CN115462380B - 含有武夷菌素的复配制剂及其在防治葡萄灰霉病中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了含有武夷菌素的复配制剂及其在防治葡萄灰霉病中的应用。本发明提供了复配制剂在如下任一中的应用：（a1）防治灰霉病；（a2）抑制灰霉病菌；所述复配制剂由武夷菌素溶液和嘧霉胺溶液按照体积配比为（7‑27）:3的比例混合而成；所述武夷菌素溶液的浓度为武夷菌素单剂对灰霉病菌的有效中浓度；所述嘧霉胺溶液的浓度为嘧霉胺单剂对灰霉病菌的有效中浓度；所述灰霉病菌为灰霉病菌B05.10；所述灰霉病为由灰霉病菌B05.10引起的灰霉病。本发明为防治葡萄灰霉病提供一种新型生物杀菌剂与化学杀菌剂的复配药剂，为葡萄灰霉病的高效、绿色的防控提供技术指导。

Description

含有武夷菌素的复配制剂及其在防治葡萄灰霉病中的应用

技术领域

本发明涉及农业病虫害防治领域，具体涉及一种含有武夷菌素的复配制剂及其在防治葡萄灰霉病中的应用。

背景技术

葡萄病害是威胁葡萄产业的重要因素之一，据调查统计，危害葡萄的病害有40余种，如葡萄霜霉病、灰霉病、白粉病等，其中灰霉病是影响葡萄生产的主要病害之一。葡萄灰霉病由灰葡萄孢引起，是生产中常见病害, 更是产后贮藏过程中的毁灭性病害，每年因灰霉病造成的葡萄产后损失高达50.0%， 一般损失在20.0%-30.0%左右。因此关于葡萄灰霉病的防治迫在眉睫。为了有效控制该病并避免大量产量损失，化学杀菌剂处理仍是目前生产中的主要防治措施。生产上常用化学杀菌剂有嘧霉胺、异菌脲等，然而，由于葡萄灰霉病菌繁殖速度快，易发生遗传变异，适合度高，且大多数化学药剂的靶标位点具有特异性，所以随着杀菌剂的重复大量使用，灰葡萄孢逐渐对各种杀菌剂产生抗药性，而且已经出现了多药抗性，使得化学杀菌剂的抑菌效果下降甚至失去防效。因此杀菌剂的使用越来越受到限制。

目前，生防菌剂也逐渐应用于病害防治过程中，武夷菌素作为一种新型的农用抗生素，可以通过抑制病原菌的菌丝生长、孢子萌发以及激发、诱导寄主植物形成防御反应，从而起到对病害良好的防治效果。研究表明，武夷菌素对草莓白粉病、葡萄灰霉病、霜霉病、白腐病等均有良好防效。因此，结合武夷菌素与化学杀菌剂各自的优点，将其进行有机的结合、合理的复配，通过探究武夷菌素与不同化学杀菌剂的协同作用，明确武夷菌素与化学杀菌剂的增效效果，才能有效的拮抗病原菌，为防治葡萄灰霉病提供一种新型生物杀菌剂与化学杀菌剂的复配药剂，为葡萄灰霉病的高效、绿色的防控提供技术指导。

发明内容

第一方面，本发明要求保护一种复配制剂在如下任一中的应用：

（a1）防治灰霉病；

（a2）抑制灰霉病菌（Botrytis cinerea）。

其中，所述复配制剂由武夷菌素溶液和嘧霉胺溶液按照体积配比为（7-27）:3的比例混合而成。所述武夷菌素溶液的浓度为武夷菌素单剂对灰霉病菌的有效中浓度（即EC₅₀）；所述嘧霉胺溶液的浓度为嘧霉胺单剂对灰霉病菌的有效中浓度（即EC₅₀）。

所述灰霉病菌为灰霉病菌B05.10；所述灰霉病为由灰霉病菌B05.10引起的灰霉病。

进一步地，所述复配制剂由所述武夷菌素溶液和所述嘧霉胺溶液按照体积配比为7:3或者9:1的比例混合而成。

在本发明的一些案例中，所述武夷菌素溶液的浓度为51.213μg/mL（即武夷菌素单剂对灰霉病菌的EC₅₀为51.213μg/mL）。所述嘧霉胺溶液的浓度为8.354μg/mL（即嘧霉胺单剂对灰霉病菌的EC₅₀为8.354μg/mL）。

在本发明的一些案例中，所述武夷菌素溶液是含有浓度为51.213μg/mL的武夷菌素的发酵液。

第二方面，本发明要求保护一种防治灰霉病的方法。

本发明要求保护的防治灰霉病的方法，可包括如下步骤：对灰霉病的宿主植株施用前文第一方面中所述的复配制剂。

其中，所述复配制剂可以直接施用于所述灰霉病的宿主植株的叶片和/或果实等部位。所述施用可为喷洒或涂抹。

所述灰霉病的宿主植株可为葡萄。

第三方面，本发明要求保护如下任一应用：

（A1）武夷菌素在减缓灰霉病菌对嘧霉胺抗性中的应用；

（A2）武夷菌素在制备用于减缓灰霉病菌对嘧霉胺抗性的产品中的应用。

在所述应用中，将武夷菌素和嘧霉胺混合配制成复配制剂；在所述复配制剂中，武夷菌素和嘧霉胺的质量体积浓度相同；

所述灰霉病菌为灰霉病菌B05.10。

在上述各方面中，所述灰霉病可为葡萄灰霉病。

实验证明，本发明提供的由武夷菌素和嘧霉胺组成的复配制剂，其中两组分表现出协同增效，对灰霉病菌（Botrytis cinerea）的抑菌率为79.81%，对葡萄离体叶片灰霉病的防治效果达到62.97%，对葡萄果实灰霉病的防治效果达到89.58%。本发明为防治葡萄灰霉病提供一种新型生物杀菌剂与化学杀菌剂的复配药剂，为葡萄灰霉病的高效、绿色的防控提供技术指导。

附图说明

图1为武夷菌素对灰霉病菌B05.10的抑制作用测定结果统计表。统计表中同列不同小写字母之间表示差异显著（P<0.05）。

图2为武夷菌素不同浓度对灰霉病菌B05.10的平板抑制效果照片。

图3为不同化学杀菌剂对灰霉病菌（B05.10）的毒力回归方程统计表。

图4为不同化学杀菌剂对灰霉病菌B05.10的毒力回归曲线。

图5为不同化学杀菌剂对灰霉病菌B05.10的平板抑制效果照片。

图6为武夷菌素与三种化学杀菌剂复配对灰霉病菌B05.10的平板拮抗效果照片。

图7为武夷菌素与三种化学杀菌剂复配对葡萄灰霉病的毒性比率（TR）统计表。

图8为武夷菌素与三种化学杀菌剂复配的增效结果统计表。

图9为武夷菌素与不同化学杀菌剂的复配作用评价统计表。

图10为复配组合对不同灰霉菌株的平板拮抗效果照片。

图11为复配组合对不同灰霉菌株的抑制作用测定结果统计表。统计表中同列不同小写字母之间表示差异显著（P<0.05）。

图12为复配组合对不同灰霉病菌的毒力测定结果统计表。

图13为复配组合（武夷菌素:嘧霉胺=7:3）对灰霉病菌（B05.10）的抑制作用测定结果统计表。统计表中同列不同小写字母之间表示差异显著（P<0.05）。

图14为复配组合对灰霉菌株B05.10的平板拮抗作用测定结果照片。

图15为复配组合对葡萄叶片灰霉病的防治效果统计表。统计表中同列不同小写字母之间表示差异显著（P<0.05）。

图16为复配组合对离体叶片灰霉病的防治效果照片。

图17为复配组合（武夷菌素:嘧霉胺=7:3）对葡萄果实灰霉病的防治效果统计表。统计表中同列不同小写字母之间表示差异显著（P<0.05）。

图18为复配组合（武夷菌素:嘧霉胺=7:3）对葡萄果实灰霉病的防治效果照片。

图19为嘧霉胺对不同灰霉菌株的抗性水平检测结果统计表。

图20为嘧霉胺对不同灰霉菌株的抗性水平检测照片。

图21为嘧霉胺对不同灰霉菌株的敏感性测定结果统计表。

图22为武夷菌素对嘧霉胺抗感菌株的抑制作用测定结果统计表。

图23为武夷菌素对嘧霉胺抗感菌株的抑制作用测定照片。

图24为抗性汰选检测结果统计表。统计表中，A为毒力回归曲线；B为致死中量；C为抗性倍数（菌株处理前/菌株处理后）。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、武夷菌素与不同化学杀菌剂的平板对峙试验（平板拮抗作用试验）

（一）供试菌株

灰霉病菌（Botrytis cinerea）B05.10，获得于中国农业科学院植物保护研究所农用抗生素实验室-80℃超低温冰箱。记载于“刘信强. 灰葡萄孢菌核形成相关基因的挖掘和功能研究[D].华中农业大学,2020.DOI:10.27158/d.cnki.ghznu.2020.000806.”一文中的“灰葡萄孢菌株 B05.10”，公众可从申请人处获得，仅可用于重复本发明实验使用，不得他用。

小白链霉菌（Streptomyces albulus var. wuyiensis）CK-15，获得于中国农业科学院植物保护研究所农用抗生素实验室-80℃超低温冰箱。记载于“Lv Z, Lu Y, Li B, etal. Effects of ε-Poly-L-Lysine Combined with Wuyiencin as a Bio-Fungicideagainst Botryris cinerea[J]. Microorganisms, 2022, 10(5): 971.”一文，公众可从申请人处获得，仅可用于重复本发明实验使用，不得他用。

（二）供试药剂

武夷菌素发酵液的制备：将小白链霉菌CK-15接种于YEME培养基中28℃恒温摇床培养2天后接种于发酵培养基中，继续在28℃恒温摇床培养64h后过滤发酵液，得到上清液即为武夷菌素发酵液。其中，YEME培养基配方：葡萄糖 10g，麦芽提取物 3g，酵母粉 3g，胰蛋白胨 5g，蔗糖 340g，加蒸馏水至1000mL。121℃高温灭菌30min。发酵液培养基配方：豆饼粉 2g，(NH₄)₂SO₄ 0.4g，葡萄糖 2g，玉米粉 3g，CaCO₃ 0.3g，加蒸馏水至1000mL。121℃高温灭菌30min。

武夷菌素定量配制：将发酵得到的武夷菌素发酵液过0.22μm的微孔过滤器，获得无菌发酵液，采用高效液相色谱法（HPLC）检测发酵液中武夷菌素含量。HPLC分析条件如下：仪器型号：LC-1260；分析柱：填料直径为5μm耐酸（1<pH<12）和耐纯水的ZORBAX SB-AQ（4.6mm×250mm, 5μm）色谱柱，流动相：1.4g/L的TCA水溶液，流速：1.2mL/min，进样量：5μL，进样时间：25min，柱温：25℃，紫外：254nm。HPLC色谱图的峰面积即代表武夷菌素的含量。经检测，发酵液中武夷菌素含量为800μg/mL。

化学杀菌剂：40%（即400g/L）嘧霉胺、43%（即430g/L）氟菌·肟菌酯、10%（即100g/L）多抗霉素、50%（即500g/L）异菌脲均购于电商平台淘宝。

（三）武夷菌素对灰霉病菌B05.10的抑制作用测定

采用菌丝生长速率法测定武夷菌素对病原菌的离体活性。准备培养5d的灰霉病菌，利用直径为6mm的无菌打孔器，在菌落边缘打取一定数量的菌饼，备用。将步骤（二）制备好的武夷菌素发酵液置于超净工作台中用0.22μm细菌过滤器（Millex-GP）过滤后备用。利用质量守恒定律，将武夷菌素发酵液（浓度：800μg/mL）与灭菌后的100mL PDA混合成最终浓度为20、40、60、80、100、120μg/mL的含药培养基，以不加入武夷菌素发酵液的PDA培养基作为对照处理，加盖标记。每个处理重复3次。摇匀后倒入无菌培养基中，待培养基凝固后，利用无菌接种针将灰霉病菌的菌饼接种于培养基中央位置，正面朝下。待菌落直径生长至培养基直径的2/3至3/4时，用直尺测量各菌落直径，采用十字交叉法垂直测量，取其平均值。防治效果=（对照菌落直径-处理菌落直径）/对照菌落直径。

试验结果：根据图1和图2所示，武夷菌素对葡萄灰霉病菌有明显的抑制生长的作用，且随着武夷菌素浓度的提高，其防治效果也不断提高，当浓度达到120μg/mL时，其抑制作用达到94.31%。

（四）不同化学杀菌剂对灰霉病菌的抑制作用测定

采用菌丝生长速率法，在PDA平板上培养（26℃，黑暗）3d的菌落边缘打出直径为6mm的菌饼，利用不同化学杀菌剂，将其配制浓度为20、40、60、80、100、120μg/mL的含药培养基，同时以不加武夷菌素发酵液的培养基作为空白对照，将菌饼背面向下接种于培养基表面，并置于25℃暗培养3d，测定菌落径向线性生长量，确定药剂对菌丝生长的抑制率。每个处理重复4次，试验重复2次。通过菌丝生长抑制概率值和药剂浓度对数值之间的线性回归分析，求出各药剂对菌株的有效抑制中浓度（EC₅₀）。抑制生长率=[(对照菌落直径－处理菌落直径)/(对照菌落直径－菌饼直径)]×100%。通过抑制作用测定，利用数据分析软件SPSS进行数据分析，最终得到拟合的毒力回归曲线，求出毒力回归方程。

结果如图3、图4和图5所示。可见，五种药剂对葡萄灰霉病菌的毒力分别为氟菌·肟菌酯>异菌脲>嘧霉胺>武夷菌素>多抗霉素，存在一定差异。氟菌·肟菌酯对葡萄灰霉病菌的抑制活性最高，EC₅₀为1.207mg/L。多抗霉素对葡萄灰霉病的抑制活性最低，EC₅₀为290.059mg/L。相比于其他两种生物农药，化学杀菌剂的毒力更高，同时武夷菌素的EC₅₀为51.213μg/mL较另一种生物农药多抗霉素低，对葡萄灰霉病菌也有较好抑制作用，因此进行武夷菌素与三种化学杀菌剂（异菌脲、嘧霉胺、氟菌·肟菌酯）的复配。

实施例2、武夷菌素与不同化学杀菌剂的复配组合测定

（一）供试菌株

灰霉病菌（Botrytis cinerea）B05.10，获得于中国农业科学院植物保护研究所农用抗生素实验室-80℃超低温冰箱。记载于“刘信强. 灰葡萄孢菌核形成相关基因的挖掘和功能研究[D].华中农业大学,2020.DOI:10.27158/d.cnki.ghznu.2020.000806.”一文中的“灰葡萄孢菌株 B05.10”，公众可从申请人处获得，仅可用于重复本发明实验使用，不得他用。

小白链霉菌（Streptomyces albulus var. wuyiensis）CK-15，获得于中国农业科学院植物保护研究所农用抗生素实验室-80℃超低温冰箱。记载于Lv Z, Lu Y, Li B, etal. Effects of ε-Poly-L-Lysine Combined with Wuyiencin as a Bio-Fungicideagainst Botryris cinerea[J]. Microorganisms, 2022, 10(5): 971.”一文，公众可从申请人处获得，仅可用于重复本发明实验使用，不得他用。

（二）供试药剂

武夷菌素发酵液的制备：将小白链霉菌CK-15接种于YEME培养基中28℃恒温摇床培养2天后接种于发酵培养基中，继续在28℃恒温摇床培养64h后过滤发酵液，得到上清液即为武夷菌素发酵液。其中，YEME培养基配方：葡萄糖 10g，麦芽提取物 3g，酵母粉 3g，胰蛋白胨 5g，蔗糖 340g，加蒸馏水至1000mL。121℃高温灭菌30min。发酵液培养基配方：豆饼粉 2g，(NH₄)₂SO₄ 0.4g，葡萄糖 2g，玉米粉 3g，CaCO₃ 0.3g，加蒸馏水至1000mL。121℃高温灭菌30min。

武夷菌素定量配制：将发酵得到的武夷菌素发酵液过0.22μm的微孔过滤器，获得无菌发酵液，采用高效液相色谱法（HPLC）检测发酵液中武夷菌素含量。HPLC分析条件如下：仪器型号：LC-1260；分析柱：填料直径为5μm耐酸（1<pH<12）和耐纯水的ZORBAX SB-AQ（4.6mm×250mm, 5μm）色谱柱，流动相：1.4g/L的TCA水溶液，流速：1.2mL/min，进样量：5μL，进样时间：25min，柱温：25℃，紫外：254nm。HPLC色谱图的峰面积即代表武夷菌素的含量。发酵液中武夷菌素含量为800μg/mL。

化学杀菌剂：40%（即400g/L）嘧霉胺、43%（即430g/L）氟菌·肟菌酯、10%（即100g/L）多抗霉素、50%（即500g/L）异菌脲均购于电商平台淘宝。

（三）武夷菌素与不同化学杀菌剂的毒性比测定

采用Horsfall法来设计和计算药剂混配后的联合作用。根据单剂毒力测定结果，并通过筛选将效果较好的各种化学药剂，以有效中浓度EC₅₀为基础，配制各种化学杀菌剂与武夷菌素的有效中浓度PDA培养基。再按体积比V:V=0:10、1:9、2:8、3:7、4:6、5:5、6:4、7:3、8:2、9:1、10:0不同配比进行复配。采用菌丝生长速率法，将以上不同配比的复配剂分别配成含药PDA培养基平板，将葡萄灰霉病菌的菌饼接入含药平板，以加入等量无菌水为空白对照（CK），每个处理5次重复，置于22℃恒温培养箱中培养。待对照菌落长满培养皿1/2至2/3时，采用十字交叉法测量各配方平板的菌落直径，计算实际抑制率、预期抑制率。

试验结果统计：

若毒性比率（TR）>1，为增效作用；毒性比率0≤TR＜0.8，为拮抗作用；毒性比率为0.8≤TR≤1则为相加作用。

实际抑制率测定=（对照菌落直径-处理菌落直径）/对照菌落直径；

预期抑制率(%)=(单剂A的EC₅₀值剂量实际抑制率×体积百分率)+(单剂B的EC₅₀剂量实际抑制率×体积百分率)；

毒性比率（TR）=实际抑制率(%)/预期抑制率(%)。

试验结果：从图6、图7及图8中可以看出三种化学杀菌剂（异菌脲、嘧霉胺、氟菌·肟菌酯）与武夷菌素复配后大多数的配比组合的毒性比率均在1左右，具有相加或增效作用；少部分明显小于1，具有拮抗作用。当供试菌株为葡萄灰霉病菌时，结果表明：（1）武夷菌素与异菌脲：配比组合2:8，表现为增效作用；配比组合1:9，表现为拮抗作用；其他配比组合均表现为相加作用；（2）武夷菌素与嘧霉胺：配比组合1:9，表现为拮抗作用；配比组合2:8为相加作用；其他配比组合均表现为增效作用。（3）武夷菌素与氟菌·肟菌酯：配比组合1:9和2:8表现为相加作用；其他配比组合均表现为增效作用。因此，为了进一步明确三种化学药剂与武夷菌素混配后的增效效果，下一步进行共毒系数的测定。

（四）武夷菌素与不同化学杀菌剂的增效作用评价

根据毒性比的测定试验结果，选择毒性比率大、增效明显的配比组合（武夷菌素:异菌脲9:1；武夷菌素:嘧霉胺9:1、7:3、6:4；武夷菌素:氟菌·肟菌酯9:1、8:2、6:4；）进行单剂和混剂EC₅₀值测定，测量方法同上，计算相对防效、毒力回归方程和 EC₅₀。所得结果根据孙云沛的共毒系数（co-toxicity coefficient, CTC）法来明确增效程度，即CTC<80为拮抗作用，80≤CTC≤120为相加作用，CTC＞120为增效作用，CTC＞200时为显著增效作用。共毒系数最高者，增效作用最强。共毒系数按下列公式计算，毒力指数公式中将武夷菌素作为标准杀菌剂进行计算：

毒力指数（TI）=（标准杀菌剂EC₅₀/单剂EC₅₀）×100；

混剂实测毒力指数（ATI）=（标准杀菌剂EC₅₀/混剂EC₅₀）×100；

混剂理论毒力指数（TTI）=A剂的毒力指数×A剂在混剂中的体积百分含量（%）+B剂的毒力指数×B剂在混剂中的体积百分含量（%）；

混剂的共毒系数（CTC）=（混剂实测毒力指数/混剂理论毒力指数）×100。

试验结果：

CTC法验证不同增效配比组合的增效程度，对于葡萄灰霉病菌的试验结果如图9所示：（1）武夷菌素和异菌脲配比为9:1时，表现为拮抗作用。（2）武夷菌素和嘧霉胺配比组合9:1和7:3有显著的增效作用，且增效程度相当，其共毒系数差异不大，分别为391.7和391.4，其中配比组合7:3时的EC₅₀最小，为5.153μg/mL。（3）武夷菌素和氟菌·肟菌酯配比组合8:2，表现为相加作用。

结合毒性比测定与共毒系数评价可以得出，武夷菌素与三种药剂（异菌脲、嘧霉胺、氟菌·肟菌酯）进行混配时，武夷菌素与嘧霉胺的复配组合增效显著。武夷菌素与氟菌·肟菌酯复配具有良好的增效效果，EC₅₀值为4.845μg/mL，但武夷菌素与氟菌·肟菌酯的EC₅₀相差较悬殊（武夷菌素EC₅₀值为51.213μg/mL、氟菌·肟菌酯EC₅₀值为1.207μg/mL）。最为显著的配比组合为武夷菌素与嘧霉胺配比9:1与7:3，其中配比组合9:1的共毒系数最高，但由于武夷菌素与嘧霉胺的EC₅₀值差异较悬殊（武夷菌素EC₅₀值为51.213μg/mL、嘧霉胺EC₅₀值为8.354μg/mL），同时考虑两种配比组合的EC₅₀值（配比组合7:3的EC₅₀小于配比组合9:1的EC₅₀），最终选取武夷菌素与嘧霉胺配比组合7:3为最优增效组合，进行后续效果评价。

实施例3、复配组合（武夷菌素:嘧霉胺=7:3）对不同灰霉病菌的抑制作用测定

（一）武夷菌素定量配制

将实施例1步骤（二）发酵得到的武夷菌素发酵液过0.22μm的微孔过滤器，获得无菌发酵液，采用高效液相色谱法（HPLC）检测发酵液中武夷菌素含量。HPLC分析条件如下：仪器型号：LC-1260；分析柱：填料直径为5μm耐酸（1<pH<12）和耐纯水的ZORBAX SB-AQ（4.6mm×250mm, 5μm）色谱柱，流动相：1.4g/L的TCA水溶液，流速：1.2mL/min，进样量：5μL，进样时间：25min，柱温：25℃，紫外：254nm。HPLC色谱图的峰面积即代表武夷菌素的含量。经检测，发酵液中武夷菌素含量为800μg/mL。

（二）供试菌株

灰霉菌株57、59、61、65来自浙江大学实验室；灰霉菌株503、514来自中国农业科学院植物保护研究所葡萄有害生物防治研究组。

（三）复配组合（武夷菌素:嘧霉胺=7:3）对不同灰霉病菌的抑制作用测定

采用菌丝生长速率法，在PDA平板上26℃黑暗培养3d的菌落边缘打出直径为6mm的菌饼，分别移到含药的培养基平板上，置于26℃暗培养3d，测定菌落径向线性生长量，确定药剂对菌丝生长的抑制率。复配药剂的浓度设置为3.84、7.07、19.18、38.36、76.71μg/mL（浓度为武夷菌素和嘧霉胺的总量在体系中的浓度），制备成含药培养基，并以不加入药剂的PDA培养基作为对照处理，每个处理重复4次，试验重复2次。并进行毒力回归曲线的线性回归分析，抑制作用=（对照菌落直径-处理菌落直径）/对照菌落直径。

试验表明：通过图10、图11及图12，发现经复配组合（武夷菌素:嘧霉胺=7:3）处理后，除菌株57外，复配组合（武夷菌素:嘧霉胺=7:3）对其他灰霉菌株均表现出良好的抑制作用，其抑制效果表现为菌株503>菌株65>菌株514>菌株61>菌株59>菌株57。同时通过本试验也证实复配组合（武夷菌素:嘧霉胺=7:3）的适用性较高，可以有效防治不同灰霉菌株所引起的灰霉病。

实施例4、复配组合（武夷菌素:嘧霉胺=7:3）对葡萄灰霉病的防治效果测定

（一）复配组合（武夷菌素:嘧霉胺=7:3）对灰霉病菌的平板抑制作用测定

采用菌丝生长速率法，在PDA平板上26℃黑暗培养3d的灰霉病菌B05.10的菌落边缘打出直径为6mm的菌饼，分别移到含药的培养基平板上，置于26℃暗培养3d，测定菌落径向线性生长量，确定药剂对菌丝生长的抑制率。药剂处理分为武夷菌素51.213μg/mL（后面以武夷菌素EC₅₀代指）、嘧霉胺8.354μg/mL（后面以嘧霉胺EC₅₀代指）以及复配组合（武夷菌素:嘧霉胺=7:3），以不加入药剂的PDA培养基作为空白对照，每个处理重复5次，试验重复3次。并进行毒力线性回归分析，测定复配剂对不同灰霉菌株的抑制作用。抑制作用=（对照菌落直径-处理菌落直径）/处理菌落直径。

试验结果：由图13和图14可得，不同药剂对灰霉病菌B05.10的抑制效果表现为复配组合>武夷菌素EC₅₀>嘧霉胺EC₅₀。经过药剂处理后，灰霉病菌B05.10菌丝生长受到抑制。施用复配组合（武夷菌素:嘧霉胺=7:3）后，其菌丝生长受到明显抑制，菌丝生长较慢，几乎不再扩展。

（二）复配组合（武夷菌素:嘧霉胺=7:3）对葡萄离体叶片防治效果测定

利用菌饼法：利用PDA培养基培养灰霉病菌B05.10，22℃下培养3至5d。之后在超净工作台中，利用6mm的无菌打孔器在菌丝边缘打取菌饼，待用。将采集到的葡萄叶片（健康、大小一致）用无菌水清洗干净，背面向上，铺在报纸上进行晾干，准备脱脂棉，进行高温消毒，浸满无菌水，铺在培养皿中，之后将背部晾干的叶片铺在脱脂棉上，将葡萄叶片的叶柄也用浸水的脱脂棉包住，以防失水。配制武夷菌素EC₅₀、嘧霉胺EC₅₀以及复配组合（武夷菌素:嘧霉胺=7:3）三种药剂进行喷洒，并以喷施无菌水的处理作为对照处理，待表面晾干后进行保存。25℃保存一天后，将培养好的灰霉病菌B05.10进行接种。在培养过程中，根据叶片及病菌生长情况，适当喷水。统计其差异显著性及计算其防治效果。防治效果=（对照病斑直径-处理病斑直径）/对照病斑直径。

试验结果：由图15及图16可得，不同药剂施用均对离体叶片灰霉病有较好的防病效果，未施用药剂处理的叶片发褐，表面凹陷腐烂。而施用药剂处理后的叶片，仅在接种伤口附近有轻微的褐色病斑。且其中复配组合（武夷菌素:嘧霉胺=7:3）对离体叶片上的葡萄灰霉病有更加明显的防治效果，仅在叶片的接种部位有轻微病斑，甚至不出现病斑。进一步证实复配组合（武夷菌素:嘧霉胺=7:3）可以对葡萄离体叶片灰霉病也有较好防治效果。

（三）复配组合（武夷菌素:嘧霉胺=7:3）对葡萄离体果实防治效果测定

测定复配组合对葡萄果实灰霉病的防病效果。葡萄果实选择“乒乓球”品种进行试验。挑选大小一致、外形良好且无任何伤口和病斑的葡萄果实，经2%次氯酸钠浸泡2min后，无菌水漂洗3次；分别配制质量浓度为武夷菌素EC₅₀、嘧霉胺EC₅₀以及复配组合（武夷菌素:嘧霉胺=7:3）三种药液，将药液分别均匀涂抹于葡萄果实表面，以无菌水处理作为空白对照。待药液挥发干后，将葡萄果实置于25℃培养箱中保湿培养（Relative humidity，RH=95%）24h后，用无菌注射器针头在葡萄果实底部均匀扎三个伤口，伤口深度3mm左右，并在伤口处接入灰霉病菌B05.10。之后继续将其放入培养箱培养7d后查看葡萄发病情况。葡萄灰霉病发病级数分级标准：0级，果实无病态；1级，果实初见白色菌丝；3级，果实可见浅灰色菌丝；5级，果实有深灰色菌丝，松软、有发酵气味；7级，果实有褐色菌丝，发酵气味明显；9级，果实有深褐色菌丝、腐烂下陷。

病情指数=Σ（各级发病果实数×对应级数）/最高发病级数×调查总数×100；

防治效果（%）=对照组病情指数-处理组病情指数/对照组病情指数×100。

试验结果：由图17及图18可得，对葡萄离体果实的防治效果为嘧霉胺EC₅₀>复配组合（武夷菌素:嘧霉胺=7:3）>武夷菌素EC₅₀。施用不同药剂后可以显著降低葡萄果实灰霉病的发病程度，未经药剂处理过的葡萄果实长出深褐色菌丝，且果实表面出现明显的软腐及下陷并有明显的发酵气味。其中复配组合（武夷菌素:嘧霉胺=7:3）的处理防治效果几近达到嘧霉胺处理的防治效果，其表面仅在接种部位出现褐色病斑，果实完整、无发酵气味。进一步证实复配组合（武夷菌素:嘧霉胺=7:3）可以对葡萄离体果实灰霉病也有较好防治效果。

实施例5、武夷菌素有效减缓灰霉菌株对嘧霉胺的抗性

一、不同灰霉菌株对嘧霉胺的抗性水平划分

（1）抗性菌株筛选

灰霉菌株57、59、61、65来自浙江大学实验室；灰霉菌株503、514来自中国农业科学院植物保护研究所葡萄有害生物防治研究组。

（2）不同灰霉菌株对嘧霉胺的敏感性测定

采用菌丝生长速率法，在PDA平板上22℃黑暗培养3d的菌落边缘打出直径为7mm的菌饼，分别移到含药的培养基平板上，区别剂量设置为5、25、50、100、125mg/L，以不加入嘧霉胺药剂的培养基作为对照，置于22℃暗培养3d，测定菌落径向线性生长量，确定药剂对菌丝生长的抑制率。每个处理重复5次，试验重复3次。通过菌丝生长抑制概率值和药剂浓度对数值之间的线性回归分析，测定不同灰霉菌株对嘧霉胺的敏感性。

抑制生长率=［(对照菌落直径-处理菌落直径)/(对照菌落直径-菌饼直径)］×100%。

（3）不同灰霉菌株抗药性水平的划分

以嘧霉胺敏感线0.091mg/L进行判断：抗性系数（RR）=菌株EC₅₀÷敏感性基线。敏感菌株：抗性系数（RR）≤10；低抗菌株：10<抗性系数（RR）≤50；中抗菌株：50<抗性系数（RR）≤100；高抗菌株：抗性系数（RR）>100。

试验结果：通过敏感性测定（图19和图20），发现以下六个灰霉菌株中：菌株503表现为敏感菌株，而菌株57、59、61、65、514为抗性菌株，均表现出对嘧霉胺有高抗水平。嘧霉胺对不同灰霉菌株的敏感性测定结果如图21所示。

二、武夷菌素对嘧霉胺抗感灰霉菌株的抑制作用测定

用菌丝生长速率法，在PDA平板上26℃黑暗培养3d的菌落边缘打出直径为6mm 的菌饼，分别移到含药的培养基平板上，在平板内加入武夷菌素，浓度设置为20、40、51、60、80μg/mL对葡萄灰霉病菌的抑制效果，并以不加入武夷菌素的PDA培养基作为空白对照。之后将其置于26℃暗培养3d，测定菌落径向线性生长量，确定药剂对菌丝生长的抑制率。每个处理重复4次，试验重复2次。抑制生长率=[(对照菌落直径－处理菌落直径)/(对照菌落直径－菌饼直径)]×100%。

试验结果：通过抑制作用测定，发现武夷菌素对嘧霉胺抗感菌株均有良好的抑制作用（图22和图23），且通过实施例3可以看出武夷菌素与嘧霉胺的复配组合对嘧霉胺抗感菌株的防治效果较好，由此可以得出武夷菌素可以作为一种嘧霉胺的替代药剂防治以针对嘧霉胺形成抗性的菌株所引发的灰霉病。同时考虑武夷菌素可能可以延缓嘧霉胺抗性的产生。

三、武夷菌素延缓菌株对嘧霉胺产生抗性

利用嘧霉胺及武夷菌素对灰霉菌株B05.10进行抗性汰选，测定武夷菌素是否可以减缓菌株对嘧霉胺抗性的产生。试验以灰霉菌株B05.10作为靶标菌（灰霉菌标准菌株），试验处理共分为两个处理：嘧霉胺、嘧霉胺+武夷菌素（该组中嘧霉胺和武夷菌素两者等浓度）。将药剂加入至PDA培养基中制成含药培养基，两个处理组中嘧霉胺的浓度梯度均设置为8、10、16、20和24μg/mL五个梯度，之后选取不同代数1、8、10代的菌株，进行抑制作用测定，利用SPSS分析软件进行毒力回归方程的拟合，形成毒力回归曲线，求出EC₅₀值，进行抗性倍数的计算。

试验结果：目前利用抗性汰选试验，进行抗性延缓作用的测定，根据第十代检测结果可得，经嘧霉胺、武夷菌素加嘧霉胺两种药剂进行抗性汰选试验，通过毒力回归曲线的测定，计算其抗性倍数，可以看出嘧霉胺处理的菌株抗性倍数要高于武夷菌素加嘧霉胺的处理，单独施用嘧霉胺药剂的菌株抗性倍数已经达到9.18倍，而嘧霉胺与武夷菌素混合的药剂抗性倍数只有1.27倍，较嘧霉胺单独药剂降低7.23倍，由此可以看出武夷菌素较嘧霉胺单独施用，其抗性减缓近8倍，且武夷菌素的确可以有效减缓嘧霉胺抗性的产生。抗性汰选检测结果统计表见图24。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

Claims (7)

1.复配制剂在如下任一中的应用：

（a1）防治灰霉病；

（a2）抑制灰霉病菌；

所述复配制剂由武夷菌素溶液和嘧霉胺溶液按照体积配比为（7-27）:3的比例混合而成；

所述武夷菌素溶液的浓度为武夷菌素单剂对灰霉病菌的有效中浓度；所述嘧霉胺溶液的浓度为嘧霉胺单剂对灰霉病菌的有效中浓度；

所述灰霉病菌为灰霉病菌B05.10；所述灰霉病为由灰霉病菌B05.10引起的灰霉病。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述复配制剂由所述武夷菌素溶液和所述嘧霉胺溶液按照体积配比为7:3或者9:1的比例混合而成。

3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述武夷菌素溶液的浓度为51.213μg/mL；

所述嘧霉胺溶液的浓度为8.354μg/mL。

4.一种防治灰霉病的方法，包括如下步骤：对灰霉病菌的宿主植株施用复配制剂；

所述复配制剂由武夷菌素溶液和嘧霉胺溶液按照体积配比为（7-27）:3的比例混合而成；

所述武夷菌素溶液的浓度为武夷菌素单剂对灰霉病菌的有效中浓度；所述嘧霉胺溶液的浓度为嘧霉胺单剂对灰霉病菌的有效中浓度；

所述灰霉病菌为灰霉病菌B05.10；所述灰霉病为由灰霉病菌B05.10引起的灰霉病；

所述灰霉病为葡萄灰霉病。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述复配制剂由所述武夷菌素溶液和所述嘧霉胺溶液按照体积配比为7:3或者9:1的比例混合而成。

6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述武夷菌素溶液的浓度为51.213μg/mL；

所述嘧霉胺溶液的浓度为8.354μg/mL。

7.如下任一应用：

（A1）武夷菌素在减缓灰霉病菌对嘧霉胺抗性中的应用；

（A2）武夷菌素在制备用于减缓灰霉病菌对嘧霉胺抗性的产品中的应用；

在所述应用中，将武夷菌素和嘧霉胺混合配制成复配制剂；在所述复配制剂中，武夷菌素和嘧霉胺的质量体积浓度相同；

所述灰霉病菌为灰霉病菌B05.10。

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