌及其接种物制备的方法。它是先将芹菜尾孢菌用PDA培养基25℃-28℃培养5~6d，菌体生长旺盛时用灭菌的打孔器制备成直径3mm-5mm的菌块，将菌块接种于灭菌后的黄豆培养基中并适当混匀，在28℃、光照培养5d~6d。将获得芹菜尾孢菌培养物用等体积无菌水充分搅拌混合后，过滤菌丝进行离心，制备成浓度为1×106个孢子/mL孢子悬浮液接种物。所述的芹菜尾孢菌，是采用病样分离培养致病性鉴定的方法（参考方中达编著.植病研究方法（第3版），中国农业出版社，1998.12）进行病株分离培养得到。
本发明所述的培养基，其中的PDA培养基指的是马铃薯琼脂葡萄糖培养基，为普遍公开使用的培养基，其配制步骤：称取200g马铃薯，20g葡萄糖，15g琼脂。将马铃薯放于蒸馏水中煮30min后，进行过滤定容到1L，边搅拌边加入葡萄糖、琼脂，煮沸后装入锥形瓶中进行121℃高温蒸汽灭菌30min，灭菌完毕后即可使用。其中的黄豆培养基指的是将黄豆内添加芹菜汁制作而成，其配制步骤：称取1000g黄豆，芹菜叶100g。将1000g黄豆放于蒸馏水中充分浸泡24h沥干水分备用，将芹菜叶加入100mL蒸馏水后进行粉碎、过滤，制成芹菜浸出汁100mL，将芹菜浸出汁100mL加入备用黄豆中，充分搅拌后装入锥形瓶中进行121℃高温蒸汽灭菌30min，灭菌完毕后即可使用。
本发明所述的将芹菜尾孢菌菌块接种于灭菌后黄豆培养基中，为将准备好的芹菜尾孢菌菌块均匀分布于黄豆培养基中，其中每100mL体积黄豆培养基中接入芹菜尾孢菌块5块。
本发明所述的光照指的是：室内自然光，或培养箱内具有12小时光照和12小时黑暗。
本发明所述的人工快速培养芹菜尾孢菌方法，将芹菜尾孢菌菌块接种于灭菌后黄豆培养基中，并适当混匀后，在28℃、光照培养5d-6d，黄豆上表面附着满黑褐色芹菜尾孢霉层即培养完毕，为其菌丝和孢子培养物。
本发明所述芹菜尾孢菌接种物制备方法，是将获得芹菜尾孢菌培养物用等体积无菌水充分搅拌混合后，过滤菌丝进行离心，利用血球计数板于显微镜下镜检孢子浓度，制备成浓度为1×106个孢子/mL孢子悬浮液接种物。
本发明所述诱人工快速培养芹菜尾孢菌及其接种物制备的方法，可用于由芹菜尾孢菌引起的作物病害接种，芹菜尾孢叶斑病抗性鉴定，防治芹菜尾孢叶斑病的杀菌剂药效试验，杀菌剂对芹菜尾孢菌的毒力测定等的应用。
本发明所述人工快速培养芹菜尾孢菌及其接种物制备的方法，方法操作简便，产孢时间短，产孢量大，致病力强，对于芹菜尾孢叶斑病的有效治理有实际意义。
本发明对人工快速培养芹菜尾孢菌及其接种物制备进行了多次试验，试验结果显示，PDA培养基上培养时间长、形成的孢子数量少，将培养物制成孢子悬浮液接种芹菜苗，致病力弱，且需要大量的孢子悬浮液，发病时间长。而采用人工快速培养芹菜尾孢菌及其接种物制备方法，所获得孢子悬浮液接种物接种同一品种芹菜苗，致病力强，需要的孢子悬浮液量少，发病时间短。
本发明所述方法应用范围为用于由芹菜尾孢菌引起的作物病害接种，芹菜尾孢叶斑病抗性鉴定，防治芹菜尾孢叶斑病的杀菌剂药效试验，杀菌剂对芹菜尾孢菌的毒力测定等的应用。本发明提供的方法不仅可以形成大量孢子，而且对菌株具有复壮作用。本发明的方法操作简便，产孢时间短，产孢量大，致病力强，可用于大批量接种使用。
具体实施方式
下面通过具体的实施方案叙述本发明。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。本发明所用原料及试剂均有市售。其中靶标病原芹菜尾孢菌及非靶标病原菌、常见霉菌，由天津市农业科学院植物保护研究所分离、纯化、保存（存活良好），对于实验所用到的菌株可以联系天津市农业科学院植物保护研究所免费获得纯化菌株，地址：天津市西青区津静公路17公里处天津市农业科学院植物保护研究所，联系电话：022-86433374。芹菜品种为“加州皇”和“拿破仑”，本发明使用的芹菜品种均购于市场。
实施例1
将保存的芹菜尾孢菌用PDA培养基25℃培养5d，菌体生长旺盛时用灭菌的打孔器制备成直径3mm的菌块，将菌块接种于灭菌后的黄豆培养基中并适当混匀，在28℃、光照培养5d，黄豆上表面附着满黑褐色芹菜尾孢霉层即培养完毕，为其菌丝和孢子培养物。将获得芹菜尾孢菌培养物用等体积无菌水充分搅拌混合后，过滤菌丝进行离心，制备成浓度为1×106个孢子/mL孢子悬浮液接种物。
PDA培养基指的是马铃薯琼脂葡萄糖培养基，其配制步骤：称取200g马铃薯，20g葡萄糖，15g琼脂。将马铃薯放于蒸馏水中煮30min后，进行过滤定容到1L，边搅拌边加入葡萄糖、琼脂，煮沸后装入锥形瓶中进行121℃高温蒸汽灭菌30min，灭菌完毕后即可使用。
黄豆培养基指的是将黄豆内添加芹菜汁制作而成，其配制步骤：称取1000g黄豆，芹菜叶100g。将1000g黄豆放于蒸馏水中充分浸泡24h沥干水分备用，将芹菜叶加入100mL蒸馏水后进行粉碎、过滤，制成芹菜浸出汁100mL，将芹菜浸出汁100mL加入备用黄豆中，充分搅拌后装入锥形瓶中进行121℃高温蒸汽灭菌30min，灭菌完毕后即可使用。
实施例2
将保存的芹菜尾孢菌用PDA培养基28℃培养6d，菌体生长旺盛时用灭菌的打孔器制备成直径5mm的菌块，将菌块接种于灭菌后的黄豆培养基中并适当混匀，在28℃、光照培养6d，黄豆上表面附着满黑褐色芹菜尾孢霉层即培养完毕，为其菌丝和孢子培养物。将获得芹菜尾孢菌培养物用等体积无菌水充分搅拌混合后，过滤菌丝进行离心，制备成浓度为1×106个孢子/mL孢子悬浮液接种物。
PDA培养基指的是马铃薯琼脂葡萄糖培养基，其配制步骤：称取200g马铃薯，20g葡萄糖，15g琼脂。将马铃薯放于蒸馏水中煮30min后，进行过滤定容到1L，边搅拌边加入葡萄糖、琼脂，煮沸后装入锥形瓶中进行121℃高温蒸汽灭菌30min，灭菌完毕后即可使用。
黄豆培养基指的是将黄豆内添加芹菜汁制作而成，其配制步骤：称取1000g黄豆，芹菜叶100g。将1000g黄豆放于蒸馏水中充分浸泡24h沥干水分备用，将芹菜叶加入100mL蒸馏水后进行粉碎、过滤，制成芹菜浸出汁100mL，将芹菜浸出汁100mL加入备用黄豆中，充分搅拌后装入锥形瓶中进行121℃高温蒸汽灭菌30min，灭菌完毕后即可使用。
实施例3
将保存的芹菜尾孢菌用PDA培养基26℃培养5d，菌体生长旺盛时用灭菌的打孔器制备成直径5mm的菌块，将菌块接种于灭菌后的黄豆培养基中并适当混匀，在28℃、光照培养6d，黄豆上表面附着满黑褐色芹菜尾孢霉层即培养完毕，为其菌丝和孢子培养物。将获得芹菜尾孢菌培养物用等体积无菌水充分搅拌混合后，过滤菌丝进行离心，利用血球计数板于显微镜下镜检孢子浓度，制备成浓度为1×106个孢子/mL孢子悬浮液接种物。
用芹菜尾孢菌培养物制作不同浓度芹菜尾孢孢子菌丝混悬液，浓度分别为106个孢子/mL、105个孢子/mL、104个孢子/mL、103个孢子/mL，用于芹菜 “加州皇”和“拿破仑”苗期接种试验。每个处理准备10株芹菜苗，重复三次，幼苗2叶1心时进行接种，采用喷雾法接种，用小型喷雾器接种于芹菜叶片的正、反两面至有水滴流出为止。接种后置于接种室内黑暗保湿24h（RH85%-100%），接种期间温度控制在25℃～35℃。接种后10d、20d调查病情。
菌悬液在103-106个孢子/mL均可造成芹菜尾孢叶斑病发生，并随着菌液浓度的提高发生呈加重趋势。接种浓度为105个孢子/mL、106个孢子/mL，10d、20d后植株全部发病；浓度为104个孢子/mL，接种10d后，拿破仑植株已发病，接种20d后，两个品种芹菜植株均已发病；浓度为103个孢子/mL，仅接种10d后发病。105个孢子/mL为此方法的适宜接种浓度。
表1、接种不同浓度芹菜尾孢接种物芹菜的发病情况（10d、20d调查）
—：未发病；+：病斑占总叶面积≤2%；++：病斑占总叶面积3%~5%；+++：病斑占总叶面积6%~15%；++++：病斑占总叶面积>15%。
实施例3
常规方法：将芹菜尾孢转至PDA培养基平板上进行活化，28℃下培养5d，后挑取菌块转至PD培养液中，28℃进行震荡培养（100转/min），20d后，过滤菌丝获得孢子悬浮液，镜检每个视野（10×10）孢子数量。
本发明方法：将保存的芹菜尾孢菌用PDA培养基28℃培养5d，菌体生长旺盛时用灭菌的打孔器制备成直径3mm-5mm的菌块，将菌块接种于灭菌后的黄豆培养基中并适当混匀，在28℃、光照培养5d，黄豆上表面附着满黑褐色芹菜尾孢霉层即培养完毕，为其菌丝和孢子培养物。将获得芹菜尾孢菌培养物用等体积无菌水充分搅拌混合后，过滤菌丝获得孢子悬浮液，镜检每个视野（10×10）孢子数量。
表2、不同的培养方法对芹菜尾孢菌孢子形成的影响
结论：本发明的方法较常规方法培养芹菜尾孢菌产孢子数量大。
实施例4
菌株致病性退化的比较试验：
同一菌株活化后在PDA培养基上培养，分别挑取4代、9代菌块转至PD培养液中，28℃进行震荡培养（100转/min），20d后，过滤菌丝获得5代、10代孢子悬浮液。接种用孢子浓度为105个孢子/mL。到第10代后，用10代菌块接种于灭菌后的黄豆培养基中并适当混匀，在28℃、光照培养5d，获得10代后芹菜尾孢菌孢子悬浮液
致病性鉴定：每个处理准备10株芹菜苗，重复三次，幼苗2叶1心时进行接种，采用喷雾法接种，用小型喷雾器接种于芹菜叶片的正、反两面至与水滴流出为止。接种后置于接种室内黑暗保湿24h（RH85%-100%），接种期间温度控制在25℃，接种后10d调查病情。
表3 不同的转接代数对辣椒疫霉菌致病力的影响
由此可知，在PDA培养基上随着转接代数的增加同一菌株致病力减弱。在经过本发明的方法培养后致病力增强。
实施例5
每个处理准备10株芹菜苗，重复三次，幼苗2叶1心时进行。采用杀菌剂进行叶面喷雾，用喷雾器于芹菜叶片正、反两面均匀喷雾，至有水滴流出为止。24h后接种采用本发明培养芹菜尾孢菌制备的接种物，接种浓度为105个孢子/mL，采用喷雾法接种，用喷雾器接种于芹菜叶片的正、反两面至有水滴流出为止。接种后置于接种室内黑暗保湿24h（RH85%-100%），接种期间温度控制在25℃，接种后10d调查病情。
表4 几种杀菌剂对芹菜尾孢叶斑病的防效
10d后调查，几种杀菌剂对甜椒疫病的防效不同。此接种方法可以用于药效测定。
在详细说明的较佳实施例之后，熟悉该项技术人士可清楚地了解，在不脱离上述申请专利范围与精神下可进行各种变化与修改，凡依据本发明的技术实质对以上实施例所作任何简单修改、等同变化与修饰，均属于本发明技术方案的范围。且本发明亦不受说明书中所举实例实施方式的限制。
Claims (4)
1.一种人工快速培养芹菜尾孢菌及其接种物制备的方法，其特征在于：
（1）芹菜尾孢菌制备方法：先将芹菜尾孢菌用PDA培养基25-28℃培养5-6d，菌体生长旺盛时用灭菌的打孔器制备成直径3mm-5mm的菌块，将菌块接种于灭菌后黄豆培养基中并适当混匀；
（2）孢子悬浮液接种物制备方法：将获得芹菜尾孢菌培养物用等体积无菌水充分搅拌混合后，过滤菌丝进行离心，制备成浓度为1×106个孢子/mL孢子悬浮液接种物；
所述的PDA培养基指的是：马铃薯琼脂葡萄糖培养基，其配制步骤：称取200g马铃薯，20g葡萄糖，15g琼脂；将马铃薯放于蒸馏水中煮30min后，进行过滤定容到1L，边搅拌边加入葡萄糖、琼脂，煮沸后装入锥形瓶中进行121℃高温蒸汽灭菌30min，灭菌完毕后即可使用；
所述的黄豆培养基指的是：将黄豆内添加芹菜汁制作而成，其配制步骤：称取1000g黄豆，芹菜叶100g；将1000g黄豆放于蒸馏水中充分浸泡24h沥干水分备用，将芹菜叶加入100mL蒸馏水后进行粉碎、过滤，制成芹菜浸出汁100mL，将芹菜浸出汁100mL加入备用黄豆中，充分搅拌后装入锥形瓶中进行121℃高温蒸汽灭菌30min，灭菌完毕后即可使用。
2.权利要求1所述的人工快速培养芹菜尾孢菌及其接种物制备的方法,其中将用PDA培养基培养5-6d芹菜尾孢菌菌块，接种于灭菌后黄豆培养基上并适当混匀，让芹菜尾孢菌菌块均匀分布于黄豆培养基中，菌块：黄豆培养基=5块：100mL，黄豆上表面附着满黑褐色芹菜尾孢霉层即培养完毕，为其菌丝和孢子培养物。
3.权利要求1所述人工快速培养芹菜尾孢菌及其接种物制备方法在用于鉴定芹菜尾孢菌引起的作物病害接种、芹菜尾孢叶斑病抗性方面的应用。
4.权利要求1所述人工快速培养芹菜尾孢菌及其接种物制备方法在用于防治芹菜尾孢叶斑病的杀菌剂药效试验、毒力测定方面的应用。
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