CN116731932B - 一株贝莱斯芽孢杆菌nbt78-2及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于微生物领域,涉及贝莱斯芽孢杆菌,特别是指一株贝莱斯芽孢杆菌NBT78‑2及其应用。其分类名为Bacillus velezensis,保藏于中国典型培养物保藏中心,保藏编号为CCTCC M 2023872,保藏地址为湖北省武汉市武昌区八一路299号。贝莱斯芽孢杆菌NBT78‑2能够抑制甜瓜枯萎病菌TG‑5及西瓜枯萎病菌XY‑2病原菌的菌丝生长,且具有促进西瓜和甜瓜苗期的生长作用,因此,该菌株具有开发成为防控甜瓜枯萎病菌生防菌的潜力。盆栽试验证明,加入该生物菌剂促进甜瓜的叶片增多,鲜重及叶绿素含量增加,增加西瓜的株高及鲜重,有助于苗圃里培育壮苗,利于西瓜甜瓜在田间的存活和生长。

Description

一株贝莱斯芽孢杆菌NBT78-2及其应用
技术领域
本发明属于微生物领域,涉及贝莱斯芽孢杆菌,特别是指一株贝莱斯芽孢杆菌NBT78-2及其应用。
背景技术
西瓜、甜瓜是我国重要的葫芦科作物,FAOSTAT数据显示中国甜瓜种植面积占全世界种植面积的34.28%,总产量占全世界总产量的46.75%。随着人们生活水平的提高,大多数人们提升了认知,开始追求绿色安全的优质西瓜、甜瓜等水果。因此,禁止或限制施用大量高毒、高残留农药的施用,开发和施用生物源农药已成为满足人类需求、保护环境和促进农业可持续发展的重要目标。
目前已有多种微生物产品存在,但因其在田间的定殖不足、持效期短等问题,挖掘和利用高效的微生物达到高效、环保的生物防治目的已成为当前农业科学研究的热点之一。生物防治是利用微生物之间,以及微生物与植物间的相互作用实现有益微生物对有害微生物的抑制作用。贝莱斯芽孢杆菌因其繁殖速度快、对病原菌作用方式广,且具有防病、促生的作用而在许多蔬菜作物及粮食作物上应用,如目前在申请的专利CN 113061554 A公开了一种贝莱斯芽孢杆菌B18该菌株对香蕉枯萎病原菌有很好的抑制作用,可以有效地控制香蕉枯萎病,减少损失,是一株在防治香蕉枯萎病上具有潜在意义的生防菌株。如专利CN114058541A公开了莱斯芽孢杆菌对农药酷拉斯有良好的耐受性,对小麦纹枯病病原菌具有良好的拮抗作用。而现有的芽孢杆菌针对西瓜甜瓜土传的尖孢镰孢菌并未有显著的抑制效果。
发明内容
本发明公开了一株贝莱斯芽孢杆菌NBT78-2及其应用,本申请的贝莱斯芽孢杆菌可以同时抑制甜瓜枯萎病菌及西瓜枯萎病菌病原菌的菌丝生长,且具有促进甜瓜苗期的生长作用。
本发明的技术方案是这样实现的:
一株贝莱斯芽孢杆菌NBT78-2,其分类名为Bacillus velezensis,保藏于中国典型培养物保藏中心,保藏编号为CCTCC NO:M 2023872,保藏地址为中国武汉武汉大学。保藏日期2023年5月30日
含有上述的贝莱斯芽孢杆菌NBT78-2的菌剂,其有效成分为贝莱斯芽孢杆菌NBT78-2。
上述菌剂中贝莱斯芽孢杆菌NBT78-2的浓度为1×107CFU/mL。
上述的贝莱斯芽孢杆菌NBT78-2或者上述的菌剂在抑制甜瓜枯萎病菌中的应用。
进一步,所述甜瓜枯萎病菌为甜瓜枯萎病菌TG-5。
上述的贝莱斯芽孢杆菌NBT78-2或者上述的菌剂在西瓜枯萎病菌中的应用。
进一步,所述西瓜枯萎病菌为西瓜枯萎病菌XY-2。
上述的贝莱斯芽孢杆菌NBT78-2或者上述的菌剂在促进瓜类苗期生长中的作应用。
上述瓜类指西瓜或甜瓜。
上述的应用中,使用方法为:贝莱斯芽孢杆菌NBT78-2的菌液或菌剂中贝莱斯芽孢杆菌NBT78-2的浓度为1×107CFU/mL。
上述的贝莱斯芽孢杆菌NBT78-2或者上述的菌剂在降解土壤中难溶磷、钾及氮释放中的应用。
上述的贝莱斯芽孢杆菌NBT78-2或者上述的菌剂在土壤定殖中的应用。
本发明具有以下有益效果:
1、本申请发现的贝莱斯芽孢杆菌NBT78-2能够抑制甜瓜枯萎病菌TG-5及西瓜枯萎病菌XY-2病原菌的菌丝生长,且具有促进西瓜和甜瓜苗期的生长作用,因此,该菌株具有开发成为防控西甜瓜枯萎病菌生防菌的潜力。盆栽试验证明,加入该生物菌剂促进甜瓜的叶片增多,鲜重及叶绿素含量增加;增加西瓜的株高及鲜重,有助于苗圃里培育壮苗,利于西瓜甜瓜在田间的存活和生长。
2、本申请的贝莱斯芽孢杆菌NBT78-2具有广谱抑菌性。对拮抗菌处理6d后对甜瓜枯萎病菌菌丝有明显的拮抗作用,分析发现甜瓜枯萎病菌菌丝的抑制率为72.4%(图2A);对尖孢镰孢菌西瓜专化型Fusarium oxysporum f.sp. niveum、菜豆壳球孢(Macrophomina phaseolina)、轮枝镰孢菌(Fusarium verticillioides)、西瓜黑轮斑病(Alternaria cucumerina)菌丝有明显的拮抗作用(图3)。对尖孢镰孢菌西瓜专化型的抑制率为74.05%,对菜豆壳球孢的抑制率为77.65%,对轮枝镰孢菌的抑制率为66.24%、对西瓜黑轮斑病的抑制率为78.74%。
3、本申请的贝莱斯芽孢杆菌NBT78-2对甜瓜拮抗菌处理的植株叶片增加,颜色浓绿,生长势壮,而对照植株叶片数少,植株生长势弱。生物膜形成实验(图6)表明本申请的贝莱斯芽孢杆菌可形成生物膜,说明该菌株具备超强的定殖能力,可以抑制病原物生长,达到促进植株促生的目的。同时还具备可解有机磷、无机磷、解钾、固氮的特征,将该菌添加到土壤中,可使土壤中难溶的磷、钾及氮释放,使植物可吸收利用,从而促进植物生长。
4、本申请的贝莱斯芽孢杆菌NBT78-2处理甜瓜幼苗后,与对对照株相比发病率差异较大,对照植株的发病率为100%,病情指数为80.8;NBT78-2处理的植株发病率为20%,病情指数为10。对甜瓜枯萎病的防治效果可达80%。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案,下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍,显而易见地,下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为在LB培养基上的菌落特征。
图2为拮抗菌对甜瓜枯萎病菌的拮抗作用,其中A为 NBT78-2处理后与对照相比其抑制作用; B为NBT78-2处理后与对照的菌丝形态,bar=20 μm;C为NBT78-2处理后菌丝直径与对照的差异分析,****为在p<0.001水平差异显著。
图3为NBT78-2的抑菌谱。
图4为基于16S和gyrB的系统进化树。
图5为NBT78-2处理14d和28d后甜瓜植株生长的影响。
图6为NBT78-2经结晶紫染色后形成生物膜。
图7为抗生素和促生相关基因的扩增。
图8为NBT78-2对甜瓜枯萎病菌的抗病作用。
图9为NBT78-2降解氮磷钾的效果图。
图10为NBT78-2分泌酶活性示意图。
图11为NBT78-2对西瓜苗期的促生作用。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例,对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有付出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。
实施例1:菌的分离与鉴定
甜瓜根际土壤样品采集于宁波市蔬菜研究所的甜瓜大棚基地。带回实验室,将土壤进行自然风干后称10 g放入灭菌的250ml的三角瓶中,加入90mL无菌水,30℃恒温,180rpm震荡混匀30min。取1mL溶液依次进行梯度稀释到10-1,10-2,10-3,10-4,10-5,10-6,分别取10-4,10-5,10-6浓度的样品100μL均匀涂布于TSA平板上,每个样品梯度设3个重复,用封口膜将培养皿封好,30℃恒温培养。当平板长出菌落后,用接种针挑取菌落在新的培养基上划线培养,纯化。
在LB培养基上菌落表现为乳白色,48h后表面光滑,随着培养时间的延长其开始出现皱褶(图1)。
利用16s、gyrA、gyrB基因等基因的引物扩增获得对应基因的序列。
27F:5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3';
1492R:5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3';
gyrA-F:CAGTCAGGAAATGCGTACGTCCTT;
gyrA-R:CAAGGTAATGCTCCAGGCATTGCT;
gyrB-F:5′-GAAGTCATCATGACCGTTCTGCAYGCNGGNGGNAARTTYGA-3′;
gyrB-R:5′-AGCAGGGTACGGATGTGCGAGCCRTCNACRTCNGCRTCNGTCAT-3′。
利用16s、gyrA和gyrB基因的引物扩增获得对应基因的序列,本申请菌株的16S序列如SEQ ID No.1所示、gyrA基因序列如SEQ ID No.2所示、gyrB基因序列如SEQ ID No.3所示,发现其与贝莱斯芽孢杆菌聚为一类。结果如图4所示,可知表明该菌株为贝莱斯芽孢杆菌。
实施例2:NBT78-2拮抗病菌的抑制率
1、NBT78-2对甜瓜枯萎病菌的抑制率
将活化好的5 mm菌株接种于PDA平板中心,拮抗菌5ul接种于距离中心位置2.5 cm处,27°C恒温培养箱培养至对照的空白菌株生长整个平板,开始统计菌丝的生长直径,按照抑制率(%)=(对照直径-处理直径)/对照直径×100%计算拮抗菌对菌丝的抑制作用。并比较拮抗后和CK对照菌株的菌丝形态。
拮抗菌处理6d后,对甜瓜枯萎病菌菌丝有明显的拮抗作用,分析发现甜瓜枯萎病菌菌丝的抑制率为72.4%(图2A)。菌丝生长状态受阻,利用超景深三维显微镜(ultra-depththree-dimensional microscope)观察发现NBT78-2处理的菌丝有明显的凹陷,且有球状突起,而对照则表现为菌丝生长直且形态饱满(图2B),NBT78-2处理后的菌丝直径比对照显著变小(p<0.01)(图2C)。
2、NBT78-2对西瓜枯萎病菌的抑制率
将活化好的5 mm菌株接种于PDA平板中心,拮抗菌5ul接种于距离中心位置2.5 cm处,27°C恒温培养箱培养至对照的空白菌株生长整个平板,开始统计菌丝的生长直径,按照抑制率(%)=(对照直径-处理直径)/对照直径×100%计算拮抗菌对菌丝的抑制作用。并比较拮抗后和CK对照菌株的菌丝形态。
拮抗菌处理6d后对西瓜枯萎病菌菌丝有明显的拮抗作用(图3),分析发现其抑制率为74.4%。
3、NBT78-2的抑菌谱分析
针对西瓜、甜瓜生产上常见的土传和叶部病害,评价NBT78-2是否具有抑菌广谱性(如图3所示)。选用西甜瓜根部及叶部的几种病害:尖孢镰孢菌西瓜专化型Fusarium oxysporum f.sp. niveum、菜豆壳球孢(Macrophomina phaseolina)、轮枝镰孢菌(Fusarium verticillioides)、西瓜黑轮斑病(Alternaria cucumerina)。对尖孢镰孢菌西瓜专化型的抑制率为74.05%,对菜豆壳球孢的抑制率为77.65%,对轮枝镰孢菌的抑制率为66.24%、对西瓜黑轮斑病的抑制率为78.74%。该结果表明其具有广谱抑菌性。
实施例3:贝莱斯芽孢杆菌NBT78-2苗期促进甜瓜、西瓜生长
1、幼苗接种处理
试验分为对照组和处理组。催芽至种子露白时播种,待植株出土时,用1×107CFU/mLNBT78-2接种植株,每株接种20 mL,用摇菌的空白培养基按照接菌的比例稀释接种,作为阴性对照,接种后随时观察植株的生长状态。每个处理的每组植株15株,设3个重复。
甜瓜出苗后14 d接种NBT78-2的植株表现叶片厚,颜色绿,茎秆粗壮,真叶出现2片,而对照只出现一个真叶(图5A)。
西瓜出苗后21 d接种NBT78-2的植株表现叶片大、植株高、茎秆粗壮,如图11A所示。
2、 叶绿素含量测定
取0.2 g叶片加入1 mL的95%乙醇,用组织破碎仪45HZ破碎90s,随后用12000 rpm离心5 min。取上清用95%乙醇定容至25 mL,混匀。取100 uL加入到酶标板中,用95%作为空白对照,在665 nm、649 nm和470 nm的波长测定其吸光度。每个处理随机选5株植株,测定处理和对照的吸光值。叶绿素Ca=13.95×A665-6.88×A649;叶绿素Cb=24.96×A649-7.32×A665;类胡萝卜素CX C=(1000×A649-2.05×Ca-114.8×Cb)/245。
采用graphpad prism软件独立样本T检验分析差异显著性并作图。所有实验结果均用均值和标准差表示(平均值±标准差)。
分析NBT78-2拮抗菌处理28d后的甜瓜植株生理指标发现,NBT78-2处理后的叶绿素a、b与对照在0.01水平上差异显著(图5C),NBT78-2处理后植株的根鲜重在p<0.05水平差异显著,而叶鲜重、叶干重及叶片数与对照在p<0.01水平上差异显著(图5D)。
西瓜植株处理后,株高、叶鲜重、及叶片数与对照在p<0.01水平上差异显著(图11B)。
该结果说明NBT78-2处理后的植株叶绿素含量提高、植株鲜重增加、叶片数增加,植株的地上部分及根部的鲜物质含量均有不同程度的提升。因此NBT78-2对甜瓜、西瓜表现出明显的促生作用。
3、植株生长势测定
在用NBT78-2处理甜瓜幼苗28 d后,取拮抗菌处理和对照的植株,尽量不损害到植株的根,用清水小心的洗掉根部土壤,在自然环境下晾干表面的水分。用万分之一的天平称取植株的地上部分、底下部分及整株植株的重量,并记录对应植株的叶片数。
处理28 d后,拮抗菌处理的甜瓜植株叶片增加,颜色浓绿,生长势壮,而对照植株叶片数少,植株生长势弱(图5B)。
实施例4:拮抗菌NBT78-2促生性能分析
1、贝莱斯芽孢杆菌生物膜生长量的测定
方法参照(蓝达愉 et al., 2022),取菌株B4-8新鲜菌液以2%的接种量接种于含有1 mL NA培养液的EP管中混匀,于28 ℃条件下静置培养24h,倒去菌液,用无菌水冲洗一遍后,加入1 mL的1%结晶紫染液染色15 min,用无菌水将染液冲洗1次,置于室温下吹干,如果有紫色环出现就表示能形成生物膜(图6)。随后,每管用1 mL的95%乙醇用移液器轻轻抽打,彻底将离心管内壁上形成的紫环冲洗下来,在600 nm处测定吸光度值,结果如表1所示:
表1依据吸光值计算各个指标
分别设置3次重复,每个重复设3管。计算方法:Cut off值Ac=平均值(阴性对照)+3×SD(阴性对照) ;A=A均值-Ac公式计算。A≤Ac无生物膜产生;2Ac≥A>Ac弱生物膜产生;4Ac≥A>2Ac中度生物膜产生;A>4Ac强生物膜产生(时文静 et al., 2020, 鲍佳佳 etal., 2021, Srdjan Stepanović 2007)。
由表2可知A值(4.238)远大于4Ac,判断NBT78-2可形成强的生物膜。该结果表明NBT78-2在土壤中的定殖能力很强,将该菌施加到土壤里,一方面可以竞争病原菌的生存空间和营养,减少病原菌定殖,另一方面其定殖能力强,可抑制病原物生长,达到促进植株促生的目的。
2、水解酶及抗生特性
水解酶的产生在一定程度上与其生防效果有一定的相关性。水解酶包括蛋白酶、几丁质酶、ß-1,3-葡聚糖酶、纤维素酶等。
本申请的菌株具备可解有机磷、无机磷、解钾、固氮的特征,将该菌添加到土壤中,可使土壤中难溶的磷、钾及氮释放如图9所示,使植物可吸收利用,从而促进植物生长。
此外,NBT78-2还具有分泌酶的特性,如图10所示,水解酶活性的产生在一定程度上与其生防效果有一定的相关性。水解酶包括蛋白酶、几丁质酶、ß-1,3-葡聚糖酶、纤维素酶等,分析发现可分泌蛋白酶和纤维素酶,不能分泌几丁质酶、ß-1,3-葡聚糖酶。该菌株可分泌蛋白酶和纤维素酶,推测可能会甜瓜枯萎病菌的菌丝呈现菌丝膨大,可起到抑制病原菌生长的作用,促进植株健康生长。
3、脂肽类抗菌活性物质合成及促生相关基因的分析
参考Mora等的方法(Mora I, 2011),PCR扩增菌株NBT78-2基因组DNA,筛选其是否含有合成相关抗菌物质的基因和促生相关的基因:相关抗菌物质的基因包括fenD(fengycin丰原素)(Kalai-Grami etal., 2014),Iturin(iturin伊枯草菌素)(Mora I,2011),BMYBa(Bacyllomicin杆菌抗霉素)(Farzand et al., 2019),Surfactin 枯草菌表面活性素(Khedheret al., 2020),BACa和BACb(Bacilysin溶杆菌素)(Mora I, 2011, Yiet al., 2021, Yi Y J, 2022),促生相关的基因包括Expansin(Expansin细胞生长素)、S11AA1(Salicylic acid水杨酸)、SICKI和PAL(Phenylalanine苯丙氨酸)相关的基因。
表2抗菌和促生相关基因扩增引物信息
由表2可知,芽孢杆菌是一类重要的生防菌,脂肽化合物是芽孢杆菌产生的最主要抑菌化合物,主要包括伊枯草菌素(Iturin)、表面活性素(Surfactin)和丰原素(Fengycin)三大类,在植物病害防治过程中发挥着重要的作用。
进一步用1%琼脂糖电泳显示可扩增出溶杆菌素BACb、杆菌抗霉素BMYBa和BMYBb及枯草菌表面活性素Surfactin,未检测到BACa、Fengycin和Iturin相关的基金;促生相关基因可扩增出促进细胞生长的相关基因expansin和SIK1-12基因,而水杨酸S11AA1和苯丙氨酸PAL未扩增出来(图7)。说明该菌可促进植物生长,并能抑制病原菌生长,从而达到抗病的目的。
实施效果例:NBT78-2对甜瓜枯萎病菌的抗病作用
甜瓜幼苗在(2叶一新至3叶),采用蘸根法接种甜瓜枯萎病菌,浓度为1×107个孢子/ml,每株接种10ml。接种8天后NBT78-2处理的植株生长表现很好,而对照植株开始表现萎蔫。在接种14 d时,NBT78-2处理的植株生长势旺盛,没有明显的萎蔫枯死症状(图8A),而对照植株表现为不同程度的茎部变褐、植株枯萎症状(图8B),调查发现对照植株的发病率为100%,病情指数为80.8;NBT78-2处理的植株发病率为20%,病情指数为10。对甜瓜枯萎病的防治效果可达80%。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已,并不用以限制本发明,凡在本发明的精神和原则之内,所作的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一株贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)NBT78-2,保藏于中国典型培养物保藏中心,保藏编号为CCTCC M 2023872,保藏地址为湖北省武汉市武昌区八一路299号。
2.含有权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌NBT78-2的菌剂,其有效成分为贝莱斯芽孢杆菌NBT78-2。
3.根据权利要求2所述的贝莱斯芽孢杆菌NBT78-2的菌剂,其特征在于:所述菌剂中贝莱斯芽孢杆菌NBT78-2的浓度为1×107 CFU/mL。
4.权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌NBT78-2或者权利要求2或3所述的菌剂在抑制甜瓜枯萎病菌中的应用。
5.权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌NBT78-2或者权利要求2或3所述的菌剂在西瓜枯萎病菌中的应用。
6.权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌NBT78-2或者权利要求2或3所述的菌剂在促进瓜类苗期生长中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用,其特征在于:所述瓜类指西瓜或甜瓜。
8.根据权利要求4或5或6或7所述的应用,其特征在于,使用方法为:贝莱斯芽孢杆菌NBT78-2的菌液或菌剂中贝莱斯芽孢杆菌NBT78-2的浓度为1×107 CFU/mL。
9.权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌NBT78-2或者权利要求2或3所述的菌剂在降解土壤中难溶磷、钾及氮释放中的应用。
10.权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌NBT78-2或者权利要求2或3所述的菌剂在土壤定殖中的应用。
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