CN1644026A

CN1644026A - 一种甘蔗抗逆新种质材料的培育方法

Info

Publication number: CN1644026A
Application number: CN 200510007107
Authority: CN
Inventors: 张树珍; 杨本鹏; 冯翠莲; 曾艳波; 罗敬萍; 蔡文伟; 杨学
Original assignee: State Key Laboratory Of Tropical Bioscience And Biotechnlogy Tropical Agricultural Academe Of China; Institute of Tropical Bioscience and Biotechnology Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences
Current assignee: State Key Laboratory Of Tropical Bioscience And Biotechnlogy Tropical Agricultural Academe Of China; Institute of Tropical Bioscience and Biotechnology Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences
Priority date: 2005-01-19
Filing date: 2005-01-19
Publication date: 2005-07-27

Abstract

本发明公开了一种利用植物基因工程技术培育甘蔗抗逆新种质的方法。该法把担子菌灰树花的海藻糖合酶基因通过农杆菌介导法转入甘蔗的胚性细胞中，再通过胚状体成苗途径培育出完整的植株(转基因植株)。所获得的转基因植株由于能够合成和积累高水平的海藻糖，并表现出很强的抗逆性，在逆境条件下其比对照生长得好，而且产量和含糖量均得到了较大幅度的提高。利用该法培育甘蔗抗逆新种质具有培育周期短、效率高、成本低、不受外界条件影响等优点，其将加速我国甘蔗抗逆品种培育的进程，促进蔗糖业的发展，具有广阔的应用前景。

Description

一种甘蔗抗逆新种质材料的培育方法

技术领域

本发明涉及一种运用植物基因工程技术培育甘蔗抗逆种质的方法。

背景技术

甘蔗(Saccharum officinarum L.)是全世界最为重要的糖料经济作物，也是我国热带、亚热带地区重要的糖料经济作物。目前我国是世界第3大产糖国，2003/2004榨季全国总产糖量达到1002万吨，其中甘蔗糖占总产糖量的94％。近年来甘蔗还发展成为一种重要的能源作物，是生产绿色燃料——酒精的重要原料。我国甘蔗主要种植于广西、云南、广东、福建、海南等十三个省区，种植面积已超过120万公顷，其中旱地甘蔗面积占90％左右。干旱和冷害是我国甘蔗生产面临的主要问题，因而培育抗逆甘蔗新品种尤为重要。

由于现代甘蔗栽培种是甘蔗属热带种，割手密和印度种等物种的种间杂交种，在长期的高贵化育种过程中，减数分裂的异常使得现代甘蔗栽培种形成了大量的非整倍体，其染色体数量多、基因组结构复杂、在同株中染色体倍数不同，同时由于甘蔗对光周期反应敏感，许多重要亲本在亚热带和温带地区很难开花，即使开花花粉量也不足，而且经常与近缘植物的花期不遇，这给常规的抗逆育种带来许多困难，影响了甘蔗抗逆育种的进程。

海藻糖具有极强的稳定蛋白质及细胞膜结构的功能，它能使生物体在许多异常情况下，如高温脱水(干燥、高渗透压)、冷冻时仍保持细胞内湿润，防止细胞因失水而造成细胞内养分的损失和细胞的损伤，从而使这些生物具有较强的抗旱、抗寒的能力。

海藻糖在不同的生物体中具有不同的代谢途径，其相应的酶及作用的底物也不相同。如大肠杆菌(Escherichia coli)和酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)其海藻糖的合成均通过海藻糖-6-磷酸合酶和海藻糖-6-磷酸磷酸酯酶催化，合成途径为：

在大肠杆菌中此二酶构成一个操纵子OtsBA，其中OtsA编码海藻糖-6-磷酸合酶，OtsB编码海藻糖-6-磷酸磷酸酯酶(Kassen等，1992)；而在酿酒酵母中此二酶由三个肽链组成，其中TPS1基因编码海藻糖-6-磷酸合酶、TPS2基因编码海藻糖-6-磷酸磷酸酯酶、TPS3基因编码的旦白有利于酶复合体的聚集(Vuorio等，1992)。

而在担子菌(Basidiomycete)灰树花(Grifola frandosa)中，海藻糖又是由海藻糖合酶(Tsase)催化合成，合成途径为(Saito等，1998)：

到目前为止，国内外已获得几种转海藻糖合酶基因的抗逆转基因植物(如烟草、马铃薯、水稻和高羊茅等)，它们所利用的基因都是来源于细菌的OtsBA或酵母的TPS1基因。从上述不同生物体中海藻糖合成的途径可看出，灰树花中海藻糖合成的途径非常简单，且海藻糖合酶由单基因编码，用编码该酶的基因进行植物的遗传转化，因其表达调控相对简单，转基因植株合成海藻糖的效率会更高一些。

发明内容

本发明的目的是提供一种培育甘蔗抗逆新种质材料的方法，它是利用植物基因工程技术把担子菌灰树花的海藻糖合酶基因通过农杆菌介导法转入甘蔗的胚性细胞中，再通过胚状体成苗途径培育出完整的具有抵抗逆境能力的植株(转基因植株)。

本发明所设计的培育甘蔗抗逆新种质的方法包括：甘蔗胚性愈伤组织的诱导过程、灰树花海藻糖合酶基因的克隆及其植物表达载体的构建和转化农杆菌过程、农杆菌介导海藻糖合酶基因对甘蔗胚性愈伤组织的转化及转基因植株的培育过程、转基因植株抗逆性鉴定和筛选过程。

甘蔗胚性愈伤组织的诱导过程：以优良甘蔗栽培种幼嫩叶片基部为外植体，外植体先用乙醇进行表面消毒后再用氯化汞溶液进行消毒，之后用无菌水进行冲洗并用无菌滤纸吸干其表面的水分，然后将其切成薄片接种于胚性愈伤组织诱导培养基上，于避光条件下进行培养，以诱导胚性愈伤组织的产生。所述诱导培养基是以MS为基础培养基，并添加有2，4-D、蔗糖。

灰树花海藻糖合酶基因的克隆及其植物表达载体的构建和转化农杆菌的过程：从担子菌灰树花(Grifola frondosa)的菌丝体中提取总RNA，并纯化出mRNA，再以mRNA为模板经反转录PCR(RT-PCR)扩增灰树花的海藻糖合酶基因的cDNA并进行测序，所得的片段即为灰树花的海藻糖合酶基因。之后把灰树花的海藻糖合酶基因(TSase gene)取代植物表达载体pBBB-ETR中的ETR基因，得到灰树花海藻糖合酶基因的植物表达载体pBBBT，该基因分别由串联的双拷贝CaMV35S启动子和逆境诱导表达启动子Prd29A驱动。最后采用三亲交配法将其导入农杆菌EHA105中。

农杆菌介导海藻糖合酶基因对甘蔗胚性愈伤组织的转化及转基因植株的培育过程：取含有灰树花海藻糖合酶基因的农杆菌EHA105单菌落接种到含相应抗生素的YEP液体培养基中，振荡培养，通过离心回收菌体，再重悬于等体积含100-300μmol/L AS的MR液体培养基中继续震荡培养，以诱导细菌vir基因表达，此菌液即为转化用工程菌液。之后把处理过的胚性愈伤组织转入农杆菌菌液中，侵染后又用无菌吸水纸吸干菌液，再把胚性愈伤组织接种于MR固体培养基上于黑暗条件下培养，其后将胚性愈伤组织用无菌水冲洗，并用无菌滤纸吸干水份后接种于含抗性选择的分化培养基上，于1500lux12-16h/d光照条件下培养以诱导产生转化的胚状体，其间每两周在相同培养基中继代一次，长出的胚状体又转入抗性分化培养基上于1500lux12-16h/d光照条件下培养以诱导产生抗性小植株。产生的抗性小植株再转接到抗性生根培养基上于1500lux 12-16h/d光照条件下培养以诱导生根并形成转化植株，获得的抗性植株再经过分子检测筛选出转基因植株。所述分化培养基是以MS为基础培养基，并添加有KT、蔗糖、PPT、羧苄青霉素；所述抗性分化培养基是以MS为基础培养基，并添加有BA、KT、蔗糖、PPT、羧苄青霉素；所述MR培养基是以1/5MS大量元素和MS其他成分为基础培养基，并添加有2，4-D、果糖、葡萄糖、蔗糖；所述抗性生根培养基是以MS为基础培养基，并添加有IAA、蔗糖、PPT、头孢霉素。

抗逆材料的鉴定和筛选的过程：把获得的转基因植株及相应的对照盆栽成活后分别在植物生长人工气候箱、大棚温室和大田进行逐级干旱或冷胁迫，观测其生长情况，结合抗逆的生理生化指标(如海藻糖含量、离体叶片保水率、质膜透性、丙二醛含量、光和效率等)的测定，初步筛选出抗逆的转基因植株；对初选的抗逆转基因植株的无性繁殖后代继续进行植物生长人工气候箱、大棚温室和大田逐级干旱或冷胁迫，观测其生长情况，测定抗逆的生理生化指标(同上)再结合其性状的重组分离情况，采用Southern杂交、PCR扩增、Bialaphos或PPT抗性表现等鉴定转基因后代的遗传稳定性，进一步选出抗逆的转基因株系；对优选转基因株系进行干旱或冷胁迫，观测其生长情况，结合抗逆的生理生化指标的测定，并在田间进行工农艺性状鉴定，最终评价转基因植株及其后代的抗逆性，筛选出抗逆的转基因甘蔗新种质。

本发明所提供的培育甘蔗抗逆新种质材料的方法是利用植物基因工程技术把担子菌灰树花的海藻糖合酶基因通过农杆菌介导法转入甘蔗的胚性细胞中，再通过胚状体成苗途径培育出完整的植株(转基因植株)，使转基因植物具有抵抗逆境的能力，并最终提高甘蔗的产量和含糖量。它具有培育周期短、效率高、成本低、不受外界条件影响等优点。

具体实施方式

下面结合实例对本发明进行详细说明。

本发明所设计的一种甘蔗抗逆新种质材料的培育方法，包括甘蔗胚性愈伤组织的诱导过程、灰树花海藻糖合酶基因植物表达载体的构建及转化农杆菌过程、农杆菌介导海藻糖合酶基因对甘蔗胚性愈伤组织的转化及转基因植株的培育过程、抗逆材料的鉴定和筛选过程。

1.甘蔗胚性愈伤组织的诱导过程：以优良甘蔗栽培种的幼嫩叶片基部为外植体，外植体先用75％乙醇进行表面消毒后再用氯化汞溶液进行消毒，之后用无菌水进行冲洗并用无菌滤纸吸干其表面水分，然后将其切成薄片接种于胚性愈伤组织诱导培养基上，于22-28℃避光条件下进行培养，以诱导胚性愈伤组织的产生。所述诱导培养基是以MS为基础培养基，并添加有2，4-D0.8-1.2mg/L、蔗糖25-35g/L，其PH在5.5-6.0之间。

2.灰树花海藻糖合酶基因的克隆及其植物表达载体的构建和转化农杆菌的过程：从担子菌灰树花(Grifola frondosa)的菌丝体中提取总RNA，并纯化出mRNA，再以mRNA为模板经反转录PCR(RT-PCR)扩增灰树花的海藻糖合酶基因的cDNA并进行测序，所得的片段即为灰树花的海藻糖合酶基因，之后把灰树花的海藻糖合酶基因(TSase gene)取代植物表达载体pBBB-ETR中的ETR基因，得到灰树花海藻糖合酶基因的植物表达载体pBBBT，该基因由串联的双拷贝CaMV35S启动子和逆境诱导表达启动子Prd29A驱动，最后采用三亲交配法将其导入农杆菌EHA105中。

3.农杆菌介导海藻糖合酶基因对甘蔗胚性愈伤组织的转化及转基因植株的培育过程：取含有灰树花海藻糖合酶基因的农杆菌EHA105单菌落接种到YEP液体培养基中，于25-28℃，200rpm振荡培养至OD₆₀₀为0.6-1.0后，离心回收细菌体，再重悬于等体积含100-300μmol/L AS的MR液体培养基中继续震荡培养1.5-2.5h，以诱导细菌vir基因表达，此菌液即为转化用工程菌液，之后把胚性愈伤组织转入处理好的农杆菌菌液中，侵染25-35min后又用无菌吸水纸吸干菌液，再把胚性愈伤组织接种于MR固体培养基上于18-22℃黑暗条件下共培养2-6天，其后将胚性愈伤组织用无菌水冲洗，并用无菌滤纸吸干水份后接种于含抗性选择的分化培养基上，于1500lux 12-16h/d光照条件下培养以诱导产生转化的胚状体，其间每10-15天在相同培养基中继代一次，长出的胚状体又转入抗性分化培养基上于1500lux 12-16h/d光照条件下培养以诱导产生抗性小植株。产生的抗性小植株再转接到抗性生根培养基上于1500lux 12-16h/d光照条件下培养以诱导生根并形成转化植株。获得的抗性植株再经过分子检测筛选出转基因植株。所述分化培养基是以MS为基础培养基，并添加有KT1.0-3.0mg/L、蔗糖25-35g/L、PPT 0.5-1.0mg/L、羧苄青霉素300-600mg/L，其PH在5.5-6.0之间；所述抗性分化培养基是以MS为基础培养基，并添加有BA0.5-2.0mg/L、KT 0.2-1.0mg/L、蔗糖25-35g/L、PPT 0.5-1.0mg/L、羧苄青霉素300-600mg/L，其PH在5.5-6.0之间；MR培养基是以1/5MS大量元素和MS其他成分为基础培养基，并添加有2，4-D 0.8-1.2mg/L、果糖8-12mmol/L、葡萄糖8-12mmol/L、蔗糖25-35g/L，其PH在5.0-5.8之间；所述抗性生根培养基是以MS为基础培养基，并添加有IAA0.5-2.0mg/L、PPT0.3-0.7mg/L、头孢霉素200-500mg/L，蔗糖15-25g/L，其PH在5.5-6.0之间。

4.抗逆材料的鉴定和筛选：把获得的转基因植株及相应的对照盆栽成活后分别在植物生长人工气候箱、大棚温室和大田进行逐级干旱或冷胁迫，观测其生长情况，结合抗逆的生理生化指标(如海藻糖含量、离体叶片保水率、质膜透性、丙二醛含量、光和效率等)的测定，初步筛选出抗逆的转基因植株；对初选的抗逆转基因植株的无性繁殖后代继续进行植物生长人工气候箱、大棚温室和大田逐级干旱或冷胁迫，观测其生长情况，测定抗逆的生理生化指标(同上)再结合其性状的重组分离情况，采用Southern杂交、PCR扩增、Bialaphos或PPT抗性表现等鉴定转基因后代的遗传稳定性，进一步选出抗逆的转基因株系；对优选转基因株系进行干旱或冷胁迫，观测其生长情况，结合抗逆生理生化指标的测定，并在田间进行工农艺性状分析，最终评价转基因植株及其后代的抗逆性，筛选出抗逆的转基因甘蔗新种质。

Claims

1、一种甘蔗抗逆新种质材料的培育方法，它包括甘蔗胚性愈伤组织的诱导过程、灰树花海藻糖合酶基因植物表达载体的构建及转化农杆菌过程、农杆菌介导海藻糖合酶基因对甘蔗胚性愈伤组织的转化及转基因植株的培育过程、抗逆材料的鉴定和筛选过程，其特征在于：

(1)所述甘蔗胚性愈伤组织的诱导过程是以优良甘蔗栽培种的幼嫩叶片基部为外植体，外植体先用75％乙醇进行表面消毒后再用氯化汞溶液进行消毒，之后用无菌水进行冲洗并用无菌滤纸吸干其表面水分，然后将其切成薄片接种于胚性愈伤组织诱导培养基上，于22-28℃避光条件下进行培养，以诱导胚性愈伤组织的产生；所述诱导培养基是以MS为基础培养基，并添加有2，4-D0.8-1.2mg/L、蔗糖25-35g/L，其PH在5.5-6.0之间；

(2)所述灰树花海藻糖合酶基因的克隆及其植物表达载体的构建和转化农杆菌的过程是从担子菌灰树花(Grifola frondosa)的菌丝体中提取总RNA，并纯化出mRNA，再以mRNA为模板经反转录PCR(RT-PCR)扩增灰树花的海藻糖合酶基因的cDNA并进行测序，所得的片段即为灰树花的海藻糖合酶基因，之后把灰树花的海藻糖合酶基因(TSase gene)取代植物表达载体pBBB-ETR中的ETR基因，得到灰树花海藻糖合酶基因的植物表达载体pBBBT，该基因由串联的双拷贝CaMV35S启动子和逆境诱导表达启动子Prd29A驱动，最后采用三亲交配法将其导入农杆菌EHA105中；

(3)所述农杆菌介导海藻糖合酶基因对甘蔗胚性愈伤组织的转化及转基因植株的培育是取含有灰树花海藻糖合酶基因的农杆菌EHA105单菌落接种到YEP液体培养基中，于25-28℃，200rpm振荡培养至OD₆₀₀为0.6-1.0后，离心回收细菌体，再重悬于等体积含100-300μmol/L AS的MR液体培养基中继续震荡培养1.5-2.5h，以诱导细菌vir基因表达，此菌液即为转化用工程菌液，之后把胚性愈伤组织转入处理好的农杆菌菌液中，侵染25-35min后又用无菌吸水纸吸干菌液，再把胚性愈伤组织接种于MR固体培养基上于18-22℃黑暗条件下共培养4-6天，其后将胚性愈伤组织用无菌水冲洗，并用无菌滤纸吸干水份后接种于含抗性选择的分化培养基上，于1500lux 12-16h/d光照条件下培养以诱导产生转化的胚状体，其间每10-15天在相同培养基中继代一次，长出的胚状体又转入抗性分化培养基上于1500lux 12-16h/d光照条件下培养以诱导产生抗性小植株，产生的抗性小植株再转接到抗性生根培养基上于1500lux 12-16h/d光照条件下培养以诱导生根并形成转化植株，获得的抗性植株再经过分子检测筛选出转基因植株；所述分化培养基是以MS为基础培养基，并添加有KT1.0-3.0mg/L、蔗糖25-35g/L，PPT 0.5-1.0mg/L、羧苄青霉素300-600mg/L，其PH在5.5-6.0之间；所述抗性分化培养基是以MS为基础培养基，并添加有BA 0.5-2.0mg/L、KT 0.2-1.0mg/L、蔗糖25-35g/L，PPT 0.5-1.0mg/L、羧苄青霉素300-600mg/L，其PH在5.5-6.0之间；MR培养基是以1/5MS大量元素和MS其他成分为基础培养基，并添加有2，4-D 0.8-1.2mg/L、果糖8-12mmol/L、葡萄糖8-12mmol/L、蔗糖25-35g/L，其PH在5.0-5.8之间；所述抗性生根培养基是以MS为基础培养基，并添加有IAA0.5-2.0mg/L、PPT0.3-0.7mg/L、头孢霉素200-500mg/L，蔗糖15-25g/L，其PH在5.5-6.0之间；

(4)所述抗逆材料的鉴定和筛选过程是把获得的转基因植株及相应的对照盆栽成活后分别在植物生长人工气候箱、大棚温室和大田进行逐级干旱或冷胁迫，观测其生长情况，结合抗逆生理生化指标的测定，初步筛选出抗逆的转基因植株；对初选的抗逆转基因植株的无性繁殖后代继续进行植物生长人工气候箱、大棚温室和大田逐级干旱或冷胁迫，观测其生长情况，测定抗逆生理生化指标再结合其性状的重组分离情况，采用Southern杂交、PCR扩增、Bialaphos或PPT抗性表现等鉴定转基因后代的遗传稳定性，进一步选出抗逆的转基因株系；对优选转基因株系进行干旱或冷胁迫，观测其生长情况，结合抗逆生理生化指标的测定，并在田间进行工农艺性状分析，最终评价转基因植株及其后代的抗逆性，筛选出抗逆的转基因甘蔗新种质。