CN116904507A - 基于甘蔗组培苗的遗传转化方法 - Google Patents
基于甘蔗组培苗的遗传转化方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN116904507A CN116904507A CN202311114928.8A CN202311114928A CN116904507A CN 116904507 A CN116904507 A CN 116904507A CN 202311114928 A CN202311114928 A CN 202311114928A CN 116904507 A CN116904507 A CN 116904507A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- sugarcane
- genetic transformation
- tissue culture
- seedlings
- culture seedlings
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 240000000111 Saccharum officinarum Species 0.000 title claims abstract description 60
- 235000007201 Saccharum officinarum Nutrition 0.000 title claims abstract description 59
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 title claims abstract description 44
- 238000011426 transformation method Methods 0.000 title claims abstract description 28
- 230000009466 transformation Effects 0.000 claims abstract description 40
- 241000589158 Agrobacterium Species 0.000 claims abstract description 27
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 22
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 claims abstract description 15
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims abstract description 13
- 239000002689 soil Substances 0.000 claims abstract description 11
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 claims abstract description 10
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 20
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 20
- 238000002347 injection Methods 0.000 claims description 15
- 239000007924 injection Substances 0.000 claims description 15
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 13
- 241001052560 Thallis Species 0.000 claims description 8
- OJOBTAOGJIWAGB-UHFFFAOYSA-N acetosyringone Chemical compound COC1=CC(C(C)=O)=CC(OC)=C1O OJOBTAOGJIWAGB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 claims description 8
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 claims description 8
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 claims description 8
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 claims description 8
- JQXXHWHPUNPDRT-WLSIYKJHSA-N rifampicin Chemical compound O([C@](C1=O)(C)O/C=C/[C@@H]([C@H]([C@@H](OC(C)=O)[C@H](C)[C@H](O)[C@H](C)[C@@H](O)[C@@H](C)\C=C\C=C(C)/C(=O)NC=2C(O)=C3C([O-])=C4C)C)OC)C4=C1C3=C(O)C=2\C=N\N1CC[NH+](C)CC1 JQXXHWHPUNPDRT-WLSIYKJHSA-N 0.000 claims description 8
- 229960001225 rifampicin Drugs 0.000 claims description 8
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 7
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 7
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 6
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 5
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 4
- 101150073246 AGL1 gene Proteins 0.000 claims description 3
- 239000012880 LB liquid culture medium Substances 0.000 claims description 2
- 206010020649 Hyperkeratosis Diseases 0.000 description 14
- 239000000463 material Substances 0.000 description 7
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 4
- 239000006870 ms-medium Substances 0.000 description 4
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 4
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 3
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 3
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 230000000408 embryogenic effect Effects 0.000 description 3
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 3
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 3
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 3
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000589155 Agrobacterium tumefaciens Species 0.000 description 2
- 238000003501 co-culture Methods 0.000 description 2
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 2
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 2
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 2
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 2
- 238000002791 soaking Methods 0.000 description 2
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O Ammonium Chemical compound [NH4+] QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- TWFZGCMQGLPBSX-UHFFFAOYSA-N Carbendazim Natural products C1=CC=C2NC(NC(=O)OC)=NC2=C1 TWFZGCMQGLPBSX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- IAJOBQBIJHVGMQ-UHFFFAOYSA-N Phosphinothricin Natural products CP(O)(=O)CCC(N)C(O)=O IAJOBQBIJHVGMQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000970127 Puccinellia tenuiflora Species 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- JNPZQRQPIHJYNM-UHFFFAOYSA-N carbendazim Chemical compound C1=C[CH]C2=NC(NC(=O)OC)=NC2=C1 JNPZQRQPIHJYNM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000006013 carbendazim Substances 0.000 description 1
- 229960004261 cefotaxime Drugs 0.000 description 1
- GPRBEKHLDVQUJE-VINNURBNSA-N cefotaxime Chemical compound N([C@@H]1C(N2C(=C(COC(C)=O)CS[C@@H]21)C(O)=O)=O)C(=O)/C(=N/OC)C1=CSC(N)=N1 GPRBEKHLDVQUJE-VINNURBNSA-N 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- IAJOBQBIJHVGMQ-BYPYZUCNSA-N glufosinate-P Chemical compound CP(O)(=O)CC[C@H](N)C(O)=O IAJOBQBIJHVGMQ-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 101150054900 gus gene Proteins 0.000 description 1
- 230000009545 invasion Effects 0.000 description 1
- 229960002523 mercuric chloride Drugs 0.000 description 1
- LWJROJCJINYWOX-UHFFFAOYSA-L mercury dichloride Chemical compound Cl[Hg]Cl LWJROJCJINYWOX-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 239000003895 organic fertilizer Substances 0.000 description 1
- 239000012188 paraffin wax Substances 0.000 description 1
- 238000004382 potting Methods 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 239000012883 rooting culture medium Substances 0.000 description 1
- 239000012882 rooting medium Substances 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 1
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 1
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- HOWHQWFXSLOJEF-MGZLOUMQSA-N systemin Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)OC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)[C@H]1N(C(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H]2N(CCC2)C(=O)[C@H]2N(CCC2)C(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](C)N)C(C)C)CCC1 HOWHQWFXSLOJEF-MGZLOUMQSA-N 0.000 description 1
- 108010050014 systemin Proteins 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
- C12N15/8202—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation by biological means, e.g. cell mediated or natural vector
- C12N15/8205—Agrobacterium mediated transformation
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
- A01H4/00—Plant reproduction by tissue culture techniques ; Tissue culture techniques therefor
- A01H4/005—Methods for micropropagation; Vegetative plant propagation using cell or tissue culture techniques
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Botany (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
Abstract
本发明公开了一种基于甘蔗组培苗的遗传转化方法，其包括以下步骤：在生根的甘蔗组培苗的基部注射携带有质粒的农杆菌侵染液后，再种植于土壤中。本发明的方法，操作更加简便，缩短了得到阳性植株的时间；且整个过程无需在无菌环境下进行，也避免了转化后容易组培污染等问题。
Description
技术领域
本发明属于农业技术领域，更具体地，本发明涉及一种基于甘蔗组培苗的遗传转化方法、以及通过所述遗传转化方法得到的甘蔗遗传转化苗。
背景技术
目前甘蔗遗传转化方法，主要有腋芽直接注射转化法和以愈伤组织为转化材料的农杆菌介导的遗传方法。
其中，腋芽直接注射转化法的具体步骤如下(参考文献Nayyar S等.2017)：
1、材料准备
选取10个月大健康甘蔗(印度品种CoJ 83)，将茎段切成小段为2～3cm，每个小枝携带一个腋芽，用1％多菌灵浸泡在振荡器中振荡10min，然后用蒸馏水洗涤两次；再用0.1％氯化汞消毒10分钟，最后用蒸馏水洗三次，该步骤在超净台中进行。
2、农杆菌悬液制备
将单克隆菌株置于LB中，在摇床上以28℃，100rpm生长，通过OD600测得值为1.0～1.2cfu/mL时，以500rpm离心，收集菌液。再悬浮于液体MS培养基(30mL，pH5.8)并添加乙酰丁香酮(9.8mg/l)，用于甘蔗植物遗传转化。
3、植物转化
用无菌针头随机刺入每个已消毒的腋芽(深度1mm)5次。将6个携带刺扎腋芽(PABs)的小枝置于无菌烧杯(1000mL)中，浸泡在稀释的农杆菌悬液(600mL，30mL悬浮液+570mL MS培养基中)。在28℃下浸泡5小时，用无菌滤纸吸干，在基础MS培养基上28℃共培养72小时。随后共培养的PABs在含有头孢噻污的无菌水中洗涤20min，吸干，播种在土里(土壤：有机肥＝3:1)，芽朝上，然后在转基因盆中孵育。夏季每天浇水两次，冬季每天浇水一次。将3个月大的T0植株转移到含有盆栽混合物的陶罐中并长至成熟。
腋芽直接注射转化法容易污染，腋芽在注射后容易坏死，转化率极低。
以愈伤组织为转化材料的农杆菌介导的遗传方法参考文献(Zhang,Y等.Establishment of an efficient Agrobacterium-mediated genetic transformationsystemin halophyte Puccinellia tenuiflora.Mol Breeding 41,55(2021).https://doi.org/10.1007/s11032-021-01247-8)，具体步骤如下：
1、农杆菌悬液制备
携带目的植物表达载体的农杆菌菌株在含有100μM AS和适当抗生素的YEP培养基上划线，并在28℃下生长3d。然后，挑取单克隆在含有适当的抗生素和100μMAS的液体YEP培养基中过夜。随后，离心，收集细菌，重悬于培养液(1/5浓度MS培养基+30g/L蔗糖+30g/L葡萄糖+100μMAS)，并在黑暗中，在28℃的条件下，转速为90～100转，时间为2小时。然后，将菌液稀释至OD600为0.3～0.6。
2、植物转化
将甘蔗(ROC22)胚性愈伤组织(3～5g)在超净工作台上干燥。将风干的胚性愈伤组织转移到锥形瓶中，加入约50mL的农杆菌侵染液，摇匀。在黑暗中，28℃下，以90～100rpm的转速缓慢摇晃10分钟。然后，在超声波清洗器中超声(180W)2分钟。随后，用移液枪将农杆菌侵染液吸取干净，再加入50mL新鲜的农杆菌侵染液。随后，将浸泡在农杆菌侵染液中的愈伤组织抽真空(-0.08MPa)5分钟，拿出后继续在28℃黑暗条件下，以90～100rpm的转速缓慢摇动10分钟。然后，用移液枪将三角瓶中的农杆菌侵染液吸取干净，将愈伤组织置于灭菌后的滤纸上，在超净工作台中干燥约30分钟。接下来，将在愈伤组织转移到空培养皿中，用石蜡薄膜密封，然后在21℃黑暗中培养3d。然后，将转化后的愈伤组织转移到无选择胁迫的培养基中共培养7d，28℃黑暗条件。
3、筛选
将所有的胚性愈伤组织转移到含有2mg/LBasta(草铵膦铵)的选择培养基中，在28℃黑暗培养30天。将筛选出的愈伤组织转移到再生培养基上。黑暗培养14天(30℃光照14小时，28℃光照10小时)。再生后，将绿芽转移到生根培养基中，并在相同的条件下培养。
以愈伤组织为转化材料的农杆菌介导的遗传方法使用的转化材料为甘蔗愈伤组织，而甘蔗愈伤组织诱导过程需要在严苛的无菌条件下进行，极易褐化，因此不易获得愈伤组织，且诱导获得愈伤组织需要经过共培养、转培养基、再分化等过程，耗时长；转化过程也需要在无菌条件下进行，存在转化后污染的问题。
因此，寻求一种操作简单、快速、转化率高、苗存活率高的甘蔗遗传转化方法非常有意义。
发明内容
基于此，本发明的目的在于提供一种基于甘蔗组培苗的遗传转化方法及其遗传转化苗。
实现上述发明目的的技术方案包括如下。
本发明的第一方面，提供了一种基于甘蔗组培苗的遗传转化方法，包括以下步骤：在生根的甘蔗组培苗的基部注射携带有质粒的农杆菌侵染液后，再种植于土壤中。
本发明的第二方面，提供了上述遗传转化方法得到的甘蔗遗传转化苗。
本发明的基于甘蔗组培苗的遗传转化方法，是利用农杆菌注射转化法直接将侵染液注射到甘蔗组培苗(快繁苗)的基部，再直接移栽至土壤中而实现的。本发明的方法，操作更加简便，缩短了得到阳性植株的时间，转化效率更高，苗的存活率也更高；且整个过程无需在无菌环境下进行，也避免了转化后容易组培污染等问题。
附图说明
图1为本发明实施例1中生根的甘蔗组培苗示意图。
图2为本发明实施例1中注射农杆菌侵染液的示意图。
图3为本发明实施例1中注射农杆菌侵染液后种植于土壤中60天后的甘蔗遗传转化苗。
图4为本发明实施例2中对甘蔗遗传转化苗进行GUS染色的结果。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明公开内容的理解更加透彻全面。
除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本发明。本发明所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Green和Sambrook等人，分子克隆实验指南(Molecular Cloning:A Laboratory Manual,2013)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。
本发明的基于甘蔗组培苗的遗传转化方法，是利用农杆菌注射转化法直接将侵染液注射到甘蔗组培苗(快繁苗)的基部，再直接移栽至土壤中而实现的。相较于传统的腋芽直接注射转化法和以愈伤组织为转化材料的甘蔗遗传转化方法，本发明的方法利用甘蔗组培苗为转化材料(已商业化，可以直接购买，省时省力)，不需要经过共培养、洗菌、再分化等步骤，操作更加简便，缩短了得到阳性植株的时间(1～2个月即可)，转化效率和苗的存活率也得到了大大提高；整个过程无需在无菌环境下进行，无需考虑愈伤组织诱导中的污染，同时也避免了转化后容易组培污染等问题。
在本发明的其中一些实施例中，公开了一种基于甘蔗组培苗的遗传转化方法，包括以下步骤：在生根的甘蔗组培苗的基部注射携带有质粒的农杆菌侵染液后，再种植于土壤中。
在其中一些实施例中，所述质粒为植物双元载体，优选为pCAMBIA1305.1。
在其中一些实施例中，所述农杆菌为AGL1。
在其中一些实施例中，所述注射的注射量为2～5mL/株。
在其中一些实施例中，所述种植的时间为30～70天。
在其中一些实施例中，所述种植的时间为50～60天。
在其中一些实施例中，所述携带有质粒的农杆菌侵染液的制备方法包括以下步骤：
(1)、将所述质粒导入所述农杆菌中后，挑单克隆于含卡那霉素和利福平的LB液体培养基中，过夜培养得一级菌；
(2)、取一级菌，于含卡那霉素和利福平的LB液体培养基中，过夜培养；
(3)、当菌液OD600值在0.4～0.6之间时，离心弃上清，收集菌体；
(4)、用1/4MS溶液重悬菌体，离心弃上清；
(5)、重复步骤(4)2次～3次；
(6)、用1/4MS溶液重悬菌体，加入乙酰丁香酮和SiLwet-77，黑暗孵育3～4h。
在其中一些实施例中，步骤(1)和步骤(2)中，所述卡那霉素和利福平的浓度均为45～55mg/L。
在其中一些实施例中，步骤(1)中所述LB液体培养基为5mL，步骤(2)中所述LB液体培养基为10mL。
在本发明的另一些实施例中，公开了上述基于甘蔗组培苗的遗传转化方法得到的甘蔗遗传转化苗。
以下结合附图和具体实施例来详细说明本发明。
实施例1基于甘蔗组培苗的遗传转化方法
本实施例提供的基于甘蔗组培苗的遗传转化方法，包括以下步骤：
1、农杆菌转化
用农杆菌转化法将pCAMBIA1305.1质粒(市售)导入农杆菌AGL1(市售)中；
2、制备农杆菌浸染液
(1)、挑单克隆于5mL LB，加入含5μL 50mg/L的卡那霉素抗生素和5μL 50mg/L利福平抗生素，28℃过夜培养；
(2)、取100μL一级菌，置于含10μL 50mg/L的卡那霉素抗生素和10μL 50mg/L利福平抗生素的10mL LB液体培养基中，28℃过夜培养；
(3)、当菌液OD600值在0.4～0.6之间时，5000xg离心5min收集菌体；
(4)、弃上清，用10mL灭菌后的1/4MS溶液重悬菌体，5000xg离心5min，弃上清，重复洗菌2次；
(5)、弃上清，用10mL灭菌后的1/4MS溶液重悬菌体，加入20μL 100mM的乙酰丁香酮，1μL SiLwet-77，在黑暗条件下孵育3～4h。
3、农杆菌侵染液注射转化
小心清洗生根的甘蔗组培苗(图1)根间的培养基，使用1mL无菌注射器从甘蔗组培苗基部注射农杆菌侵染液，每株的注射量为3mL(图2)，注射后直接种植于土壤中60天(图3)，即得甘蔗遗传转化苗。
实施例2甘蔗遗传转化苗的转化效果验证
采用实施例1的方法，对15株甘蔗组培苗的基部注射农杆菌侵染液。注射后直接种植于土壤中60天后，对甘蔗遗传转化苗进行GUS染色，观察甘蔗遗传转化苗的基部叶卷、根和叶片的染色情况(未转入pCAMBIA1305.1质粒的甘蔗苗作为CK对照)，结果如图4所示。
从图4结果可知，与CK对照相比，15株甘蔗遗传转化苗(即转入了pCAMBIA1305.1质粒的小苗)的基部叶卷、根和叶片均能被GUS染液染成蓝色，表明GUS基因在这些甘蔗遗传转化苗中表达，转化率为100％。本实施例的结果表明：本发明的基于快繁苗的甘蔗遗传转化方法可以成功介导外源基因在甘蔗快繁苗中的表达。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (10)
1.一种基于甘蔗组培苗的遗传转化方法，其特征在于，包括以下步骤：在生根的甘蔗组培苗的基部注射携带有质粒的农杆菌侵染液后，再种植于土壤中。
2.根据权利要求1所述的基于甘蔗组培苗的遗传转化方法，其特征在于，所述注射的注射量为2～5mL/株。
3.根据权利要求1所述的基于甘蔗组培苗的遗传转化方法，其特征在于，所述质粒为pCAMBIA1305.1。
4.根据权利要求1所述的基于甘蔗组培苗的遗传转化方法，其特征在于，所述农杆菌为AGL1。
5.根据权利要求1～4任一项所述的基于甘蔗组培苗的遗传转化方法，其特征在于，所述种植的时间为30～70天。
6.根据权利要求5所述的基于甘蔗组培苗的遗传转化方法，其特征在于，所述种植的时间为50～60天。
7.根据权利要求1～4任一项所述的基于甘蔗组培苗的遗传转化方法，其特征在于，所述携带有质粒的农杆菌侵染液的制备方法包括以下步骤：
(1)、将所述质粒导入所述农杆菌中后，挑单克隆于含卡那霉素和利福平的LB液体培养基中，过夜培养得一级菌；
(2)、取一级菌，于含卡那霉素和利福平的LB液体培养基中，过夜培养；
(3)、当菌液OD600值在0.4～0.6之间时，离心弃上清，收集菌体；
(4)、用1/4MS溶液重悬菌体，离心弃上清；
(5)、重复步骤(4)2次～3次；
(6)、用1/4MS溶液重悬菌体，加入乙酰丁香酮和SiLwet-77，黑暗孵育3～4h。
8.根据权利要求7所述的基于甘蔗组培苗的遗传转化方法，其特征在于，步骤(1)和步骤(2)中，所述卡那霉素和利福平的浓度均为45～55mg/L。
9.根据权利要求7所述的基于甘蔗组培苗的遗传转化方法，其特征在于，步骤(1)中所述LB液体培养基为5mL，步骤(2)中所述LB液体培养基为10mL。
10.权利要求1～9任一项所述的基于甘蔗组培苗的遗传转化方法得到的甘蔗遗传转化苗。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202311114928.8A CN116904507B (zh) | 2023-08-31 | 2023-08-31 | 基于甘蔗组培苗的遗传转化方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202311114928.8A CN116904507B (zh) | 2023-08-31 | 2023-08-31 | 基于甘蔗组培苗的遗传转化方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN116904507A true CN116904507A (zh) | 2023-10-20 |
| CN116904507B CN116904507B (zh) | 2024-02-13 |
Family
ID=88351356
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202311114928.8A Active CN116904507B (zh) | 2023-08-31 | 2023-08-31 | 基于甘蔗组培苗的遗传转化方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN116904507B (zh) |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1644026A (zh) * | 2005-01-19 | 2005-07-27 | 中国热带农业科学院热带生物技术研究所 | 一种甘蔗抗逆新种质材料的培育方法 |
| CN103740751A (zh) * | 2013-12-19 | 2014-04-23 | 广东省农业科学院作物研究所 | 一种农杆菌介导的甘蔗转基因方法 |
| US20160168534A1 (en) * | 2014-12-12 | 2016-06-16 | Syngenta Participations Ag | Methods of Embryogenic Tissue Preparation for Sugar Cane Transformation |
-
2023
- 2023-08-31 CN CN202311114928.8A patent/CN116904507B/zh active Active
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1644026A (zh) * | 2005-01-19 | 2005-07-27 | 中国热带农业科学院热带生物技术研究所 | 一种甘蔗抗逆新种质材料的培育方法 |
| CN103740751A (zh) * | 2013-12-19 | 2014-04-23 | 广东省农业科学院作物研究所 | 一种农杆菌介导的甘蔗转基因方法 |
| US20160168534A1 (en) * | 2014-12-12 | 2016-06-16 | Syngenta Participations Ag | Methods of Embryogenic Tissue Preparation for Sugar Cane Transformation |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| D. E. CURSI等: "History and Current Status of Sugarcane Breeding, Germplasm Development and Molecular Genetics in Brazil", 《SUGAR TECH》, vol. 24, no. 1, pages 112 - 133, XP037668116, DOI: 10.1007/s12355-021-00951-1 * |
| 罗素兰等: "甘蔗遗传转化研究进展", 《生物技术通报》, no. 2, pages 9 - 13 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN116904507B (zh) | 2024-02-13 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN101948867B (zh) | 一种农杆菌介导的小油桐基因转化方法 | |
| CN109652444B (zh) | 发根农杆菌介导的桃根系稳定转化方法及其应用 | |
| CN115418372B (zh) | 一种非组培依赖的发根农杆菌介导闽楠遗传转化方法 | |
| CN113322274B (zh) | 一种快速实现甘薯转基因的方法 | |
| CN112544440A (zh) | 块根植物的转基因或基因编辑新苗的培育方法 | |
| CN113604498B (zh) | 一种柱花草毛状根诱导方法 | |
| CN117660521A (zh) | 一种快速高效诱导棉花转基因毛状根的转化方法 | |
| CN116904507B (zh) | 基于甘蔗组培苗的遗传转化方法 | |
| CN105132457A (zh) | 一种快速遗传转化苜蓿的方法 | |
| CN105063086A (zh) | 一种快速获得大量转基因佛甲草新品种的分子育种方法 | |
| CN106811482B (zh) | 三色堇种子浸泡法直接导入外源基因的遗传转化方法 | |
| CN110305894B (zh) | 一种快速高效的楸遗传转化方法 | |
| CN106755084A (zh) | 一种茶树快速转基因方法 | |
| CN103340180A (zh) | 一种通过转化大豆毛状根鉴定抗蚜基因抗性功能的方法 | |
| CN103740751B (zh) | 一种农杆菌介导的甘蔗转基因方法 | |
| CN113652446B (zh) | 一种发根农杆菌介导的中间锦鸡儿毛状根一步转化方法 | |
| CN102002512A (zh) | 一种大豆遗传转化方法 | |
| CN113234750B (zh) | 快速获得以菘蓝转基因根为外植体的转基因植株的方法 | |
| CN115710587A (zh) | 基于根癌农杆菌真空渗透介导的桑树离体瞬时转化方法 | |
| CN113430222A (zh) | 一种基于发根农杆菌介导的桉树转基因方法 | |
| CN103146748A (zh) | 农杆菌介导的侵染月季芽点转基因的方法 | |
| CN109880847B (zh) | 一种高效的高山离子芥转基因植株的制备方法 | |
| CN113215191A (zh) | 农杆菌介导的红椿遗传转化方法 | |
| CN110885852A (zh) | 一种高效诱导瓠瓜转基因发状根形成的方法 | |
| CN117844849B (zh) | 一种蒙古冰草的遗传转化方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |