CN115261282A - 一种解淀粉芽孢杆菌及其在黄瓜病害防控中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一株解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens，于2022年03月07日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.24481。该菌株耐旱、繁殖生长快、在土壤和植株中定殖能力强，发酵液活性物质种类丰富，通过破坏病原菌细胞壁和细胞膜稳定性、降低对宿主植物的浸染能力，达到抑菌目的。所述解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens发酵液对黄瓜多种病原菌有抑制活性，对其引发黄瓜病害防效好，且具有增强植物抗病能力。

Description

一种解淀粉芽孢杆菌及其在黄瓜病害防控中的应用

技术领域

本发明属于植物保护技术领域，具体涉及一种生防解淀粉芽孢杆菌及其在黄瓜病害防控中的应用。

背景技术

黄瓜属葫芦科植物，在全国各地被广泛种植，是人们餐桌常见菜肴之一，是市场上的畅销蔬菜产品，为了满足巨大的市场需求，黄瓜种植已经实现了周年连续生产供应，主要有露地栽培和设施栽培，由于黄瓜植株不像西红柿、辣椒等自身有特殊气味抵抗生物侵害，无论哪种栽培方式黄瓜均是最容易受到病害侵犯的蔬菜品种，加之连作障碍使得黄瓜成为蔬菜病害发生重灾区。常见的黄瓜病害主要有霜霉病、白粉病、灰霉病、枯萎病、黑星病，腐烂病、黄萎病、丝核茎基腐病等病害，主要通过土壤传播危害，苗期、成株期均可发病。这些病害的危害来势猛，病害重，传播快，如不及时防治，将给黄瓜生产造成毁灭性的损失，在流行年份受害地块黄瓜减产20%～30%，严重流行时损失达50%～60%，甚至绝收。目前的防治方法主要为嫁接栽培防治、轮作防治和化学农药防治，国内外还有利用生态防治、物理防治、生物防治等多种防治方法缓解化学农药防治带来的潜在危害，其中生物防治尤其生防微生物以其生态友好、对人畜环境安全、无残留等优点成为目前的研究热点，但实际生产中可用于黄瓜病害防控的生防菌及其制剂很少，远远不能满足防控应用需求。因此，本发明从具有杀虫抑菌活性的农药资源植物中分离高活性高抗逆生防菌种，为黄瓜病害生物防控提供基础物质和技术支撑。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一株解淀粉芽孢杆菌，该解淀粉芽孢杆菌具有耐盐碱、在黄瓜根茎叶及其根围土壤能稳定定殖且定殖能力强，通过提高病原菌脂质过氧化水平，破坏病原菌细胞膜稳定性，达到抑菌防病的目的。

上述解淀粉芽孢杆菌是2022年3月7日保藏于位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens，保藏编号为CGMCC No.24481。

所述解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens是从甘肃省玛曲县高海拔草场的毒杂草黄帚橐吾茎中分离纯化筛选的活性内生菌株BSS-142，经过形态观察、生理生化鉴定和16S rDNA分子鉴定最终确定该菌株为解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens。

所述解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens在分离纯化过程中采用的分离纯化培养基配方为：葡萄糖10 g，蛋白胨8 g，NaCl 5 g，牛肉膏5 g，MnSO₄·H₂O 0.003g，琼脂粉适量,蒸馏水定容至1000 mL，pH 7.0。该分离纯化培养基有利于解淀粉芽孢杆菌生长富集，提高了分离纯化效率。

所述解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens耐盐碱，在NaCL浓度10%～20%或Ph9～Ph13的中度以上模拟盐、碱环境下均能生长繁殖。且耐酸，Ph5的模拟环境下能较好繁殖生长，应用范围广。

所述解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens在植物根茎叶及其根围土壤能稳定定殖且定殖能力强，其定殖菌数在103cfu/ml～105cfu/ml ，其中在根围土壤和根中定制能力更强，25天内保持定殖菌数在105cfu/ml以上和104cfu/ml以上。

所述解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens的发酵液制备时的发酵培养基配方为：牛肉膏6 g、酵母膏5 g、葡萄糖13 g、蒸馏水定容至1000 mL，PH7.0。该发酵培养基促进解淀粉芽孢杆菌生长繁殖，提高了其发酵液含菌量和抑菌活性。

所述解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens的发酵液活性物质种类丰富，特有丙烯酸、大黄酸、吡啶基乙酸、奎宁酸、异考布松、异樱花苷、黄麻醇苷、异紫花前胡内酯、山柑子碱、去甲氧基姜黄素和白头翁素等有机酸、生物碱和抑菌素类发酵液活性物质使菌株BSS-142具备对病原菌高活性，同时其协同氨基酸和褪黑素，提高植物抗生物胁迫能力。

所述解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens的抑菌机理：提高病原菌脂质过氧化水平，破坏病原菌细胞膜稳定性，使细胞内容物外渗导致病原菌生长发育抑制直至死亡；较强抑制真菌病原菌孢子萌发和菌丝生长。

所述解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens活菌与发酵液活性物质共同作用，其主要抑菌谱为尖镰孢菌、胡萝卜软腐欧文氏菌软腐致病型、大丽轮枝菌、立枯丝核菌、丁香假单胞菌和黄假单胞菌这些致病单胞菌属、单囊壳孢和霜霉菌植物致病菌。

所述解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens活菌与发酵液活性物质共同作用，增强植物光合作用和碳同化作用，其叶绿素含量增长18.43%；激活植物抗逆系统，使其POD、SOD、CAT、PAL及β-1,3-葡聚糖酶等抗病防御酶活性大幅度提高，从而提高了植物抗病原浸染能力和抗逆境胁迫能力，提质增产。

本发明的第二个目的是提供上述解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens在黄瓜病害防控中的应用，解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens及其发酵液能有效防控由尖镰孢菌、胡萝卜软腐欧文氏菌软腐致病型、大丽轮枝菌、立枯丝核菌、丁香假单胞菌和黄假单胞菌这些致病单胞菌属霉植物致病菌引发的黄瓜枯萎病、腐烂病、黄萎病、丝核茎基腐病、细菌性褐斑病等病害，平均防治效果在89%～95%，与对照农药在0.05水平上不存在显著性差异。也可防治由单囊壳孢和霜霉菌引发的黄瓜白粉病和霜霉病，平均防治效果在80%～83%，比对照农药50%多菌灵可湿性粉剂的防效好很多，在0.05水平上存在显著性差异。

解淀粉芽孢杆菌BSS-142活菌与发酵液活性物质共同作用，增强植物光合作用和碳同化作用，其叶绿素含量增长18.43%；激活植物抗逆系统，使其POD、SOD、CAT、PAL及β-1,3-葡聚糖酶等抗病防御酶活性大幅度提高，从而提高了植物抗病原浸染能力和抗逆境胁迫能力，提质增产。

附图说明

图1为本发明解淀粉芽孢杆菌BSS-142菌落形态；

图2为本发明解淀粉芽孢杆菌BSS-142发酵液处理的尖孢镰刀菌菌丝形态；

图3为未用解淀粉芽孢杆菌BSS-142发酵液处理的尖孢镰刀菌菌丝形态；

图4为本发明解淀粉芽孢杆菌BSS-142发酵上清液对病原菌细胞丙二醛含量的影响；

图5为本发明解淀粉芽孢杆菌BSS-142抑菌谱；

依次为：尖镰孢菌、立枯丝核菌、大丽轮枝菌、单囊壳孢、霜霉菌、丁香假单胞菌、黄假单胞菌、萝卜软腐欧文氏菌软腐致病型；

图6为本发明解淀粉芽孢杆菌BSS-142耐盐能力；

图7为本发明解淀粉芽孢杆菌BSS-142耐酸碱能力；

图8为本发明解淀粉芽孢杆菌BSS-142在辣椒植株及其根围土壤的定殖动态；

图9为本发明解淀粉芽孢杆菌BSS-142对黄瓜防御酶系的影响之一；

图10为本发明解淀粉芽孢杆菌BSS-142对黄瓜防御酶系的影响之二；

图11为本发明解淀粉芽孢杆菌BSS-142对黄瓜抗病酶的影响。

具体实施方式

一、拮抗菌株的分离、纯化和分类鉴定

1菌株的分离、纯化

1.1 主要培养基

NA培养基、PDA培养基为现有常规配方。

分离纯化培养基配方为：葡萄糖10 g，蛋白胨8 g，NaCl 5 g，牛肉膏5 g，

MnSO₄·H₂O 0.003g，琼脂粉适量,蒸馏水定容至1000 mL，pH 7.0。

菌株分离纯化

黄帚橐吾植株采集：7月中旬于省玛曲县海拔3400m的高山草甸上采集长势健康的黄帚橐吾植株，采样时将整棵植株连根拨出放入无菌袋中冷藏保存带回实验室进行内生细菌分离。

黄帚橐吾茎部内生细菌分离纯化：取保藏完整健康的黄帚橐吾植株用流水清洗干净，再在流水下冲洗1h。转入超净工作台将植株茎剪下，用75%的酒精漂洗1 min、无菌水漂洗3次、3% NaClO浸泡1min、无菌水漂洗3次、75%的酒精漂洗15s、无菌水漂洗5次完成表面消毒。然后用无菌滤纸将茎表面水分吸干，用灭菌剪刀剪成约0.5cm小块并研磨成浆状，无菌水稀释 10 倍后取0.2ml涂布于分离纯化培养基上，倒置，28℃恒温培养 48h～72h。待培养基上长出可见菌落时，及时挑取特征相异的菌落，28℃下继续进行多次划线纯培养，直至平板上菌落形态单一为止。编号，接种于斜面试管中4℃保藏备用。并且取最后一遍冲洗黄帚橐吾茎的无菌水适量涂布于分离纯化培养基上，28℃下培养 72h 后无菌落长出，表明用于分离内生菌的黄帚橐吾茎表面消毒彻底。

高拮抗菌株筛选

采用琼脂扩散法。将致病型尖刀镰刀菌接种于PDA上活化，加适量无菌水洗脱做成1×10⁸cfu/ml病原菌菌悬液。在无菌PDA平板上加200µl病原菌菌悬液涂抹均匀，室温干燥5 min，在带菌平板中央放置牛津杯，每个牛津杯中注入1.1中分离纯化的菌株发酵液或菌株发酵上清液100μL，以无菌水为对照。每种菌株发酵液或菌株发酵上清液各做 4 个重复。每种菌株发酵液或菌株发酵上清液各做 4 个重复。28℃培养7d后观察是否有抑菌圈并测定抑菌直径，判断是否有抑菌作用及其抑菌能力强弱。病原菌换成茄青枯劳尔氏菌，接种培养基换成分离纯化培养基，其余不变。

表1：高拮抗菌株筛选结果

注释：表中列出的是拮抗活性最强的前五株1.1.2中分离纯化获得菌；表中同列小写字母不相同，表示在0.05水平上存在显著性差异（p≤0.05）。

依据表1结果选取拮抗活性最高的菌株142做进一步分类鉴定。

高拮抗活性菌株142分类鉴定

1.4.1形态学鉴定

用接种环挑取新鲜菌株142接于NA培养基中，将其放置于28℃恒温培养箱中培养48h后进行观察菌落形态，并在显微镜下观察菌体的形状、芽孢的有无。

1.4.2生理生化测定

参照《伯杰细菌鉴定手册》和《常见细菌系统鉴定手册》对接触酶反应、淀粉水解、MR试验、麦芽糖、乳糖、D-葡萄糖和硝酸盐等生理生化指标进行观测。

1.4.3 16S rDNA序列分析

细菌DNA提取采用蛋白酶-SDS法制备，扩增引物:

27F: 5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'、

1492R: 5'- TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3'，由上海美吉生物医药科技有限公司完成测序及同源性分析。

1.4.4鉴定结果

菌株142的菌落近圆形，白色，表面透明光润，稍隆起，边缘不整齐呈细齿状（见附图 1）。革兰氏染色呈阳性，短杆状、端生芽孢。接触酶反应、硝酸盐还原、VP试验、柠檬酸盐利用试验、硫化氢试验、葡萄糖发酵、淀粉水解、果糖发酵、乳糖发酵和麦芽糖发酵均为阳性，MR试验、明胶水解、丙二酸盐利用、氧化酶反应和苯丙氨酸脱氨酶反应均为阴性。菌株的16S rDNA 序列与NCBI数据比对分析和多株解淀粉芽孢杆菌归于同一簇群，同源性均在99%以上。综合形态学特征、生理生化特征和16S rDNA分子鉴定结果，菌株142为解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens），终编号BSS-142。

二、特性及效果试验：

1 解淀粉芽孢杆菌BSS-142发酵液制备方法：将菌株BSS-142的10⁸cfu/ml菌悬液以6%接种量接于发酵培养基中，28±1℃、200转∕分恒温震荡培养48h，得解淀粉芽孢杆菌BSS-142发酵液。

所述发酵培养基配方为：牛肉膏6 g、酵母膏5 g、葡萄糖13 g、蒸馏水定容至1000mL，pH7.0。

解淀粉芽孢杆菌BSS-142的抑菌机理。

菌株BSS-142发酵液对病原菌孢子萌发的影响

取50 µL的尖刀廉孢菌孢子悬液(10⁸ cfu﹒mL^-1)加于凹玻片中央，再加入50µL菌株BSS-142发酵液，以无菌水为对照，每处理重复4次，于28℃黑暗保湿培养72 h后，记录孢子萌发数（孢子形成芽管长度大于孢子1 /2记为萌发），计算孢子萌发率。

孢子萌发率(%)=萌发孢子数 / 总孢子数×100

孢子萌发抑制率(%)=(对照孢子萌发率－处理孢子萌发率)/对照孢子萌发率×100

表2：菌株BSS-142发酵液对病原菌菌丝生长的影响

注释：表中同行小写字母不相同，表示在0.05水平上存在显著性差异（p≤0.05）。

表2结果显示，菌株BSS-142发酵液对尖刀廉孢菌孢子萌发有较强的抑制作用，孢子萌发抑制率为92.50%，与同种菌株在0.05水平上存在显著性差异。

菌株BSS-142发酵液对靶标病原菌菌丝形态的影响

采用双层牛津杯法观察生防菌发酵液对尖孢镰刀菌菌丝形态的影响。将PDA加热至融化，取15mL倒入培养皿中，待其凝固后再倒入5 mL融化的PDA，并在培养皿中央位置放置牛津杯，待皿内培养基凝固后，在平板上距皿边缘1 cm的对称位置处接种尖孢镰刀菌菌饼(直径5 mm），在牛津杯中加入100 µL目标生防菌发酵液，对照组加等量无菌蒸馏水。将培养皿正放于恒温培养箱中，26℃培养3-5 d后取出培养皿，将尖孢镰刀菌与抑菌圈交界处的尖孢镰刀菌培养物切下置于载玻片上，利用光学显微镜观察菌丝形态，与对照组进行比较。

图2和图3对比分析可知，菌株BSS-142发酵液使靶标病原菌菌丝严重断裂、萎缩、扭曲、顶端生长点膨大且破损，生长严重抑制。

菌株BSS-142发酵上清液对病原菌丙二醛含量的影响

将菌株BSS-142发酵液，4℃、10000r/min离心，取上清液备用。打取5.0mm尖孢镰刀菌饼若干，接入PDA培养液，每100 mL接种10个菌饼，26±1℃,180 r.min^-1振荡培养48 h后，制成菌悬液。将菌悬液以10%接种量接入无菌PDA培养液，相同条件培养48 h后分别加入10%的体积分数的菌株BSS-142发酵上清液，并设空白对照，继续培养120 h，4层纱布过滤菌丝，用pH7.5的PBS冲洗，滤纸吸去水分，取各处理收集的菌丝3g，加入21 mL0.05 mol.L^-1 pH7.8PBS,1.0 g石英砂冰浴研磨至匀浆，4℃、8000r·min^-1离心10 min，取上清液置 -20℃以下备用。取上清液1mL加4 mL 0.5%TBA，沸水浴25 min后迅速于冰水混合物中冷却终止反应，4℃、8000r·min^-1离心10 min，取上清液在600、532和450 nm处测定吸光值计算丙二醛含量。病原菌为茄青劳尔氏菌，在NA培养液，28±1℃培养2d，4℃、10000r·min^-1离心30 min，取菌体研磨，其余同尖孢镰刀菌菌丝体操作。

MDA(µmol·kg^-1)=6.45 (A_{53 2}-A₆₀₀)-0.56 × A₄₅₀

图4的结果显示，菌株BSS-142发酵上清液能使病原菌细胞中的丙二醛含量比对照显著提高二倍多。丙二醛是细胞过氧化的产物，间接反映细胞膜的受损程度。说明菌株BSS-142发酵上清液显著病原菌（尖孢镰刀菌和茄青劳尔氏菌）细胞的脂质过氧化水平，破坏了细胞膜结构，导致菌体生长发育受限制或死亡。

综合1.1-1.3的试验结果，证明菌株BSS-142的抑菌机理为提高病原菌脂质过氧化水平，破坏病原菌细胞膜稳定性，使细胞内容物外渗导致病原菌生长发育抑制直至死亡；较强抑制真菌病原菌孢子萌发和菌丝生长。

解淀粉芽孢杆菌BSS-142发酵液主要活性物质

3.1对菌株BSS-142进行基于LC-MS的代谢组学检测分析。

采用甲醇（含同位素标记内标混合物）-超声波提取法，提取解淀粉芽孢杆菌BSS-142发酵液活性物质，送上海阿趣生物科技有限公司进行基于LC-MS和GC-TOF-MS非靶标的代谢组学检测分析。结果见表3。

表3: 解淀粉芽孢杆菌BSS-142的发酵液主要活性物质

表3结果显示，菌株BSS-142的发酵液活性物质主要有黄酮类、甾醇类、生物碱类、香豆素类、酚类、萜烯类化合物、有机酸、芳香类化合物、木脂素类和氨基酸等，其中Albendazole sulfone; (R)-3-Hydroxy-tetradecanoic acid; [6]-Gingerdiol 3,5-diacetate; 2-Methoxyestrone; Arborine; 6-Hydroxymelatonin; Acrylic acid;Benzoic acid; Isokobusone; Isosakuranin; 2-(5-Methyl-2-furanyl)pyrrolidine;Quinic acid; 2-Pyridylacetic acid; 3-Hydroxy-carbofuran; 4-Aminophenol; 6-Hydroxymelatonin; 7-Aminoflunitrazepam; L-Serine; L-Arginine; L-Glutamicacid; L-Glutamine; L-Histidine; L-Lysine; L-Norleucine; L-Phenylalanine;alpha-Zearalenol;Marmesin;Rhein; (ent-2b,4S,9a)-2,4,9-Trihydroxy-10(14)-oplopen-3-one 2-(2-methylbutanoate) 9-(3-methyl-2E-pentenoate); CorchorosolA; Curcumin II; Isodesmosine和 Protoanemonin是该菌株特有的抑菌增抗化合物，丙烯酸、苯甲酸、异考布松、异樱花苷、异紫花前胡内酯、大黄酸、吡啶基乙酸、山柑子碱、黄麻醇苷、去甲氧基姜黄素、奎宁酸和白头翁素这些发酵液活性物质使菌株BSS-142具备对病原菌高活性，同时其协同氨基酸和褪黑素，提高植物抗非生物或生物胁迫能力。

解淀粉芽孢杆菌BSS-142主要抑菌谱

通过扩散法中的抑菌圈法（病原菌为细菌、放线菌）或平板对峙法（病原菌为真菌）进行解淀粉芽孢杆菌BSS-142抑菌谱测定。

平板对峙法。将尖镰孢菌、茄病镰刀菌和燕麦镰刀菌等致病镰孢属、大丽轮枝菌、立枯丝核菌、疫霉、番茄粉孢和霜霉菌等病原真菌接种于PDA上活化并打取菌饼若干备用。在无菌PDA平板底划“十”字，病原真菌菌饼置于“十”中央，在距离PDA平板“十”中央1.0cm处打直径0.5cm 孔4个，接菌株BSS-142发酵液各50µl，无菌水为对照平板，试验重复4次，在28℃培养12d后观察是否有抑菌圈及其大小，判断是否有抑菌作用及其抑菌能力强弱。

抑菌圈法：将茄青枯劳尔氏菌、胡萝卜软腐欧文氏菌软腐致病型、丁香假单胞菌和黄假单胞菌等致病单胞菌属等病原细菌在NA培养基，28℃活化培养2-3 d，斜面中加入5 mL含0.3%吐温80的无菌水，将菌苔刮下置于装有无菌玻璃球的50 mL锥形瓶内，摇床中充分震荡2小时后，稀释至含菌量为1 ×10⁸ cfu/mL ，备用。取200 μL病原菌悬液均匀涂布于NA培养基平板中，在平板中心放入无菌钢圈（直径0.6cm），加入100 μL菌株BSS-142发酵液，无菌水为空白对照，28℃培养2d，观测抑菌圈有无及其大小，判断解淀粉芽孢杆菌BSS-142对其是否有抑菌活性及其强弱。

以上抑菌实验结果显示（图5），解淀粉芽孢杆菌BSS-142对尖镰孢菌、胡萝卜软腐欧文氏菌软腐致病型、大丽轮枝菌、立枯丝核菌、丁香假单胞菌和黄假单胞菌等致病单胞菌属、疫霉、番茄粉孢和霜霉菌等植物致病菌有较强抑制活性。

解淀粉芽孢杆菌BSS-142耐盐碱能力测定。

用接种环挑解淀粉芽孢杆菌BSS-142菌落接至分离纯化液体培养基中28℃、180r/min培养24h制成种子液，按6%分别接种到ph7.2含有1%、2.5%、5%、10%、15%、20%、25%NaCL和PH为3、5、7、9、11、13、14的含5g/L NaCL的NA液体培养基，28℃、180r/min摇床培养48h，用无菌分离纯化液体培养基调零，测各培养液在600nm处的OD值，依此判断解淀粉芽孢杆菌BSS-142的耐盐碱能力。耐盐能力标准：非耐盐菌株，NaCl 含量小于 1.17%；低耐盐菌株，Na Cl在 1.17～2.93%；中等耐盐菌株，NaCl 浓度在 2.93%～14.63%，高度耐盐菌株：14.63%～30.4%。耐碱能力标准：耐碱微生物，PH值7～9生长，PH＞9.5不能生长；嗜碱微生物，PH值7～9生长；极端嗜碱微生物，最适生长PH值≥10，PH值低于8.9～9则不生长，为专性极端嗜碱微生物；兼性嗜碱微生物，具有能在两种或两种以上不同环境下生存或繁衍后代的能力。

图7结果显示，解淀粉芽孢杆菌BSS-142在PH值5～11能正常生长，且PH值5时，解淀粉芽孢杆菌BSS-142生长繁殖较PH值11更好，PH值小于5或大于11，能生长，但较慢，PH14时死亡。证明解淀粉芽孢杆菌BSS-142耐受酸碱能力很强。图6结果显示，解淀粉芽孢杆菌BSS-142在NaCL浓度小于15%时能正常生长，15%～20%也能生长，但逐渐变慢，25%死亡。证明解淀粉芽孢杆菌BSS-142为高度耐盐菌株。

、解淀粉芽孢杆菌BSS-142在黄瓜及其根围土壤的定殖能力测定

菌株BSS-142在黄瓜根、茎、叶及其根围土壤的定殖能力测定。将解淀粉芽孢杆菌BSS-142的利福平和卡那霉素双标记菌株接种于含300 μg/ mL利福平和卡那霉素 200 μg/mL的改良NYDA培养液中, 28±1 ℃、180 r/min振荡培养72 h, 稀释浓度至10⁸ cfu/mL,以 25.0 mL/株灌根接种于试验标准的黄瓜植株, 10.0 mL/株喷施于植株表面, 以无菌培养液为对照，共处理500株。接种后1、5、10、15、20、25 d 和30 d 各取1.0 g的根、茎、叶组织及其根围土壤（取紧密附着于根系的土作为根围土）样品。将处理植株根、茎、叶样品各平均分成两份（0.5 g）, 一份表面用70 %酒精擦洗后，于0.1 %升汞中浸泡1.5 ～ 2.0 min ,再用无菌水洗涤5 次, 晾干后剪碎并加入1mL 无菌水磨碎，备用；将根围土（1.0 g）分散于10mL 无菌水中， 200 r/min振荡10min后静置，取上清液稀释成10^－1、10^－２、10^－３、10^－４。然后分别取上述各样品溶液200 μl 均匀涂布于含300 μg/ mL利福平和卡那霉素 200 μg/mL的改良NYDA培养培养基平板上,每个处理样品重复3 次, 28±1 ℃恒温培养48ｈ后计数。根据每个处理的平均菌落数量，计算每克鲜叶、根、茎及其根围土壤中所含的菌量（ cfu/g ）。

优良的生防菌株广谱、高毒力，还必须能在寄主及其根围占据有利位点而定殖，并且能在与自然界及其根际微生物区系的竞争中增殖存活较长时间，才有可能实现将其开发成生物农药的终极目标。因此，目前在生防微生物的研究中将其在作物及其根围土壤中的定殖能力作为优良生防菌株筛选的重要评价指标。图8显示，菌株BSS-142在番瓜根、茎、叶及其根围土壤的都可以稳定定殖，其中在根围土壤中定殖能力最强，从接种1天后至30天,定殖菌数均保持在10⁵cfu/ml，其次在植株根部定殖能力也较强，在接种后25天内菌数可达10⁴cfu/ml,接种15天后，在叶中的定殖菌数也能达到10⁴cfu/ml，在茎内定殖能力最弱，菌数基本在10³cfu/ml左右。

解淀粉芽孢杆菌BSS-142对黄瓜叶绿素和诱导黄瓜抗逆性能力影响

7.1解淀粉芽孢杆菌BSS-142发酵液对黄瓜叶绿素的影响

叶绿素的测定采用浸提法。挑选饱满的黄瓜种子，用75%乙醇消毒20分钟，0.5%次氯酸钠消毒1min，最后用无菌水冲洗干净，吸干水分。40℃温水浸泡 60 min 催芽后，播入装有复合基质营养钵中。出苗后开始每隔7天分别按每株20 m L解淀粉芽孢杆菌BSS-142发酵液灌根和喷雾处理，共处理4次，以无菌水为空白对照，每组处理 20 株幼苗，每处理重复4次。试验幼苗置于常温、 12 h/12h 光周期环境下培养，最后一次施药5 d 后，取黄瓜叶片，冲洗干净后用滤纸吸干表面水分，去除叶片主脉，称取 0.1 g 放入 20 mL 浸提液中。浸提液用丙酮：乙醇：蒸馏水=4.5：4.5：1 配置，混匀。室温下黑暗浸泡 8-12 h,直至叶片完全发白，用漩涡混合器混匀，把上层绿色溶液定容至 20 mL。将提取液倒入光径为 1 cm 的比色皿中，以配置好的浸提液调零，在 652 nm 处读取吸光值，根据下述公式计算出黄瓜叶绿素含量：

叶绿素含量（mg/g）＝OD₆₅₂×V / 34.5×m

OD₆₅₂是在 652 nm 处读取的吸光值; V 表示提取液总体积（mL）; m 表示叶片鲜重（g）。

表3：解淀粉芽孢杆菌BSS-142发酵液对黄瓜叶绿素含量的影响

注释: △t为增长率。

解淀粉芽孢杆菌BSS-142对黄瓜相关防御酶活性和病程相关酶活性的影响

7.2.1 供试植物处理：挑选饱满的黄瓜种子，用75%乙醇消毒20分钟，0.5%次氯酸钠消毒1min，最后用无菌水冲洗干净，吸干水分。40℃温水浸泡 60 min 催芽后，播入装有BSS-142 发酵液处理（500ml/g）的复合基质营养钵中。出苗后开始每隔5天分别按每株30 mL 灌根和喷雾处理，共处理5次，以无菌水为空白对照，每组处理 50 株幼苗，每处理重复4次。试验幼苗置于常温、 12 h/12h 光周期环境下培养，最后一次施药3 d 后开始试验。

7.2.2酶液的提取

将供试处理结束的黄瓜苗连根拔起，不同处理分组，将植株同部位叶片剪下，六分之二立即使用，六分之四用液氮冷冻处理，置于 -80℃冰箱保存备用。

取黄瓜苗相同部位的叶片0.5 g，放入预冷的研钵中，加入5 mL预冷的0.05 MpH6.8磷酸缓冲液(内含2%的聚乙烯毗咯烷酮)及少量石英砂，冰浴研磨成浆，4℃下8000rpm离心20 min，上清液即粗酶液，定容至10 mL，用于过氧化物酶和多酚氧化酶活性的测定，置于-20℃冰箱中保存备用。

从-80℃冰箱中取出0.5 g相同部位的叶片放入预冷的研钵中，加入5 mL预冷的0.05 M硼酸缓冲液(pH8.8，含SmM巯基乙醇、1 mM EDTA和1%PVP)及少量石英砂，冰浴研磨成浆，4℃，8000 rpm离心20 min，上清液即粗酶液，定容至10 mL,用于苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性的测定，置于-20℃冰箱中保存备用。

从-80℃冰箱中取出1g相同部位的叶片放入预冷的研钵中，加入5 mL预冷的0.05M pH7.8磷酸缓冲液(内含2%的聚乙烯毗咯烷酮)及少量石英砂，冰浴研磨成浆，4℃， 8000rpm离心20 min，上清液即粗酶液，定容至25 mL，用于SOD 和CAT酶活性测定，置于-20℃冰箱中保存备用。

从-80℃冰箱中取出0.5g相同部位的叶片放入预冷的研钵中研磨至粉末，再加入7mL浓度为50 mmol/L乙酸钠缓冲液(pH 5.0)匀浆。混合物在4℃,15000 rpm离心15 min，上清液用于β-1, 3-葡聚糖酶活性测定，置于-20℃冰箱中保存备用。

7.2.3 植物相关防御酶和病程相关酶的活性测定

（1）过氧化物酶((POD)酶活性测定

取4支试管，分别加入0.05 M磷酸缓冲液(pH6.8 ) 0.5 mL,1%愈创木酚0.5 mL,粗酶液100 µL(其中对照管中加入灭活的粗酶液)，蒸馏水5mL，在加入2%H₂0₂ 0.5 mL后，立即开启秒表计时，在470 nm处测OD值，每30 s读一次数，读8-9 min(直到OD值不再升高或变化不大为止)。计算酶活。

POD活性＝△A₄₇₀×(V/Vt）/0.01×t×W

式中△A₄₇₀：反应时间内吸光值的变化；V：提取液总体积ml；Vt：测定时所用酶液体积ml；t：反应时间min；W：样品重量g。

（2）苯丙氨酸解氨酶(PAL)酶活性测定

取4支试管，分别加入0.1 M硼酸缓冲液(含5 mM的巯基乙醇)3.8 mL和0.02 M L-苯丙氨酸1 mL，再加入粗酶液100 µL(其中对照管中加入灭活的粗酶液)。40℃水浴60 min后，加入1 mL的6M盐酸终止反应，290 nm处测定OD值。酶活性计算。

PAL活性（U/(g.min) ）=( A_CK-A_E)/(C*×0.01*60)

式中A_CK:加入不加底物的对照组的吸光度；A_E:样品管的吸光度；C:蛋白含量；0.01:以每小时OD值变化0.01为1个U单位；60：反应时间为60min。

（3）超氧化物歧化酶(SOD)活性测定

取7支试管，每支试管加入磷酸缓冲液(pH7.8, 0.05 mol/L) 1.5 mL、甲硫氨酸溶液(130 mM) 0.3mL,氯化硝基氮蓝四唑（NBT) 750 µM 0.3mL, EDTA-Na 100 µM 0.3 mL,蒸馏水0.5 mL，共计2.9 mL(可将上述几种试剂按比例混合，现配现用)。然后其中三支加粗酶液100 µL，另4支加灭活的粗酶液。加入0.3 mL 200 µM核黄素。3支粗酶液试管及3支灭活酶液试管分别放在有4000 Lux日光灯光的光照培养箱，25℃光照15 min，一支灭活酶液处理管放在黑暗条件下15 min。灭活酶液黑暗处理管为对照调零，测定各光照处理OD₅₆₀nm。以抑制NBT光还原50%为一个酶活性单位，酶活性计算。

SOD总活性(U/g)=(A_ck一A_E) × V/1/2×A_ck×WxVt

式中: SOD总活性以每克样品的酶单位表示(U.g^-1) ; A_ck:光照对照管吸光度; A_E为样品管吸光度;V为样品液总体积(mL);Vt为测定时样品用量(mL);w为样品鲜质量(g)。

（4）过氧化氢酶(CAT)活性的测定

取4支试管，分别加入磷酸缓冲液(pH7.8, 0.05 mol/L) 5 mL,蒸馏水1 mL、粗酶液50 µL(对照管加灭活的粗酶液)，在加入2% H₂0₂(对照管加入等量的蒸馏水)后立即计时，并迅速倒入石英比色皿中，240 nm下测定吸光度，每隔30秒读数1次，共测9～10 min。计算酶活性。

CAT酶活性(U/g蛋白质)=△OD/[0.1×加入粗酶液中的蛋白含量(g)]

式中△OD=ODso-ODs₁,;0.1: OD₂₄₀每下降0.1为一个酶活单位(U)。

（5）对β-1,3葡聚糖酶活性的影响

蛋白质含量测定以牛血清蛋白为标准蛋白，采用昆布多糖法测定。

葡萄糖标准曲线的制作:取1 mglmL的葡萄糖0, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6,0.7, 0.8, 0.9mL补水至体积1.5 mL，加入2 mLDNS溶液终止反应，置于沸水浴5 min，迅速冷却，再加入4.5 mL蒸馏水，测定OD₅₄₀。以糖量为横坐标，OD值为纵坐标，绘制标准曲线Y=2.7259X-0.0.1208 ,r=0.9991.

取酶液0.1 mL，加入0.4 mL昆布多糖底物溶液，再加入1 mL醋酸-醋酸钠缓冲液(0.1 M, pH5.0)对照以0.1 mL缓冲液代替酶液，37℃水浴中反应30 min，随后加入2 mLDNS溶液终止反应，置于沸水浴5 min，迅速冷却，测定OD₅₄₀，对照标准曲线中计算还原糖量.以每克蛋白每分钟产生1µg还原糖的酶量为一个酶活单位(U)，大小以U /mg protein表示。

根据标准管吸光度（x）和浓度（y，mg/ml）建立标准曲线，将ΔA带入公式中计算出样品

中产生的还原糖的含量y值（mg/ml）

β-1,3葡聚糖酶活性(U/mg)= y÷Cpr

式中Cpr：样本蛋白质浓度

数据分析：表3显示，解淀粉芽孢杆菌BSS-142发酵液能显著提高黄瓜植株叶片的叶绿素含量，叶绿素含量提高到4.851mg/g，增长率为18.43%，增强了黄瓜植株光合作用，使得植株长大长壮，抗病能力增强；植物诱导抗性是植物经物理、化学或者生物等因素诱导后，对有害病原菌产生的抗性现象。从图9、10、11结果显示，解淀粉芽孢杆菌BSS-142发酵液显著提高了黄瓜植株氧化物酶（POD )、苯丙氨酸解氨酶(PAL )、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)等防御酶的活性和β-1,3-葡聚糖酶等植物抗病酶活性，与未处理黄瓜植株的相关防御酶和抗病酶相比，均提高了一倍以上。从而使黄瓜植株细胞的细胞壁的结构更加坚固和促进植株植保素、木质素及酚类化合物等抗病物质产生，致使黄瓜植株抗逆抗病能力增强。

、解淀粉芽孢杆菌BSS-142对黄瓜病害的防治效果

供试植物准备：挑选籽粒饱满的黄瓜种子用70%的酒精消毒1 min后，再用0.5%的次氯酸钠消毒1 min，无菌水冲洗5～6次，然后用40 ℃的无菌水浸泡2 h，(27±1) ℃恒温、黑暗催芽，待大部分种子出芽后，挑取出芽情况一致的种子，播种。

解淀粉芽孢杆菌BSS-142发酵液，采用上述二之1节中提供的方法。

病原菌孢子（菌体）悬液制备：分别将胡萝卜软腐欧文氏菌软腐致病型、丁香假单胞菌和黄假单胞菌等致病单胞菌属等病原菌用NA培养基28±1℃活化培养72h；将尖镰孢菌、大丽轮枝菌、立枯丝核菌、单囊壳孢和霜霉菌等病原菌用PDA培养基，26±1℃活化培养10ｄ～15 d；待生成大量菌体或孢子后，用适量无菌水洗脱，制成含孢（菌）量大于10⁸ cfu·ml^-1的孢子（菌）悬液，备用。

供试药剂: 解淀粉芽孢杆菌BSS-142发酵液为试验药剂，50%多菌灵可湿性粉剂800稀释液为阳性对照（真菌），20%噻唑锌悬浮剂800倍液（细菌），清水处理为空白对照。

防治试验（预防+治疗）：将育苗基质灭菌，接体积重量百分比30%的试验药剂、对照药剂和清水（空白对照）于无菌基质，保温（28±1℃）保湿放置3天。再将各病原菌孢子（菌）悬液按体积重量百分比10%接种于混合基质，保温（26±1℃）保湿下放置12天(真菌或放线菌）或3天（细菌），装育苗盘，标记。将出芽一致的供试黄瓜种子点种于育苗盘中，每盘点种50粒，每种病原菌悬液处理2盘，标记，常规管理，备用。再将试验药剂、对照药剂和无菌清水按25ml/株的量灌根处理，所有处理保温（28±1℃）保湿（75%～80%）管理。共处理3次，前2次每次间隔3天，后1次每次间隔7天。每天观察记录出苗、植株生长和发病（包括未出苗的，未出苗及时调查病因）情况，出苗后35天（空白对照发病率大于10%）统计发病植株及其发病情况，计算防治效果。试验结果见表5。

发病株率(%)=发病株数/调查总株数×100

防治效果(%)=(对照区发病株率－处理区发病株率)/对照区发病株率×100

表5：解淀粉芽孢杆菌BSS-142发酵液对黄瓜多种病害的防控效果

注释：表中同行小写字母不相同，表示在0.05水平上存在显著性差异（p≤0.05）；阳性对照为50%多菌灵可湿性粉剂800稀释液（真菌），20%噻唑锌悬浮剂800倍液（细菌）；同属病原菌引发的病害归为一种统计的。

表5结果显示，解淀粉芽孢杆菌BSS-142发酵液能有效防控由由尖镰孢菌、胡萝卜软腐欧文氏菌软腐致病型、大丽轮枝菌、立枯丝核菌、丁香假单胞菌和黄假单胞菌等致病单胞菌属霉等植物致病菌引发的黄瓜枯萎病、腐烂病、黄萎病、丝核茎基腐病和细菌性褐斑病等病害，平均防治效果在89%～95%，与对照农药在0.05水平上不存在显著性差异。由单囊壳孢和霜霉菌引发的黄瓜白粉病和霜霉病，平均防治效果在80%～83%，比对照农药50%多菌灵可湿性粉剂的防效好很多，在0.05水平上存在显著性差异，因为50%多菌灵可湿性粉剂对卵菌作用弱。

Claims (8)

1.一株解淀粉芽孢杆菌，该解淀粉芽孢杆菌是2022年3月7日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens，保藏编号为CGMCC No.24481。

2.如权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌，其特征在于，所述解淀粉芽孢杆菌在分离纯化过程中采用的分离纯化培养基配方为：葡萄糖10 g，蛋白胨8 g，NaCl 5 g，牛肉膏5 g，MnSO4·H2O 0.003g，琼脂粉适量,蒸馏水定容至1000 mL，pH 7.0。

3.如权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌在黄瓜病害防控中的应用。

4.如权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌的发酵液在黄瓜病害防控中的应用。

5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述发酵液制备时的发酵培养基配方为：牛肉膏6 g、酵母膏5 g、葡萄糖13 g、蒸馏水定容至1000 mL，pH7.0，此发酵培养基促进解淀粉芽孢杆菌生长繁殖，提高了其发酵液含菌量和抑菌活性。

6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述发酵液中有丙烯酸、大黄酸、吡啶基乙酸、奎宁酸、异考布松、异樱花苷、黄麻醇苷、异紫花前胡内酯、山柑子碱、去甲氧基姜黄素和白头翁素有机酸、生物碱和抑菌素类发酵液活性物质，及氨基酸和褪黑素植物抗胁迫化合物。

7.如权利要求3或4所述的应用，其特征在于，所述解淀粉芽孢杆菌在对尖镰孢菌、胡萝卜软腐欧文氏菌软腐致病型、大丽轮枝菌、立枯丝核菌、单囊壳孢、霜霉菌及丁香假单胞菌和黄假单胞菌中一种或任两种及以上引发的黄瓜枯萎病、腐烂病、黄萎病、丝核茎基腐病、白粉病、霜霉病和细菌性褐斑病防控中的应用。

8.如权利要求3或4所述的应用，其特征在于，所述解淀粉芽孢杆菌在提高植物抗病原浸染能力和抗逆境胁迫能力中的应用。

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