CN103598185B - 镰刀菌酸在抑制稻曲病菌上的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了镰刀菌酸在抑制稻曲病菌上的应用。通过菌丝生长速率法和孢子萌发菌落抑制法发现镰刀菌酸能有效的抑制稻曲病菌的菌丝生长和孢子萌发。通过田间试验结果发现镰刀菌酸对稻曲病有较好的防治效果。其中有效成分使用剂量为200mg/L、300mg/L和400mg/L对稻曲病的平均防效分别可达48.40%、54.92%和63.08%。本发明首次研究发现利用镰刀菌酸对水稻稻曲病菌有很强的抑制作用及较好的防治效果，为其进一步研发创制农用杀菌剂并应用于稻曲病防治提供科学思路。

Description

镰刀菌酸在抑制稻曲病菌上的应用

技术领域

本发明涉及植物病害防治领域，特别涉及镰刀菌酸在抑制稻曲病菌上的应用。

背景技术

稻曲病是由稻绿核菌(Ustilaginoidea virens (Cooke) Tak)引起的水稻穗部真菌性病害。又因该病在水稻生长发育良好的年份发生较重，而被称为“丰年谷”。该病害在世界水稻产区都有发生，在20世纪80年代之前，该病零星发生，属于次要病害。至2000年以后随着密穗型杂交水稻品种的推广、施肥水平的提高及气候条件的变化，稻曲病已由原先的次要病害上升为稻区的主要病害。该病害主要发生在水稻的抽穗期，病原菌产生的稻曲球不仅造成水稻结实率、千粒重明显下降，产量显著降低。一般发病田块减产8％左右，严重田块减产15％以上。更重要的是对稻米品质和安全造成重大污染的影响。稻曲病菌产生的稻曲球其内含毒素（Ustiloxins），能强烈抑制微管蛋白的组合，干扰细胞骨架的形成，稻曲球喂养鸡、兔，可引起鸡、兔某些内脏病变。在生产上农民常误将稻曲球与健康的稻谷同时收获，因此稻曲球内的毒素可通过稻米、饲料等农产品，直接进入食物链，引起人畜中毒，严重危害人类的健康。

目前，对水稻稻曲病的药剂防治主要为化学杀菌剂。在生产中使用的药剂种类很多，如12.5％氟环唑SC、30％咪锰·丙森锌WP、30％苯醚甲环唑·丙环唑EC、50％戊唑醇WP等，这些药剂在一定程度上减轻了病害的病情，但由于化学农药潜在的对人类健康的危害、对环境的污染、对非靶标生物的影响及植物病原菌抗性的产生等问题，使得化学农药的发展受到各方面的限制。寻找广谱、高效、低毒的农药已成为科研人员及农药使用人员的共识。微生物农药具有不危害人畜、不杀伤天敌，安全环保、持效期长、有利于生态平衡和稳定等特性，其发展趋势与人类生态环境、食品安全和生物多样性具有良好的相融性，虽然有一些局限性，但随着人们对可持续农业的认识深入，对食品安全和绿色农业要求的提高，大力发展和推广微生物农药是实现无公害和绿色农产品生产的根本保障，符合社会倡导的可持续发展原则。我国微生物资源丰富，发展微生物农药具有充分的优势，加上现代微生物工业化生产技术体系日趋完善，微生物农药的研究开发已引起了广泛的关注和重视。

微生物农药包括微生物杀虫剂、微生物杀菌剂、微生物除草剂、植物生长调节剂和微生态剂。其中，微生物杀菌剂主要包括农用抗生素和活体微生物农药，而农用抗生素在生产中应用的较为广泛，是目前生物防治的主要手段之一。

农用抗生素是由微生物发酵过程中所产生的次生代谢产物，在低浓度时可抑制或杀灭作物的病、虫、草害及调节作物生长发育。在农用抗生素研制方面，国外以日本发展最快，居世界领先地位，在植物病害防治领域先后开发了灭瘟素、春日霉素、多氧霉素、有效霉素等，灭瘟素是第一个用于防治水稻稻瘟病的微生物杀菌剂，它是由土壤放线菌有色产色链霉菌产生的抗菌素，具有防治作用和触杀性，能有效抑制稻瘟病害，然而由于灭瘟素对植物的毒性以及对哺乳动物的副作用，这种杀菌剂被其他产品所取代。春日霉素是土壤放线菌春日链霉菌产生的抗菌素。用于防治水稻稻瘟病，甜菜、芹菜叶斑病、水稻和蔬菜细菌性病害以及苹果和梨的黑斑病，它是具有预防和治疗双重作用的内吸性杀菌剂。且对哺乳动物的毒性较低，环境相容性好，无药害，对非靶标机体和环境无不利影响。多氧霉素是土壤放线菌可可链霉菌阿索变种产生的抗菌素，包含A-N 14种不同的同系物，不同同系物作用于特异的对象。有效霉素是土壤放线菌吸水链霉菌李蒙变种产生的抗菌素，能强烈抑制菌体细胞内海藻糖酶的活性，因此可导致某些种类菌体细胞的生长和发育受到抑制。在7个结构类似的有效霉素A-G中，有效霉素A是活性最强的一个组分。已经证明有效霉素A是立枯丝核菌海藻糖酶的强有力抑制剂，因此在生产上主要用于防治水稻纹枯病。我国农用抗生素的研究起步较晚，目前已研制成功并在生产上推广应用的农用抗生素主要有：井冈霉素、公主岭霉素、多效霉素、庆丰霉素、农抗120、武夷菌素等10多个品种。目前，有许多种类的农用抗生素已应用于水稻、蔬菜、水果等病害防治中。井冈霉素是70年代开发的一种农用抗生素，与日本的有效霉素类似。主要作用机制是通过抑制病菌的海藻糖酶．阻止海藻糖转化成二分子的葡萄糖而抑制病菌菌丝伸长，其主要有效成分为井冈霉素A。在我国，井冈霉素被大量用于水稻纹枯病、稻曲病、小麦纹枯病等真菌病害的防治，特别是在防治水稻纹枯病上，每年使用面积近1000万公顷。然而，近年来由于常年大面积单一的使用井冈霉素，目前已有报道称稻曲病菌对井冈霉素产生抗药性。2011年肖友华发现，20%井冈霉素水溶性粉剂防治病穗相对防效仅为40%(水稻稻曲病药剂防治试验,遵义科技,2011,2:7-9)；而张敏也报道，井冈霉素对稻曲病防治效果极差(南充市水稻稻曲病大面积发生的原因及防治对策,四川农业科技,2011,3:46-47)。因此在稻曲病的生物防治方面，急需寻找一种新型的的农用抗生素。

本实验室在前期的研究结果中发现，镰刀菌的代谢产物（生物素）对水稻稻曲病菌有很好的抑制效果。李赤等通过高效液相色谱仪发现该真菌的代谢产物（生物素）其主要成分是镰刀菌酸（香蕉枯萎病菌毒素的成分分析及其生物测定,果树学报,2010,27(6):969-974）。镰刀菌酸(Fusaric Acid，简称FA)是由镰刀菌属的一些植物病原菌产生的一种次生代谢生物素，其化学名称为5-丁基吡啶-2-羧酸。马国斌等发现，氮源种类对镰刀菌酸含量的影响比碳源种类影响大，培养基的初始pH值为4.0、振荡培养、24 h全光照条件均有利于镰刀菌酸的产生。关于镰刀菌酸的作用方式主要有两种，一是镰刀菌酸影响寄主的体内代谢，即在寄主体内通过氧化脱氢基过程形成3-n-丁基吡啶毒害细胞；二是镰刀菌酸具有螯合重金属离子作用。目前国内已有利用镰刀菌代谢产物（生物素）制成镰刀菌酸的商品，但尚未见关于利用其对水稻稻曲病菌抑制与防治作用的报道。

发明内容

本发明的目的在于提供镰刀菌酸在抑制稻曲病菌上的应用，本发明首次研究发现利用真菌生物素（镰刀菌酸）对水稻稻曲病菌有很强的抑制作用及较好的防治效果，为其进一步研发创制新型的农用杀菌剂并应用于稻曲病防治提供科学新思路。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

参考杜宜新等方法（几种杀菌剂对番茄灰霉病菌的毒力及田间防效的研究,福建农业学报,2013,28(6):575-579）和王升厚方法（金针菇棉腐病化学防治杀菌剂的筛选,安徽农业科学,2008,36(15):6374-6375）, 采用菌丝生长速率法和孢子萌发菌落抑制法测定镰刀菌酸的抑制菌丝和孢子萌发的抑制中浓度EC₅₀值。

田间实验方法是在水稻破口前7-8 d，分别于水稻的剑叶和穗苞处进行喷施，次日在水稻穗苞中部人工注射接种稻曲病菌孢子悬浮液，接种5-7d后再施药物1次。

试验结果表明，镰刀菌酸对来自不同地区的稻曲病菌菌丝生长和孢子萌发有较强的抑制作用。其中抑制菌株SH1202、NJ1206、HB10-4菌丝生长的EC₅₀值分别为7.3572 mg/L、8.2724 mg/L和7.0648 mg/L；抑制菌株NJ1206孢子萌发菌落的EC₅₀值为222.93 mg/L。

田间试验结果表明，镰刀菌酸对稻曲病有较好的防治效果，在有效成分使用剂量为200 mg/L 、300 mg/L 和400 mg/L的条件下，对稻曲病的平均防效分别可达48.40%、54.92%和63.08%。

本发明的优点在于：镰刀菌酸是一种新型农用抗生素，对水稻稻曲病菌有很强的抑制作用及较好的防治效果，且具有不危害人畜、不杀伤天敌，安全环保、持效期长、有利于生态平衡和稳定等优点，为其进一步研发创制新型的农用杀菌剂并应用于防治稻曲病提供科学新思路。

附图说明

图1为镰刀菌酸对SH1202稻曲病菌菌丝生长的抑制情况。

图2为镰刀菌酸对NJ1206稻曲病菌菌丝生长的抑制情况。

图3为镰刀菌酸对HB10-4稻曲病菌菌丝生长的抑制情况。

图4为镰刀菌酸对稻曲病菌分生孢子萌发的抑制情况。

图5为镰刀菌酸对稻曲病田间防治效果情况，其中A为浓度为200mg/L的镰刀菌酸，B为浓度为300mg/L的镰刀菌酸，C为浓度为400mg/L的镰刀菌酸，D为空白对照，E为田间试验小区分布。

具体实施方式

实施例1

一、室内离体试验

a）镰刀菌酸对不同稻曲病菌菌丝生长的抑制作用

本发明所提供的镰刀菌酸，购买自东京化成工业株式会社。

按5个不同浓度梯度（表1），用无菌水稀释镰刀菌酸，分别与马铃薯蔗糖培养基（PSA培养基，20%马铃薯煮汁，2%蔗糖，pH 6.0）混匀，制成含药培养基。

在PSA培养基上活化3个来自不同地区的稻曲病菌菌株（福建省上杭县1个、南靖县1个，河北省1个），用直径5 mm的打孔器在供试病菌菌落边缘打取菌饼，用接种针挑取菌饼置于含药培养基平板中间，28 ℃，黑暗培养25 d后，用垂直十字法测量不同浓度处理的病菌菌落直径，求出抑制生长率，分别建立以浓度的自然对数值为自变量（x），抑菌率的机率值为因变量（y）的回归方程，计算镰刀菌酸的抑制中浓度EC₅₀值。每个处理重复5次，以不加镰刀菌酸的PSA培养基作为对照。

镰刀菌酸对不同稻曲病菌菌株菌丝的毒力测定结果如表2所示，其中菌株SH1202 的EC₅₀值为7.3572 mg/L，菌株NJ1206的EC₅₀值为8.2724 mg/L，菌株HB10-4的EC₅₀值为7.0648 mg/L。说明镰刀菌酸对不同稻曲病菌菌株的菌丝生长具有显著的抑制活性。

表1 镰刀菌酸对不同稻曲病菌菌丝生长的抑制情况

^* 为5次重复的平均值。

表2 镰刀菌酸对不同稻曲病菌的室内毒力测定结果

b）镰刀菌酸对稻曲病菌分生孢子萌发的抑制作用

在PSA培养基上活化供试稻曲病菌，用直径5 mm的打孔器在病菌菌落边缘打取菌饼，用接种针挑取菌株NJ1206的菌饼3块接入PS培养基(马铃薯蔗糖液体培养基)中，28 ℃，150 r·min^-1，恒温振荡培养7 d，用双层无菌纱布滤去菌丝，收集滤液，用无菌水稀释孢子悬浮液，使在显微镜100倍视野下孢子个数为100-200个。吸取1 mL加入50-55 ℃的PSA培养基（99 mL）中，混匀，然后倒入约20 mL 的培养基于培养皿中，制成含病菌孢子的PSA平板。在每个含病菌孢子的PSA培养基平板中央放置1个无菌牛津杯（6mm×8mm×10mm），待牛津杯自然沉降10 min后，往每个牛津杯中加入200 uL不同浓度的镰刀菌酸（表3），28 ℃，黑暗培养4 d后，测量各个浓度的抑菌圈直径，以对照孢子萌发菌落至整个培养皿与各浓度孢子萌发菌落直径比较测定孢子萌发抑制率。分别建立以浓度的自然对数值为自变量（x），抑制孢子萌发率的机率值为因变量（y）的回归方程，计算镰刀菌酸的抑制病菌孢子萌发的抑制中浓度EC₅₀值。每个处理重复5次，以牛津杯加入无菌水作为对照。

通过测量孢子萌发后菌落的直径，镰刀菌酸对稻曲病菌孢子萌发的毒力测定结果如表4所示，生物素对供试的稻曲病菌NJ1206孢子萌发的EC₅₀值为222.93 mg/L。说明镰刀菌酸对稻曲病菌的孢子萌发生长具有一定的抑菌活性。

表3 镰刀菌酸对稻曲病菌分生孢子萌发的抑制情况

^*  为5次重复的平均值。

表4 镰刀菌酸对稻曲病菌分生孢子萌发的室内毒力测定结果

实施例2

二、田间防治试验

a） 水稻种植

将水稻进行常规浸种、消毒和育苗后，插种于可控温湿度大棚的水泥池中，水稻种植的株行距17-20 cm，常规栽培管理。水稻品种为两优培九。

b） 参考镰刀菌酸室内离体试验对稻曲病菌菌的EC₅₀值，设计3个不同浓度梯度。在水稻破口前7 d，分别于水稻的剑叶和穗苞处喷施3个不同浓度梯度的镰刀菌酸，直至滴水为宜，次日在水稻穗苞中部人工注射约1×10⁷的稻曲病菌孢子液，每株注射2 ml。于接种后6 d再施药1次。以清水为对照，每个处理重复3次。于水稻成熟期进行调查，每个重复随机调查50丛，记录总株数和病穗数，算出平均病穗率，求出防治效果。

在水稻成熟期通过对稻曲病病穗数的调查，镰刀菌酸对稻曲病防治试验如表5所示：镰刀菌酸400 mg/L、300 mg/L、200 mg/L（有效成份）三种剂量在二次药后对稻曲病的平均防效分别为63.08%、54.92%和48.40%。在5%显著水平和1%极显著水平上镰刀菌酸三个剂量的防效之间差异均达显著水平。说明镰刀菌酸对稻曲病具有较好的防治效果。

表5镰刀菌酸对稻曲病田间防治效果试验

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

Claims (1)

1.一种镰刀菌酸在抑制稻曲病菌上的应用。