CN113061565B - 一种禾谷镰孢分生孢子快速形成方法 - Google Patents

一种禾谷镰孢分生孢子快速形成方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种禾谷镰孢分生孢子快速形成方法，属于微生物技术领域、本发明公开的一种禾谷镰孢分生孢子快速形成方法，所用培养基为浓度0.9％‑1.5％的盐水；培养温度28‑30℃；培养时间96h‑120h；初始pH为8‑10；光照，可见光；振动速度150‑180rpm。本发明方法快速、简单、经济并且产孢速度快，为生产大量分生孢子提供了系统的、易于使用的孢子形成技术，用于禾谷镰孢的各种理论研究、致病力测定及田间不同作物品种抗源筛选和鉴定工作。

Description

一种禾谷镰孢分生孢子快速形成方法
技术领域
本发明涉及微生物技术领域技术领域，更具体的说是涉及一种禾谷镰孢分生孢子快速形成方法。
背景技术
镰孢菌是全世界重要的真菌病原体，可引起根，茎和叶病害。迄今为止，至少有15种镰孢菌引起玉米穗腐烂、茎秆腐烂、鞘腐烂、幼苗枯萎和种子腐烂。其中，由禾谷镰孢引起的病害尤为突出，茎腐烂(FSR)和穗腐烂(FER)是最普遍和破坏性病害之一，导致玉米减产，FSR和FER抗性品种的开发和种植是减少这些病害造成的损失的最经济，最有效的策略。但在正常条件下，绝大多数禾谷镰孢(Fusarium graminearum)在不易产生分生孢子，没有分生孢子，很难通过形态特征鉴定镰孢菌，分离单个分生孢子以进行遗传多样性分析，大规模致病性测试或使用定量接种筛选抗性植物基因型。因此，分生孢子的大量生产对于禾谷镰孢的研究非常重要。
目前，实验室条件下禾谷镰孢的产孢主要有两种方法:固体平板培养和液体培养。已有的固体培养法主要是康乃馨叶片培养基，可以获得少量分生孢子用于禾谷镰孢的鉴定和单孢子分离等研究，但无法获得大量分生孢子用于接种试验，如菌株致病力测定及田间不同作物品种抗源筛选和鉴定工作；另一种就是液体培养法，报道较多的是绿豆液体培养基(MB)，需将绿豆在水中煮沸5-30min，用粗纱布过滤，滤液灭菌后作为培养基，培养14天可以获得比固体平板培养多很多的分生孢子，用于致病力测定及田间不同作物品种抗源筛选和鉴定工作，但这种方法操作复杂，耗时长，成本高，产量也并不突出。
因此，提供一种禾谷镰孢分生孢子快速形成方法是本领域技术人员亟需解决的问题。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种禾谷镰孢分生孢子快速形成方法，该方法简单、快速、经济且产孢速度快。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种禾谷镰孢分生孢子快速形成方法，具体步骤如下：
(1)液体培养基质的制备：用自来水配制浓度为0.9％-1.5％的盐水，pH值调整为8-10；分装，每100ml三角瓶装液量为15ml，121℃灭菌30min，冷却后备用；
(2)禾谷镰孢的扩繁：将禾谷镰孢转移至马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基上培养，备用；
(3)禾谷镰孢产孢的培养：挑取7-8个步骤(2)扩繁的均匀布满菌丝的禾谷镰孢的菌蝶(直径0.7cm)转移到步骤(1)灭菌后的三角瓶中培养，培养温度28-30℃；培养时间96h-120h；初始pH为8-10；光照，可见光150-200lux；振动速度150-180rpm；
(4)禾谷镰孢分生孢子悬浮液的获得及计数：培养96h-120h后，用双层纱布过滤，获得分生孢子悬浮液，计数。
优选地，步骤(1)所述盐水的浓度为0.9％。
进一步，步骤(2)所述培养条件为26-28℃黑暗培养8-10天。
进一步，步骤(4)所述计数方法为：取5μl分生孢子悬浮液在玻璃载玻片上涂一条线(约2mm宽)，在光学显微镜下计数，具体方法为：从玻璃载玻片一端开始移动计数，统计5μl分生孢子悬浮液中的孢子数；分生孢子悬浮液的浓度(分生孢子个数/ml)为：5μl分生孢子悬浮液中的孢子数/5×103。
经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开提供了一种禾谷镰孢分生孢子快速形成方法，所用培养基为浓度0.9％-1.5％的盐水；培养温度28-30℃；培养时间96h-120h；初始pH为8-10；光照，可见光；振动速度150-180rpm。本发明方法快速、简单、经济并且产孢速度快，为生产大量分生孢子提供了系统的、易于使用的孢子形成技术，用于禾谷镰孢的各种理论研究、致病力测定及田间不同作物品种抗源筛选和鉴定工作。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
玉米穗腐病菌禾谷镰孢菌LD8和玉米茎基腐病菌禾谷镰孢MD12为本实验室分离保存；所用菌种为禾谷镰孢菌即可，无特殊限定。
实施例1
一种禾谷镰孢分生孢子快速形成方法，具体步骤如下：
(1)液体培养基质的制备：用自来水配制浓度为0.9％的盐水，pH值调整为8；分装，每100ml三角瓶装液量为15ml，121℃灭菌30min，冷却后备用；
(2)禾谷镰孢的扩繁：分别将玉米穗腐病菌禾谷镰孢菌LD8和玉米茎基腐病菌禾谷镰孢MD12转移至马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基上，28℃黑暗培养8天，备用；
(3)禾谷镰孢产孢的培养：挑取7个步骤(2)扩繁的玉米穗腐病菌禾谷镰孢菌LD8或玉米茎基腐病菌禾谷镰孢MD12的菌蝶(直径0.7cm)转移到步骤(1)灭菌后的三角瓶中培养，培养温度28℃；培养时间96-120h；初始pH为8；光照，可见光200lux；振动速度150rpm；
(4)禾谷镰孢分生孢子悬浮液的获得及计数：培养96-120h后，用双层纱布过滤，获得分生孢子悬浮液，计数；试验重复3次。
计数方法为：取5μl分生孢子悬浮液在玻璃载玻片上涂一条线(约2mm宽)，在光学显微镜下计数，具体方法为：从玻璃载玻片一端开始移动计数，统计5μl分生孢子悬浮液中的孢子数；分生孢子悬浮液的浓度(个/ml)为：5μl分生孢子悬浮液中的孢子数/5×103。
(5)结果：通过以上培养条件，在96h时，分生孢子悬浮液的浓度就达到最大，其中禾谷镰孢菌株LD8浓度可达4.3×106个/ml，禾谷镰孢菌株MU12浓度可达1.2×107个/ml；继续培养到120h，浓度变化不大。
实施例2
一种禾谷镰孢分生孢子快速形成方法，具体步骤如下：
(1)液体培养基质的制备：用自来水配制浓度为1.2％的盐水，pH值调整为9；分装，每100ml三角瓶装液量为15ml，121℃灭菌30min，冷却后备用；
(2)禾谷镰孢的扩繁：分别将玉米穗腐病菌禾谷镰孢菌LD8和玉米茎基腐病菌禾谷镰孢MD12转移至马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基上，27℃黑暗培养9天，备用；
(3)禾谷镰孢产孢的培养：挑取7个步骤(2)扩繁的玉米穗腐病菌禾谷镰孢菌LD8或玉米茎基腐病菌禾谷镰孢MD12的菌蝶(直径0.7cm)转移到步骤(1)灭菌后的三角瓶中培养，培养温度29℃；培养时间96-120h；初始pH为9；光照，可见光180lux；振动速度160rpm；
(4)禾谷镰孢分生孢子悬浮液的获得及计数：培养96-120h后，用双层纱布过滤，获得分生孢子悬浮液，计数；试验重复3次。
计数方法为：取5μl分生孢子悬浮液在玻璃载玻片上涂一条线(约2mm宽)，在光学显微镜下计数，具体方法为：从玻璃载玻片一端开始移动计数，统计5μl分生孢子悬浮液中的孢子数；分生孢子悬浮液的浓度(个/ml)为：5μl分生孢子悬浮液中的孢子数/5×103。
(5)结果：通过以上培养条件，在96h时，分生孢子悬浮液的浓度就达到最大，其中禾谷镰孢菌株LD8浓度可达1.3×104个/ml，禾谷镰孢菌株MU12浓度可达3.3×105个/ml；继续培养到120h，浓度变化不大。
实施例3
一种禾谷镰孢分生孢子快速形成方法，具体步骤如下：
(1)液体培养基质的制备：用自来水配制浓度为1.5％的盐水，pH值调整为10；分装，每100ml三角瓶装液量为15ml，121℃灭菌30min，冷却后备用；
(2)禾谷镰孢的扩繁：分别将玉米穗腐病菌禾谷镰孢菌LD8和玉米茎基腐病菌禾谷镰孢MD12转移至马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基上，26℃黑暗培养10天，备用；
(3)禾谷镰孢产孢的培养：挑取8个步骤(2)扩繁的玉米穗腐病菌禾谷镰孢菌LD8或玉米茎基腐病菌禾谷镰孢MD12的菌蝶(直径0.7cm)转移到步骤(1)灭菌后的三角瓶中培养，培养温度30℃；培养时间96-120h；初始pH为10；光照，可见光150lux；振动速度180rpm；
(4)禾谷镰孢分生孢子悬浮液的获得及计数：培养96-120h后，用双层纱布过滤，获得分生孢子悬浮液，计数；试验重复3次。
计数方法为：取5μl分生孢子悬浮液在玻璃载玻片上涂一条线(约2mm宽)，在光学显微镜下计数，具体方法为：从玻璃载玻片一端开始移动计数，统计5μl分生孢子悬浮液中的孢子数；分生孢子悬浮液的浓度(个/ml)为：5μl分生孢子悬浮液中的孢子数/5×103。
(5)结果：通过以上培养条件，在96h时，分生孢子悬浮液的浓度就达到最大，其中禾谷镰孢菌株LD8浓度可达1.1×104个/ml，禾谷镰孢菌株MU12浓度可达8.5×104个/ml；继续培养到120h，浓度变化不大。
对比例1绿豆(MB)培养基培养分生孢子
绿豆培养基的制备方法：
将20g绿豆置于1L灭菌水中煮沸30min，过滤至清澈无残渣，制备MB培养基。将MB培养基分装至容量为100的三角瓶，每瓶15ml；灭菌冷却后，挑取7个扩繁的玉米穗腐病菌禾谷镰孢菌LD8或玉米茎基腐病菌禾谷镰孢MD12的菌蝶(直径0.7cm)转移到灭菌后的三角瓶中培养，培养温度28℃；培养时间96-120h；初始pH为8；光照，可见光200lux；振动速度180rpm；培养96-120h后，用双层纱布过滤，获得分生孢子悬浮液，计数；试验重复3次。
(5)结果：通过以上培养条件，在96h时，分生孢子悬浮液的浓度就达到最大，其中禾谷镰孢菌株LD8浓度可达3.0×104个/ml，禾谷镰孢菌株MU12浓度可达2.5×104个/ml；继续培养到120h，浓度变化不大。
对比例2无菌自来水培养分生孢子
将自来水分装至容量为100的三角瓶，每瓶15ml；灭菌冷却后，挑取7个扩繁的玉米穗腐病菌禾谷镰孢菌LD8或玉米茎基腐病菌禾谷镰孢MD12的菌蝶(直径0.7cm)转移到灭菌后的三角瓶中培养，培养温度28℃；培养时间96-120h；初始pH为8；光照，可见光200lux；振动速度180rpm；培养96-120h后，用双层纱布过滤，获得分生孢子悬浮液，计数；试验重复3次。
结果：通过以上培养条件，在96h时，分生孢子悬浮液的浓度就达到最大，其中禾谷镰孢菌株LD8浓度可达1.2×103个/ml，禾谷镰孢菌株MU12浓度可达3.8×103个/ml；继续培养到120h，浓度变化不大。
对比例3
盐水浓度为0.8％，其他操作步骤同实施例1。
结果：通过以上培养条件，在96h时，分生孢子悬浮液的浓度就达到最大，其中禾谷镰孢菌株LD8浓度可达3.8×103个/ml，禾谷镰孢菌株MU12浓度可达9.1×103个/ml；继续培养到120h，浓度变化不大。
对比例4
盐水浓度为1.6％，其他操作步骤同实施例1。
结果：通过以上培养条件，在96h时，分生孢子悬浮液的浓度就达到最大，其中禾谷镰孢菌株LD8浓度可达1.3×103个/ml，禾谷镰孢菌株MU12浓度可达3.2×103个/ml；继续培养到120h，浓度变化不大。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims (5)

1.一种禾谷镰孢分生孢子快速形成方法，其特征在于，具体步骤如下：
（1）液体培养基质的制备：用自来水配制浓度为0.9%-1.5%的盐水，pH值调整为8-10；分装，每100 ml三角瓶装液量为15 ml，121℃灭菌30 min，冷却后备用；
（2）禾谷镰孢的扩繁：将禾谷镰孢转移至PDA培养基上培养，备用；
（3）禾谷镰孢产孢的培养：挑取7-8个步骤（2）扩繁的禾谷镰孢的菌蝶转移到步骤（1）灭菌后的三角瓶中培养，培养温度28-30℃；培养时间96 h-120 h；初始pH为8-10；光照，可见光150-200 lux；振动速度150-180 rpm；
（4）禾谷镰孢分生孢子悬浮液的获得及计数：培养96 h-120 h后，用双层纱布过滤，获得分生孢子悬浮液，计数。
2.根据权利要求1所述的一种禾谷镰孢分生孢子快速形成方法，其特征在于，步骤（1）所述盐水的浓度为0.9%。
3.根据权利要求1所述的一种禾谷镰孢分生孢子快速形成方法，其特征在于，步骤（2）所述培养的条件为26-28℃黑暗培养8-10天。
4.根据权利要求1所述的一种禾谷镰孢分生孢子快速形成方法，其特征在于，步骤（3）所述菌蝶的直径为0.7 cm。
5.根据权利要求1所述的一种禾谷镰孢分生孢子快速形成方法，其特征在于，步骤（4）所述计数的方法为：取5μl分生孢子悬浮液在玻璃载玻片上涂一条线，在光学显微镜下计数；分生孢子悬浮液的浓度为：5 μl分生孢子悬浮液中的孢子数/ 5×103，浓度的单位为个/ ml。
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