CN114938809A - 武夷菌素和ε-聚赖氨酸的复配组合物及杀菌方法和应用 - Google Patents

武夷菌素和ε-聚赖氨酸的复配组合物及杀菌方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种武夷菌素和ε‑聚赖氨酸的复配组合物，包括武夷菌素和ε‑聚赖氨酸。本发明的有益效果是：ε‑聚赖氨酸与武夷菌素复配处理中植株体内CAT、POD、SOD、PAL的活性较高，且酶反应变化幅度更显著，酶活性增幅更大，使番茄植株在受到灰霉病菌的侵染时表现出更强的防御能力。武夷菌素与ε‑聚赖氨酸同时使用时防效明显增强，其在对菌丝生长的抑制和孢子萌发的抑制方面均得到增强，同时，植物的叶片色泽鲜艳，无明显药害产生。一方面加入ε‑聚赖氨酸减轻了武夷菌素成本高的问题，另一方面加入武夷菌素后可减轻高浓度的ε‑聚赖氨酸产生的药害。

Description

武夷菌素和ε-聚赖氨酸的复配组合物及杀菌方法和应用
技术领域
本发明涉及武夷菌素和ε-聚赖氨酸复配领域，更具体地说涉及一种武夷菌素和ε-聚赖氨酸的复配组合物及杀菌方法和应用。
背景技术
武夷菌素(又称BO-10)，是1979年在福建省武夷山上采集的土壤样品中依据微生物菌株代谢产物的抑菌活性、内吸性等标准筛选到的武夷菌素原始菌种，根据菌株的形态特征和生理生化特点，进行分类鉴定并命名为不吸水链霉菌武夷变种(Streptomycesahygroscopicus var.wuyiensis)，后期经过分子鉴定和全基因组测序比对将其更名为小白链霉菌武夷变种(S.albulus var.wuyiensis)。
武夷菌素粗制品经Sephadex-G-25柱层析、水洗脱等方法可制备成精制品，其中有两种不同有效成分武夷菌素a和b，其中a成分的含量占86％左右，b成分的含量为13％左右。主效成分a通过红外光谱、碳谱、氢谱分析，确定该组分的分子式C13H21N3O14，是一种含有胞苷骨架和过氧键的核苷类抗生素，该化合物是一种结构全新、具有自主知识产权的新型农用抗生素。
武夷菌素对番茄灰霉病具有较好的防治效果，其防效在80％以上，好于化学农药速克灵。随着浓度的增加，武夷菌素的防治效果会得以提升，但武夷菌素成本较高，经济成本问题会影响大面积推广使用，如何能够在较低成本的条件下，利用武夷菌素达到抑菌的效果，成为目前研究的一个新的难题。
发明内容
本发明克服了现有技术中的不足，提供了一种武夷菌素和ε-聚赖氨酸的复配组合物，还涉及该组合物杀菌方法，及其在抑制病原菌方面的应用。
本发明的目的通过下述技术方案予以实现。
一种武夷菌素和ε-聚赖氨酸的复配组合物，包括武夷菌素和ε-聚赖氨酸。
一种武夷菌素和ε-聚赖氨酸的复配组合物在制备植物杀菌剂方面的应用。
一种武夷菌素和ε-聚赖氨酸的复配组合物在抑制灰霉菌方面的应用。
优选地，该应用包括抑制灰霉菌生长。
由上述任一方案优选的是，该应用还包括抑制灰霉菌孢子的萌发。
一种武夷菌素和ε-聚赖氨酸的复配组合物杀菌的方法，具体为将武夷菌素和ε-聚赖氨酸混合后喷洒于植物的叶片。
优选地，所述植物为番茄或草莓。
本发明的有益效果为：
ε-聚赖氨酸与武夷菌素复配处理中植株体内CAT、POD、SOD、PAL的活性较高，且酶反应变化幅度更显著，酶活性增幅更大，使番茄植株在受到灰霉病菌的侵染时表现出更强的防御能力。
武夷菌素与ε-聚赖氨酸同时使用时防效明显增强，其在对菌丝生长的抑制和孢子萌发的抑制方面均得到增强，同时，植物的叶片色泽鲜艳，无明显药害产生。
加入ε-聚赖氨酸减轻了武夷菌素成本高的问题，另一方面加入武夷菌素后可减轻高浓度的ε-聚赖氨酸产生的药害。
本发明属于农用抗生素，对环境无污染，没有农药残留，不会破坏生态平衡，经济成本低，防效效果好，为绿色植保及农业可持续发展做出了一定的贡献。
附图说明
图1是ε-聚赖氨酸的抑菌谱试验效果图；
图2是ε-聚赖氨酸的抑菌谱试验效果图；
图3是ε-聚赖氨酸与武夷菌素复配对灰霉菌丝生长的抑制作用的效果图；
图4是ε-聚赖氨酸与武夷菌素复配使用与单独使用ε-聚赖氨酸对灰霉菌丝生长的抑制率的比较图；
图5是不同处理下的灰霉菌丝形态；
图6是不同处理下的灰霉孢子形态；
图7是不同处理下对番茄叶片的抑菌作用；
图8是扫描电镜下各处理对番茄灰霉病菌菌丝的影响；
图9是扫描电镜下各处理对番茄灰霉病菌孢子的影响；
图10是不同处理下在番茄叶片不同时间点的CAT活性；
图11是不同处理下在番茄叶片不同时间点的POD活性；
图12是不同处理下在番茄叶片不同时间点的SOD活性；
图13是不同处理下在番茄叶片不同时间点的PAL活性。
图14a是2000μg/mLε-聚赖氨酸+60μg/mL武夷菌素处理下的草莓植株田间试验结果；
图14b为2000μg/mLε-聚赖氨酸单独处理下的草莓植株田间试验结果。
具体实施方式
下面通过具体的实施例对本发明的技术方案作进一步的说明。
一、ε-聚赖氨酸的抑菌谱试验
选取番茄灰霉病菌、苹果轮纹病菌、番茄叶霉病菌、大豆核盘病菌、玉米小斑病菌、葡萄黑腐病菌、黄瓜炭疽病菌、棉果疫病菌、苹果腐烂病菌、烟草赤星病菌、芦笋茎枯病菌这12种病原菌作为靶标菌，测定其抑菌谱。每个病原菌设5个ε-聚赖氨酸浓度处理，分别为100ppm、300ppm、500ppm、1000ppm、2000ppm，在PDA培养基中分别加入不同量的ε-聚赖氨酸，制成相应浓度的带菌平板。将活化后的病原菌用打孔器打成0.6cm的菌饼，放置在带菌平板中央，放置在25℃的培养箱中培养3～5d，当对照菌落长满培养皿时，测量菌落直径，计算抑菌率，得到其抑菌谱。
抑制率＝(对照组菌落直径-处理组菌落直径)/对照组菌落直径×100％
如图1、图2所示试验结果：ε-聚赖氨酸对多种病原菌的抑菌效果如图所示，ε-聚赖氨酸对多种病原菌的菌丝生长具有明显的抑制作用，且随着药剂浓度的增大抑制作用加强。
如表1所示，对抑制率进行数据分析，得到ε-聚赖氨酸对病原菌的菌丝生长的毒力回归方程及EC50值，结果表明，ε-聚赖氨酸对灰霉、烟草赤星、番茄叶霉、苹果腐烂均有较好的抑菌效果，EC50值均未超过400ug/mL，其中对番茄灰霉的抑菌效果最好，EC50为328.39ug/mL。
表1ε-聚赖氨酸对不同病原菌的毒力回归方程和EC50
Figure BDA0003623822360000031
Figure BDA0003623822360000041
二、ε-聚赖氨酸与武夷菌素复配研究
材料获得：
武夷菌素由不吸水链霉菌武夷变种(Streptomyces ahygroscopicusvar.wuyiensis)CK-15的发酵液中获得，该菌种保藏已在中国微生物菌种保藏中心(简称CGMCC)保藏，保藏号为No.0703；ε-聚赖氨酸为现有市面上购买即可。
1、对灰霉菌丝生长的抑制作用
制备100μg/mL、200μg/mL、300μg/mL、400μg/mL、500g/mL的ε-聚赖氨酸，100μg/mL、12.5μg/mL、25μg/mL、50μg/mL的武夷菌素的以及各个浓度复配的含药平板，以不加药的平板作为对照，将灰霉菌饼接种于培养皿中央，23℃恒温培养4～5d，待对照菌落长满培养皿时，测量菌落直径，计算抑菌率。以无菌水为对照，每个处理重复3次。
如图3、图4和表2所示，试验结果为：单独使用25μg/mL的武夷菌素时其抑制率为38.81％，当ε-聚赖氨酸与武夷菌素复配后使ε-聚赖氨酸对菌丝生长的抑制作用得到了增强，ε-聚赖氨酸浓度为500μg/mL时抑制率达到了87.71％。
因此，可以表明ε-聚赖氨酸的添加对武夷菌素的抑菌效果有一定的增效作用，并且与ε-聚赖氨酸的浓度呈正相关。
表2不同浓度的ε-聚赖氨酸及武夷菌素复配联用的效果
Figure BDA0003623822360000042
Figure BDA0003623822360000051
2、对灰霉菌丝形态的影响
将玻璃纸剪成直径为9cm大小的圆形，经灭菌处理后铺在ε-聚赖氨酸500μg/mL，武夷菌素25μg/mL，ε-聚赖氨酸500μg/mL+武夷菌素25μg/mL的含药PDA平板及不含药的对照平板上，将活化后的灰霉病菌用打孔器打成0.6cm的菌饼，放置在带菌平板中央，放置在20℃的培养箱中培养3d，之后将玻璃纸取下，取菌落边缘处的玻璃纸剪成1cm大小的方块，正面朝上放在滴有100μL无菌水的载玻片上，放在研究级生物显微镜下观察菌丝形态。
试验结果如图5所示，经无菌水处理的对照组菌丝纤细直长，粗细均匀一致，线条流畅，分枝正常，分枝的形成距顶端有一定的距离，胞质均匀透明。
经ε-聚赖氨酸处理过的菌丝生长杂乱，菌丝分枝增多，分枝间距变短末端分支变短，胞质均匀透明。
经武夷菌素处理过的菌丝分枝减少，生长点顶端膨大，胞质均匀透明。
经武夷菌素+ε-聚赖氨酸处理过的菌丝生长杂乱，生长点出现大量分枝，分枝间距及末端分支变短，生长点顶端膨大，菌丝不再有明显的生长，胞质出现凝缩。
3、ε-聚赖氨酸与武夷菌素复配对灰霉孢子萌发的影响
将培养7d番茄灰霉病菌孢子制备成孢子悬浮液，调节孢子悬浮液浓度至低倍镜下每视野50～60个孢子备用，将ε-聚赖氨酸配制成100μg/mL、200μg/mL、300μg/mL、400μg/mL、500μg/mL的母液，将武夷菌素分别稀释为10μg/mL、20μg/mL、40μg/mL、60μg/mL、80μg/mL、120μg/mL。
配制武夷菌素与ε-聚赖氨酸组合浓度为ε-聚赖氨酸200μg/mL+武夷菌素10μg/mL、ε-聚赖氨酸200μg/mL+ε-武夷菌素20μg/mL、ε-聚赖氨酸200μg/mL+武夷菌素40μg/mL、ε-聚赖氨酸200μg/mL+武夷菌素60μg/mL、ε-聚赖氨酸200μg/mL+武夷菌素80μg/mL、ε-聚赖氨酸200μg/mL+武夷菌素120μg/mL。
取配好的组合物各5mL分别加入离心管中，再加入5mL制备好的孢子悬浮液作为处理，取5mL蒸馏水加入离心管中，再加入5mL制备好的孢子悬浮液作为对照，用移液枪分别取处理和对照各20μL滴加在双凹载玻片上，盖上盖玻片，每处理重复3次。
将载玻片按不同的处理分别放在培养皿内(皿中垫吸水纸加水保湿)，置于光照培养箱中于24℃恒温下培养，每隔12h观察处理的样品孢子萌发情况，当镜检对照有90％的番茄灰霉病菌孢子萌发时(约36h)，分别检查各处理的孢子萌发率，每处理镜检孢子数不少于100个，并计算孢子萌发率。
萌发率＝发芽孢子数/检查孢子总数×100％
校正抑制萌发率＝(对照萌发率-处理萌发率)/对照萌发率×100％
如表3所示试验结果表明，ε-聚赖氨酸和武夷菌素可以有效抑制灰霉病菌孢子萌发，随着浓度的增高，孢子萌发的抑制率越大。
单独使用ε-聚赖氨酸时，浓度为500μg/mL时，对孢子的抑制率达到92.16％；
单独使用武夷菌素时，浓度为120μg/mL时，对孢子的抑制率达到96.08％；
当武夷菌素和ε-聚赖氨酸复配时，可观察到孢子的萌发被显著抑制。并且，只需浓度为200μg/mLε-聚赖氨酸与浓度为60μg/mL的武夷菌素，抑制率就能达到100％，即孢子几乎不能萌发。
设置清水作为对照组、200μg/mLε-聚赖氨酸单独使用组、60μg/mL武夷菌素单独使用组，200μg/mLε-聚赖氨酸+60μg/mL武夷菌素复配使用组，如图6所示，显微观测表明，当200μg/mL的ε-聚赖氨酸处理24小时，部分孢子萌发产生的芽管会出现皱缩、畸形等症状。孢子萌发的过程是一个生长过程,其中有复杂的生理生化反应作为支持。因此，ε-聚赖氨酸只要抑制任何一个反应,就会抑制孢子的萌发，同时抑制芽管的生长。
表3ε-聚赖氨酸和武夷菌素复配抑制灰霉病菌孢子萌发的效果
Figure BDA0003623822360000061
Figure BDA0003623822360000071
二、武夷菌素与ε-聚赖氨酸复配对番茄灰霉病的离体叶片试验
1、ε-聚赖氨酸对番茄离体叶片上病斑扩展的抑制作用
将番茄种子催芽后播种于装有营养基质的盆中，每盆一株，移栽后浇透水保证水分充足，放置于26℃的环境下，光照与黑暗各12小时的条件下进行培养。待番茄苗长至5-6叶期时，选取长势一致的番茄叶片，用无菌水冲洗叶片去掉表面杂质，在叶柄处覆盖棉花保湿，在叶片上喷洒不同浓度组合的药剂，24h后在叶片上喷洒2％浓度的葡萄糖溶液并接种灰霉病原菌，放置在23℃，90％湿度的培养箱中培养并每天喷水保湿，3d后调查发病情况。
其中，药剂分别为清水对照、60μg/mL武夷菌素、1500μg/mLε-聚赖氨酸、2000μg/mLε-聚赖氨酸，2500μg/mLε-聚赖氨酸，3000μg/mLε-聚赖氨酸，60μg/mL武夷菌素+1500μg/mLε-聚赖氨酸，60μg/mL武夷菌素+2000μg/mLε-聚赖氨酸，60μg/mL武夷菌素+2500μg/mLε-聚赖氨酸，60μg/mL武夷菌素+3000μg/mLε-聚赖氨酸。
相对防治效果(％)＝(对照病斑直径-处理病斑直径)/对照病斑直径×100％
如图7及表4所示，结果表明，ε-聚赖氨酸单独处理时浓度为1500μg/mL抑菌效果最好，为72.22％，之后随着浓度增大防效降低且出现药害，具体表现为叶片发黄并产生黑色斑点；
60μg/mL的武夷菌素单独处理时防效为38.89％；
60μg/mL的武夷菌素与1500μg/mL的ε-聚赖氨酸同时使用时防效明显增强，为88.89％，且叶片色泽鲜艳，无明显药害产生，综上所述，ε-聚赖氨酸的添加可提高武夷菌素的防效，武夷菌素可减轻高浓度的ε-聚赖氨酸产生的药害。
表4不同药剂组的防治效果
Figure BDA0003623822360000081
2、扫描电镜下ε-聚赖氨酸对番茄离体叶片上病原菌的影响
选取长势一致的番茄叶片，用无菌水冲洗叶片去掉表面杂质，在叶柄处覆盖棉花保湿，在叶片上分别喷洒浓度为60μg/mL的武夷菌素，浓度为1500μg/mL的ε-聚赖氨酸，60μg/mL武夷菌素+1500μg/mLε-聚赖氨酸这三组药剂，24h后在叶片上喷洒2％浓度的葡萄糖溶液并接种灰霉病原菌，放置在温度为25℃、湿度为90％的培养箱中培养，并每天喷水保湿。样品培养24h、48h后各取样一次，将叶片病健交界处剪成5mm大小的方块，放置在装满固定液的1.5mL尖头离心管中，每个处理取六个样品，室温避光固定48h。之后用体积分数3％-4％的戊二醛室温下固定4～6h,用磷酸缓冲液(PBS,pH 6.8)冲洗4～6次，每次间隔20～30min,后经系列丙酮(体积分数为30％、50％、70％、80％、90％、95％、100％)梯度脱水，每次间隔30min,CO2临界点干燥、粘样、镀膜后在扫描电镜下观察、拍照。
如图8、图9所示试验结果：
菌丝量：与对照相比ε-聚赖氨酸和武夷菌素处理过的样品菌丝量均有所下降，武夷菌素+ε-聚赖氨酸处理的样品菌丝量最少。
菌丝形态：对照组菌丝伸展良好，表面光滑饱满，粗细均匀一致，线条流畅，生长点尖细；武夷菌素处理组菌丝轻微扭曲，菌丝干瘪纤细，分支间距变短，生长点畸形；ε-聚赖氨酸处理组菌丝扭曲变形，部分菌丝出现塌陷，生长点顶端钝圆；武夷菌素+ε-聚赖氨酸处理组菌丝严重畸形且更为纤细，部分菌丝扭曲呈螺旋状，生长点出现畸形，呈膨大或念珠状。
产孢情况：对照组产孢量多，孢子表面光滑、饱满、发育良好。经武夷菌素和ε-聚赖氨酸分别处理后产孢量明显下降，孢子轻微皱缩。经武夷菌素+ε-聚赖氨酸处理后产孢量明显下降，孢子凹陷变形，生长发育不良，无法正常萌发。
3、武夷菌素与ε-聚赖氨酸对番茄叶片中抗性相关酶活性的影响
3.1植株的处理
选取长势一致的的5-6叶期健康番茄植株，共设4个处理，分别为清水对照、ε-聚赖氨酸1500μg/mL、武夷菌素50μg/mL、武夷菌素50μg/mL+ε-聚赖氨酸1500μg/mL。
将配置好的药剂喷施于叶片表面至全部润湿，待叶片自然晾干后放置于温度为23℃，湿度为90％的培养箱中培养。处理3d后接种番茄灰霉菌的孢子悬浮液，每个处理3个植株，每个植株重复三次，剪取0.1g处理后0h、6h、12h、24h、48h的植株叶片,用锡纸包裹放置于液氮中，进行番茄叶片中抗性相关酶活性的测定。
3.2过氧化氢酶(CAT)活性的测定
1)粗酶液的提取：加入0.1g样品以及1mL磷酸缓冲液(pH 7.0)置于预冷的研钵中充分研磨至匀浆，研磨后转移到1.5mL离心管中，在4℃,8000r/min的条件下离心10min，离心后取上清得到粗酶液。
2)CAT活性的测定：在96孔UV板中加入190μL 1mol/L的H2O2和10μL粗酶液，立即混匀并开始计时，在预热30min的酶标仪中测定240nm波长下5s时吸光值A1和60s时吸光值A2。
3)CAT活性计算：
单位定义:每g组织每分钟催化1μmol H2O2降解定义为一个酶活力单位。
CAT(U/g)＝ΔA x V1 x V2x106/(εx d1 x V3x T)＝(917.4×ΔA)/W
注：ΔA＝A1-A2,W:样品质量，V1：体系总体积，V2:粗酶液总体积，V3:反应体系中加入粗酶液的体积，ε:H2O2摩尔消光系数，43.6L/mol/cm，d1：96孔UV板光径，T：反应时间。
3.3超氧化物歧化酶(SOD)含量的测定
1)粗酶液的提取：加入0.1g样品以及1mL磷酸缓冲液(pH 7.8)提取液置于在冰上预冷的研钵中充分研磨，研磨后转移到1.5mL离心管中，在4℃,8000r/min的条件下离心10min，离心后取上清得到粗酶液。
2)SOD活性的测定：采用超氧化物歧化酶(SOD)活性检测试剂盒(北京盒子生工科技有限公司)在96孔板中按说明依次加入试剂，
测定组(20μL粗酶液，90μL pH 7.8磷酸缓冲液，40μL 220mmoL/L的甲硫氨酸，40μL1.25mmoL/L氯化硝基四氮唑蓝溶液，10μL 0.033mmoL/L核黄素)；
对照组(20μL粗酶液，90μL pH 7.8磷酸缓冲液，40μL 220mmoL/L的甲硫氨酸，40μL1.25mmoL/L氯化硝基四氮唑蓝溶液，10μL蒸馏水)；
空白组1(20μL蒸馏水，90μL pH 7.8磷酸缓冲液，40μL 220mmoL/L的甲硫氨酸，40μL 1.25m moL/L氯化硝基四氮唑蓝溶液，10μL 0.033mmoL/L核黄素)；
空白组2(30μL蒸馏水，90μL pH 7.8磷酸缓冲液，40μL 220mmoL/L的甲硫氨酸，40μL 1.25mmoL/L氯化硝基四氮唑蓝溶液)；
充分混匀，25℃准确反应30分钟，在预热30min的酶标仪中测定560nm波长下测吸光值，记为A测定、A对照、A空1、A空2。
3)SOD活性计算：
SOD酶活性单位定义:在上述黄嘌呤氧化酶偶联反应体系中抑制百百分率为50％时，反应体系中的SOD酶活力定义为一个酶活力单位。
ΔA测定＝A测定-A对照，ΔA空白＝A空1-A空2,W＝样品质量
抑制百分率＝(ΔA空白-ΔA测定)/ΔA空白×100％
SOD(U/g)＝10×抑制百分率×D/(1-抑制百分率)×W
3.4过氧化物酶(POD)含量的测定
1)粗酶液的提取：加入0.1g样品以及1mL磷酸缓冲液(pH 7.0)置于预冷的研钵中充分研磨，研磨后转移到1.5mL离心管中，在4℃,8000r/min的条件下离心10min，离心后取上清得到粗酶液。
2)POD活性的测定：在96孔板中按说明依次加入0.3％H20220μL,0.2％愈创木酚20μL,pH7.0磷酸缓冲液150μL，最后加入10μL粗酶液立即充分混匀并开始计时，在预热30min的酶标仪中测定470nm处30s时的吸光值A1和90s时的吸光值A2，计算ΔA＝A2-A1。
3)POD活性计算：
单位定义:每g组织在每mL体系中每分钟A470变化0.005为一个酶活力单位。
POD(U/g)＝ΔAxV反总xV样总/(0.005xWxV样xT)＝4000xΔA/0.1
注释：W:样品质量，V反总：体系总体积，V样总:粗酶液总体积，V样:反应体系中加入粗酶液的体积，T：反应时间。
3.5苯丙氨酸解氨酶(PAL)含量的测定
1)粗酶液的提取：加入0.1g样品以及1mL硼酸缓冲液(pH 8.8)置于预冷的研钵中充分研磨，研磨后转移到1.5mL离心管中，在4℃,8000r/min的条件下离心10min，离心后取上清得到粗酶液。
2)PAL活性的测定：采用苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性检测试剂盒(北京盒子生工科技有限公司)的方法，在96孔板中按说明依次加入145μL硼酸缓冲液(pH 8.8)、40μL0.02mol.L-1苯丙氨酸和5μL粗酶液，充分混匀，30℃准确反应30min后加入10μL6mol.L-1HCl终止反应，室温静置10min，在预热30min的酶标仪中测定290nm处的吸光值，计为A测定和A空白，计算ΔA＝A测定-A空白。
3)PAL活性计算：
单位定义:每g组织在每mL体系中每分钟使290nm处吸光值变化0.1为一个酶活力单位。
PAL(U/g)＝ΔAxV反总xV提/(0.1xWxV样xT)＝13.33xΔA/W
注释：W:样品质量，V反总：体系总体积，V样:粗酶液总体积，V提:反应体系中加入粗酶液的体积，T：反应时间。
如图10所示接种灰霉菌后，各处理组的CAT活性均有所升高，对照组的CAT活性在6h时达到峰值，从其他处理组均在12h时达到峰值然后下降。其中1500μg/mLε-聚赖氨酸+60μg/mL武夷菌素处理组的CAT活性均显著高于对照组和1500μg/mLε-聚赖氨酸及60μg/mL武夷菌素处理组，在12h时达到最高水平，是对照组的2.58倍。
如图11所示对POD活性的检测结果发现，对照组和60μg/mL武夷菌素处理组POD活性变化趋势一致，在48h内POD活性均逐渐增加。1500μg/mLε-聚赖氨酸和1500μg/mLε-聚赖氨酸+60μg/mL武夷菌素处理组的POD活性变化趋势一致，POD活性在12h前迅速增加，在12h时达到峰值，随后下降。其中在1500μg/mLε-聚赖氨酸+60μg/mL武夷菌素的处理中，接种后12小时POD含量最高，是对照组的3.66倍。
如图12所示处理后的植株SOD活性在48h内均有一定的变化。对照组和处理组在12h内诱导番茄叶片中SOD活性迅速增加，12小时后下降。单一生物杀菌剂1500μg/mLε-聚赖氨酸和单一的60μg/mL武夷菌素处理组在24h时均略高于对照组。联合生物杀菌剂(1500μg/mLε-聚赖氨酸+60μg/mL武夷菌素)的SOD活性始终高于对照组和其他处理组，并在48h时突然增加，显著高于对照组和单一生物杀菌剂ε-聚赖氨酸和武夷菌素处理组。
如图13所示1500μg/mLε-聚赖氨酸和60μg/mL武夷菌素单剂处理后的植株在48h内的PAL活性呈逐渐上升的趋势。经过ε-聚赖氨酸与武夷菌素复配处理后接种植株的PAL活性在12h时达到峰值，PAL活性变化幅度显著高于其他处理组，分别是清水对照，武夷菌素处理和ε-聚赖氨酸处理的1.35倍，1.23倍和1.22倍。
以上结果表明武夷菌素和ε-聚赖氨酸处理后均可提高番茄植株体内防御相关酶CAT,POD、SOD、PAL的活性，SOD、POD、CAT是植物体内担负清除活性氧的保护酶系统中的关键酶，这几种酶活性的增加表明清除自由基的能力增强，降低了膜脂过氧化作用，从而维护细胞的正常代谢。PAL活性的提高有利于抗性物质木质素含量的增加，木质素大量合成并积累于细胞壁间，可增加细胞壁抗病原物的穿透压力，阻止病原菌的侵入繁殖或钝化毒素。而ε-聚赖氨酸与武夷菌素复配处理中植株体内CAT、POD、SOD、PAL的活性始终高于其他处理，且酶反应变化幅度更显著，酶活性增幅更大，从而使番茄植株在受到灰霉病菌的侵染时表现出更强的防御能力。
3.6武夷菌素与ε-PL协同增效验证试验
1)配制灰霉孢子悬浮液
在培养7d的灰霉菌平板内注入无菌的10mL 0.02％吐温80，用无菌三角玻璃棒轻轻刮涂，用双层无菌纱布滤去菌丝，收集孢子悬浮液。
2)调节孢子浓度
取血球计数板一枚，加盖盖玻片，用移液器吸取少量收集的孢子悬浮液自血球计数板边缘滴入，置于40倍光学显微镜下观察。并通过血球计数法计算孢子悬浮液浓度。加入无菌水，将孢子悬浮液的浓度调整为1.0×106个.mL-1。取50mL孢子悬浮液，加入0.2mL0.1％的葡萄糖液作为营养源。
3)配制含药培养基
用PDB培养基稀释武夷菌素和ε-聚赖氨酸母液，使其在试管中依次稀释至武夷菌素0-80μg/mL，ε-聚赖氨酸0-100μg/mL，及各个浓度的混合溶液。
4)点样
药物作用孔：先加入含药培养基100μLPDA，再加入孢子悬浮液100uL；
生长对照孔：加入PDA培养基和菌液各100μL；
空白对照孔：加入PDA培养基和无菌水各100μL；
轻微振荡均匀，置于湿盒内，22℃培养72h，每个实验孔设4个重复孔；在不搅动的情况下与生长对照孔比较，视觉法判定终点，80％生长受到抑制的药物浓度即判定为MIC值。
计算公式：
FICI＝CA/MICA+CB/MICB
其中，MICA为武夷菌素单用时的最低抑菌浓度，MICB为ε-聚赖氨酸单用时的最低抑菌浓度，CA为两药联用得到同一作用结果时武夷菌素的浓度，CB为两药联用得到同一作用结果时武夷菌素的浓度。
FICI值大于1表示两药有拮抗作用，FICI值介于0.5和1之间表示两药相互作用为相加，FICI小于等于0.5则表示两药有协同作用。
试验结果：武夷菌素的最低抑菌浓度为40mg/L，ε-聚赖氨酸的最低抑菌浓度为30mg/L，两药相加的最低抑菌浓度为5mg/L和10mg/L，FICI值为0.46介于0.5和1之间，表现为相加作用。
三、田间试验
图14a中采用2000μg/mLε-聚赖氨酸+60μg/mL武夷菌素处理下的草莓植株，图14b中采用2000μg/mLε-聚赖氨酸单独处理下的草莓植株。
由图14b所示，田间试验结果可知，草莓苗喷洒高浓度的ε-聚赖氨酸时，ε-聚赖氨酸对草莓植株造成明显的伤害，主要表现在：叶片发黄，质地变软，边缘卷曲，叶片尖端逐渐枯黄，出现药害枯斑，呈灼烧样锈色斑点，绿叶数、分蘖率均显著下降，花器受损，开花率降低；
由图14a所示，ε-聚赖氨酸与武夷菌素复配后的草莓植株，叶片生长茂盛，子叶舒展，花器可正常生长，且叶片色泽鲜艳无烧苗现象。以上结果表明ε-聚赖氨酸与武夷菌素复配后，对药害有明显的修复作用。
以上对本发明的一个实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，不能被认为用于限定本发明的实施范围。凡依本发明申请范围所作的均等变化与改进等，均应仍归属于本发明的专利涵盖范围之内。

Claims (7)

1.一种武夷菌素和ε-聚赖氨酸的复配组合物，其特征在于：包括武夷菌素和ε-聚赖氨酸。
2.权利要求1所述复配组合物在制备植物杀菌剂方面的应用。
3.权利要求1所述复配组合物在抑制灰霉菌方面的应用。
4.如权利要求3中的应用，其特征在于：包括抑制灰霉菌生长。
5.如权利要求3中的应用，其特征在于：包括抑制灰霉菌孢子的萌发。
6.利用如权利要求1所述的复配组合物杀菌的方法，其特征在于：将武夷菌素和ε-聚赖氨酸混合后喷洒于植物的叶片。
7.利用如权利要求6所述的复配组合物杀菌的方法，其特征在于：所述植物为番茄或草莓。
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