CN113430222A - 一种基于发根农杆菌介导的桉树转基因方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种基于发根农杆菌介导的桉树转基因方法，包括以下步骤：S1、无菌桉树增殖芽苗的准备，S2、发根农杆菌的活化和培养，S3、外植体的浸染，S4、共培养，S5、发根诱导和培养，S6、组织化学或荧光检测，S7、PCR检测。有益效果是：利用含35S:GUS报告基因的发根农杆菌Ar1193菌液浸染尾巨桉无菌芽苗，获得根部转化的嵌合体转基因植株，不仅可以大大缩短转化周期，实验结果也比较直观，且能够长期稳定表达；桉树离体毛状根体系为桉树基因功能验证提供了一种快速可靠的方法，同时可以为在根部特异表达的高效营养利用和抗病的转基因桉树新品种的获得奠定基础。

Description

一种基于发根农杆菌介导的桉树转基因方法

技术领域

本发明涉及转基因技术领域，尤其涉及一种基于发根农杆菌介导的桉树转基因方法。

背景技术

桉树是桃金娘科桉树属的总称，原产于澳大利亚及其附近岛屿，目前是我国华南地区第一大造林树种，对于天然林保护、国家木材安全和森林碳汇增加等方面起到重要的作用。种植面积超过450万公顷，占全国年木材产量的26.9%。目前面临尺蛾等虫害、除草成本大等常规育种难以解决的问题。利用转基因技术培育抗病虫、抗除草剂等桉树转基因新品系，解决桉树的尺蛾、青枯病危害、严重冻害等问题的关键方法，对于解决我国木材供应具有重大意义。早期在赤桉、蓝桉、尾巨桉等桉树品种开展了转基因方法开展研究，仅获得转化愈伤组织或少量小苗(Girijashankar 2011)。但都存在着再生困难、转化效率低等问题。部分获得转基因植株或者品系，但存在着转化周期长，效率低等问题。近期在多种植物中以完整植株注射诱导等方式进行发根农杆菌诱导根系的遗传转化研究(Meng et al.2019)，在桉树中也开展了类似研究，但仍然存在着有性材料如下胚轴或者无法大批量开展研究等问题(Plasencia et al. 2016)。同时巨桉基因组测序已经完成，且已进行基因注释(Myburg et al. 2014)，这对挖掘桉树材性、生长等重要性状基因的挖掘具有重要意义。目前缺乏一套稳定高效的转基因体系，能够快速的进行外源基因的转化和功能验证。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术存在的以上问题，提供一种基于发根农杆菌介导的桉树转基因方法。

为实现上述技术目的，达到上述技术效果，本发明通过以下技术方案实现：

一种基于发根农杆菌介导的桉树转基因方法，包括以下步骤：

S1、无菌桉树增殖芽苗的准备，选择高度为2-3cm生长健壮的无菌桉树增殖芽苗，在超净工作台切下，将芽苗泡在装有无菌水的培养皿中待用；

S2、发根农杆菌的活化和培养，挑取带有35S: :GUS报告基因的发根农杆菌的菌液，在含有硫酸链霉素和卡那霉素的TY固体培养基上划平板，挑取单菌落，摇菌培养后重悬浮培养；

S3、浸染外植体，将无菌桉树增殖芽苗的茎基部在重悬菌液中浸染30mins；

S4、共培养，将浸染后的无菌桉树增殖芽苗插入到湿润的海绵中，使用无菌水喷施，无菌桉树增殖芽苗黑暗培养2天；

S5、发根诱导和培养，将插在海绵中的无菌桉树增殖芽苗转移后，在16h/8h光周期下培养30天，定期喷水和查看；

S6、GUS染色检测，将毛状根用GUS染色液浸染，使用LUYOR-3415RG手持式荧光观测仪和体视荧光显微镜进行观测；

S7、PCR检测，提取发状根的基因组DNA，进行目的基因的扩增。

其中，所述步骤S1中无菌桉树增殖芽苗为尾巨桉优良无性系芽苗。

其中，所述步骤S2中使用Bio-rad电激转化仪将含有35S: :GUS报告基因的载体pB1121质粒转入Ar1193的发根农杆菌感受态细胞。

其中，所述步骤S3中发根农杆菌重悬浮液的OD600值为0.5~0.7。

其中，所述步骤S4中在桉树增殖芽苗上放置在培养盆中培养，培养温度为24~25℃。

其中，所述步骤S5中桉树增殖芽苗在培养盆中培养，22~25℃的培养温度下光照培养16h、暗培养8h，每隔2天使用无菌水喷施叶面保湿，每周更换一次无菌水。

其中，所述步骤S6中将毛状根用GUS染色液浸染具体包括：将诱导的毛状根从培养盆中取出，用无菌水清洗后使用吸水纸将毛状根表面水吸干，然后放入玻璃瓶或培养管中，做好标记，加入GUS染色液，以刚好浸没毛状根为准，然后放置在恒温箱中，37℃暗处理12～24个小时后取出，使用无水乙醇清洗一次，然后换新鲜无水乙醇浸泡12小时后更换一次。

其中，所述步骤S7中目的基因的扩增具体包括采用rolA引物、rolB引物和GUS引物进行PCR 扩增。

本发明的有益效果是：利用含35S:: GUS报告基因的发根农杆菌Ar1193菌液浸染尾巨桉无菌芽苗，获得根部转化的嵌合体转基因植株，不仅可以大大缩短转化周期，实验结果也比较直观，且能够长期稳定表达；桉树离体毛状根体系为桉树基因功能验证提供了一种快速可靠的方法，同时可以为在根部特异表达的高效营养利用和抗病的转基因桉树新品种的获得奠定基础。

附图说明

此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本申请的一部分，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：

图1是本发明实施例中发根农杆菌介导的桉树转基因流程图；

图2是本发明实施例中不同处理对发根诱导和转化率的影响的条形图；

图3为本发明实施例中发根农杆菌介导的桉树毛状根诱导的转化流程图；

图4是本发明实施例中转基因根系的GUS染色结果图；

图5转基因毛状根的PCR检测结果图；

附图说明：图3中，N为正常根，C为对照毛根，T为GUS转基因毛根；

图4中 A 、未转化毛根根尖；B、未转化毛根伸长区；C、转化毛根根尖；D、转化毛根伸长区。

图5中：M代表Marker, 为D2000的marker；+代表质粒正对照；-代表野生型生根植株负对照；数字代表不同的株系的毛状根。

具体实施方式

下面将参考附图并结合实施例，来详细说明本发明。

如图1所示，一种基于发根农杆菌介导的桉树转基因方法，包括以下步骤：

S1、无菌桉树增殖芽苗的准备：

采用尾巨桉优良无性系3229芽苗和巨桉GL1芽苗，对桉树苗进行消毒、繁殖，每隔20天转接一次，培养室温度为 22-25℃，3000LUX光照强度，16h/8h光周期培养。在增殖培养基（mMS+0.50mg/L 6BA+ 0.1mg/L NAA）培养15-20天，选取高度为2-3cm生长健壮的芽苗，在超净工作台切下，将芽苗泡在装有无菌水的培养皿中待用。

S2、发根农杆菌的活化和培养：

材料，含有35S::GUS的载体pBI121质粒由课题组保存，含有35S::eGFP的载体Pvct2113质粒由西南大学张兴国课题组馈赠（基因序列SEQ No.1所示），Ar1193、K599、MSU440、Ar. Qual、C58C1的发根农杆菌感受态细胞购买自上海唯地生物公司(详见表1)。

发根农杆菌的培养：使用Bio-rad电激转化仪分别将pBI121或pVCT2113质粒转入Ar1193、K599、MSU440、Ar. Qual、C58C1的发根农杆菌感受态细胞，加入500微升的无抗生素TY，在28℃、200rpm培养条件下震荡培养2-3小时，然后6000rpm离心1分钟收集菌液，留取100微升上清轻轻吹打混匀后涂布于带有50mg/L硫酸链霉素（Str）和50mg/L卡那霉素(Kan)的TY固体培养基上，28℃倒置培养2-3天，挑取单菌落，转移到50mg/L硫酸链霉素和50mg/L卡那霉素抗生素的TY液体培养基离心管中震荡培养，28℃、200rpm震荡培养24-48小时；取摇好的菌液与30%甘油等体积混匀，使用液氮速冻后放入-80度冰箱保存待用。

发根农杆菌的活化：取出保存的发根农杆菌Ar1193、K599、MSU440、Ar. Qual、C58C1菌液，在含有50mg/L硫酸链霉素（Str）和50mg/L卡那霉素(Kan)的TY固体培养基划平板，28度倒置培养48h，挑取单菌落，转移到带有抗生素的TY液体培养基中震荡培养，180rpm，28℃恒温培养12–14 h，OD600值为0.1、0.3、0.5、0.7、0.9时各取出一部分。

浸染菌液的准备：将培养的菌液常温或4℃离心5000rpm，然后加入等体积带有100μM的乙酰丁香酮的MES缓冲液重悬浮，将重悬菌液加入到96孔的细胞培养板中，每孔加入重悬菌液200-300μL。

S3、浸染外植体；

将切好的2-3cm的无菌桉树增殖芽苗直接放入细胞培养板中，将茎基部浸入到发根农杆菌Ar1193、K599、MSU440、Ar. Qual、C58C1重悬浮菌液中，以缓冲液为对照。通过浸染后毛状根诱导分析发现，未浸染芽苗几乎不能诱导形成毛状根，偶尔个别能够自发长出不定根，不定根较粗且短与毛状根有明显的差异。不同类型的发根农杆菌菌株的诱导发根的效率具有显著差异，其中Ar1193和Ar. Qual浸染后获得了较高的毛状根诱导率，分别达到37.88%±2.53%和39.39%±9.09%。由于菌株Ar1193诱导毛状根较长，且状态较好，且其本身摇菌速度较快，因此在后期的实验中以菌株Ar1193进行桉树发根农杆菌转化。将芽苗分别浸泡在OD600值为0.1、0.3、0.5、0.7、0.9的农杆菌菌液中处理，浸泡30mins，不同的泡菌时间处理并不能显著的影响毛状根的诱导和转化，但在OD600吸收值在0.5和0.7时获得了较高的毛状根诱导率，因此认为在OD600在0.5-0.7时进行浸染的毛状根诱导率高。同时进一步通过将芽苗浸泡在细胞培养板中15mins、30mins、45mins、60mins、75mins；每隔2-3分钟轻轻摇晃一次，结果表明不同的处理时间并不能显著的影响毛状根的诱导和再生，为了防止发根农杆菌过度的生长同时获得相对高的转化效率，因此采用30mins进行浸染(Dai etal. 2020)。不同浸染处理对发根诱导和转化率影响结果如图2所示。

S4、共培养；

取出浸染后的芽苗，使用镊子将芽苗插入到使用无菌水湿润的海绵中，将海绵放入培养盆中，培养盆中加入0.5L无菌水，盖上盖子，24-25℃，黑暗培养2天。

S5、发根诱导和培养；

将共培养后的芽苗转移到22℃- 25℃温度环境中光照16小时、暗培养8h，每隔2天使用无菌水喷施使叶面保湿，每周更换一次无菌水，定期查看，培养30天后观察。结果发现大量毛状根的形成，最高有39.39%，参照图3

S6、GUS染色检测：

其中未转化芽苗无法诱导出新的根系（偶尔出现短粗的根，可与毛状根明显区分），逐渐枯萎，转化植株可以看到诱导出的发根。利用gusA（uidA）的产物葡萄糖醛酸糖苷酸酶切割底物（X-gluc）中的葡糖醛酸产生无色吲哚氧基，进一步氧化形成不溶的蓝色沉淀的原理进行组织化学检测分析桉树中诱导的毛状根中gusA (uidA)融合基因的表达。

具体流程为，将诱导的毛状根从培养盆中取出，用无菌水清洗后使用吸水纸将毛状根表面水吸干，然后放入玻璃瓶或培养管中，做好标记，加入GUS染色液，以刚好浸没毛状根为准，然后放置在恒温箱中，37℃暗处理12～24个小时后取出，使用无水乙醇清洗一次，然后换新鲜无水乙醇浸泡12小时后更换一次。同时将植物材料放到立体显微镜下观察。结果表明：使用携带pBI121质粒 （35S: :GUS）Ar1193菌株浸染的植株主根和侧根都呈现出蓝色，尤其是在幼嫩的根部位蓝色更为明显，而直接使用Ar1193菌株浸染的对照植株可以诱导出毛状根，但未呈现出蓝色，说明GUS基因（（基因序列SEQ No.2所示））已经整合到毛状根中，转化效率达到22.2%。转基因根系的GUS染色结果如图4所示。

同时采用携带有35S: :eGFP基因的Ar1193菌株进行毛状根诱导转化，使用LUYOR-3415RG手持式荧光观测仪对转化植株的根进行观测，看到荧光后转移到体视荧光显微镜对共转化植株进一步进行荧光确认，结果表明：转 35S: :eGFP植株根系可见整条根均有较强绿色荧光，并且在继续在培养盆中培养3个月后仍能够在根尖观察到绿色荧光，转化率为34.4%。

S7、PCR检测：

提取发状根的基因组DNA，采用rolA（（基因序列SEQ No.3所示））、rolB （（基因序列SEQ No.4所示））引物进行PCR 扩增，详细引物见表2。参照图5，结果表明：诱导获得的桉树根系rolA、rolB基因都能扩增出条带，说明这些都为发根农杆菌诱导的毛状根。在此基因上使用GUS引物进行进一步PCR分析，证实GUS基因已经稳定的整合到桉树毛状根中。

同时对转化的pVCT2113的质粒进行eGFP基因的扩增，得到的875bp的eGFP基因片段，证明外源eGFP基因整合到桉树诱导根的基因组中。分别从基因和蛋白水平证明，通过发根农杆菌介导引入诱导根的外源基因能整合到基因组中，并能表达为有活性的蛋白，用该体系将目的基因转入桉树根系中是快速可行的。

表1 发根农杆菌菌株类型及抗性

农杆菌菌株	冠瘿碱类型	抗性标记
			MSU440	农杆碱型	链霉素
Ar.Qual	农杆碱型	链霉素
			C58C1	农杆碱型	链霉素
K599	黄瓜碱型	链霉素
			Ar1193	农杆碱型	链霉素

表2转基因毛状根PCR检测引物

引物	序列（5’-3’）	产物长度
			rolA-FP	AGCGTTCGGACAGCCACCA	519bp
rolA-RP	GGCGTGGAAATGAATCGAAGAC
			rolB-FP	GCTCTTGCAGTGCTAGATTT	423bp
rolB-RP	GAAGGTGCAAGCTACCTCTC
			GUS-FP	ACTCAGCAAGCGCACTTACAGG	496bp
GUS-RP	TCCATACCTGTTCACCGACGAC
			eGFP-FP	GAGCAAGGGCGAGGAGCTG	875bp
eGFP-RP	ATCGCAAGACCGGCAACAGG

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。

序列表

<110> 中国林业科学研究院热带林业研究所

<120> 一种基于发根农杆菌介导的桉树转基因方法

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 720

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atggtgagca agggcgagga gctgttcacc ggggtggtgc ccatcctggt cgagctggac 60

ggcgacgtaa acggccacaa gttcagcgtg tccggcgagg gcgagggcga tgccacctac 120

ggcaagctga ccctgaagtt catctgcacc accggcaagc tgcccgtgcc ctggcccacc 180

ctcgtgacca ccctgaccta cggcgtgcag tgcttcagcc gctaccccga ccacatgaag 240

cagcacgact tcttcaagtc cgccatgccc gaaggctacg tccaggagcg caccatcttc 300

ttcaaggacg acggcaacta caagacccgc gccgaggtga agttcgaggg cgacaccctg 360

gtgaaccgca tcgagctgaa gggcatcgac ttcaaggagg acggcaacat cctggggcac 420

aagctggagt acaactacaa cagccacaac gtctatatca tggccgacaa gcagaagaac 480

ggcatcaagg tgaacttcaa gatccgccac aacatcgagg acggcagcgt gcagctcgcc 540

gaccactacc agcagaacac ccccatcggc gacggccccg tgctgctgcc cgacaaccac 600

tacctgagca cccagtccgc cctgagcaaa gaccccaacg agaagcgcga tcacatggtc 660

ctgctggagt tcgtgaccgc cgccgggatc actctcggca tggacgagct gtacaagtaa 720

<210> 2

<211> 1812

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atgttacgtc ctgtagaaac cccaacccgt gaaatcaaaa aactcgacgg cctgtgggca 60

ttcagtctgg atcgcgaaaa ctgtggaatt gatcagcgtt ggtgggaaag cgcgttacaa 120

gaaagccggg caattgctgt gccaggcagt tttaacgatc agttcgccga tgcagatatt 180

cgtaattatg cgggcaacgt ctggtatcag cgcgaagtct ttataccgaa aggttgggca 240

ggccagcgta tcgtgctgcg tttcgatgcg gtcactcatt acggcaaagt gtgggtcaat 300

aatcaggaag tgatggagca tcagggcggc tatacgccat ttgaagccga tgtcacgccg 360

tatgttattg ccgggaaaag tgtacgtatc accgtttgtg tgaacaacga actgaactgg 420

cagactatcc cgccgggaat ggtgattacc gacgaaaacg gcaagaaaaa gcagtcttac 480

ttccatgatt tctttaacta tgccggaatc catcgcagcg taatgctcta caccacgccg 540

aacacctggg tggacgatat caccgtggtg acgcatgtcg cgcaagactg taaccacgcg 600

tctgttgact ggcaggtggt ggccaatggt gatgtcagcg ttgaactgcg tgatgcggat 660

caacaggtgg ttgcaactgg acaaggcact agcgggactt tgcaagtggt gaatccgcac 720

ctctggcaac cgggtgaagg ttatctctat gaactgtgcg tcacagccaa aagccagaca 780

gagtgtgata tctacccgct tcgcgtcggc atccggtcag tggcagtgaa gggcgaacag 840

ttcctgatta accacaaacc gttctacttt actggctttg gtcgtcatga agatgcggac 900

ttgcgtggca aaggattcga taacgtgctg atggtgcacg accacgcatt aatggactgg 960

attggggcca actcctaccg tacctcgcat tacccttacg ctgaagagat gctcgactgg 1020

gcagatgaac atggcatcgt ggtgattgat gaaactgctg ctgtcggctt taacctctct 1080

ttaggcattg gtttcgaagc gggcaacaag ccgaaagaac tgtacagcga agaggcagtc 1140

aacggggaaa ctcagcaagc gcacttacag gcgattaaag agctgatagc gcgtgacaaa 1200

aaccacccaa gcgtggtgat gtggagtatt gccaacgaac cggatacccg tccgcaaggt 1260

gcacgggaat atttcgcgcc actggcggaa gcaacgcgta aactcgaccc gacgcgtccg 1320

atcacctgcg tcaatgtaat gttctgcgac gctcacaccg ataccatcag cgatctcttt 1380

gatgtgctgt gcctgaaccg ttattacgga tggtatgtcc aaagcggcga tttggaaacg 1440

gcagagaagg tactggaaaa agaacttctg gcctggcagg agaaactgca tcagccgatt 1500

atcatcaccg aatacggcgt ggatacgtta gccgggctgc actcaatgta caccgacatg 1560

tggagtgaag agtatcagtg tgcatggctg gatatgtatc accgcgtctt tgatcgcgtc 1620

agcgccgtcg tcggtgaaca ggtatggaat ttcgccgatt ttgcgacctc gcaaggcata 1680

ttgcgcgttg gcggtaacaa gaaagggatc ttcactcgcg accgcaaacc gaagtcggcg 1740

gcttttctgc tgcaaaaacg ctggactggc atgaacttcg gtgaaaaacc gcagcaggga 1800

ggcaaacaat ga 1812

<210> 3

<211> 282

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atggaactag ccggaataaa cgttgtcgga atggcccaga cctttggaga ggcctcgctc 60

gttgtctccg acctatttcg gcgggctaag gtcaagaaga agaaggccaa acgtgtgtcg 120

ccgggcgatt tcctccctga ccaaattgca gagcttgatg atctgagcgt cactcctctg 180

gctataactt ctcctgggcc taccgtgatg gtcaatgatc acggaattgc tacgagggga 240

cgctttgtcg ctggaccgga atattcagac ctacggggtt aa 282

<210> 4

<211> 789

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tcaagtcgcc gaggtttctt tcttcagatt tactatagca ggcttcatat caccctcttc 60

acgtttctgg ttgggtcccg agagccgcag ggtgaggtct ggctccggtg acggtaccgc 120

cggtcgtggc atcacgccag catttttggt gaactgtgtg atgccgcaag caatgacgtc 180

ataggagcgg tttccagtgc cttgccgcac gaagaaggtg caggctacct ccctgccgta 240

cacatttgtc acttttaact ccagcaggtg aatgaacaag gtacttgcaa aaatggcgat 300

aaagccttcc agatcaggtt cttccacgcg gcggtgcggc caagcaatgt tgtgagcacg 360

gaccatctcc tggaggacga ggtcgctacg atagggttgc atcgtggtcg ccagcacggc 420

ctccaatcca aacgtgatgg atttttcctc cagtactttc tgcatcttct cgcgagatag 480

atagacaaat acatgtcggt cgttttctct ggcaagatcc gggtgatcga caagcatggg 540

agggtgataa catactttgt ttttcaggag atgggccagt tgtttaagta tgaccaccgg 600

cggagcgttt tcctccaaat caagcacgcc ttgggcccac cttttctgga aatccatgag 660

agttttgcta tagacttggc tatagattaa aaaagcaaat tggatctcat cgaacaagtt 720

aagctggttc caggcttttg tgagatctcg tggttgaaag cgttgaagga atagtgatcg 780

aggagccat 789

Claims (8)

1.一种基于发根农杆菌介导的桉树转基因方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1、无菌桉树增殖芽苗的准备，

选择高度为2-3cm生长健壮的无菌桉树增殖芽苗，在超净工作台切下，将芽苗泡在装有无菌水的培养皿中待用；

S2、发根农杆菌的活化和培养，

挑取带有35S: :GUS报告基因的发根农杆菌的菌液，在含有硫酸链霉素和卡那霉素的TY固体培养基上划平板，挑取单菌落，摇菌培养后重悬浮培养；

S3、浸染外植体，

将无菌桉树增殖芽苗的茎基部放置在重悬菌液中浸染30mins；

S4、共培养，

将浸染后的无菌桉树增殖芽苗插入到湿润的海绵中，放置在培养盆中，使用无菌水喷施，密封保湿，无菌桉树增殖芽苗黑暗培养2天；

S5、发根诱导和培养，

将插在海绵中的无菌桉树增殖芽苗转移后，在16h/8h光周期下培养30天，定期喷水和查看；

S6、GUS染色检测，

取诱导的毛状根，使用GUS染色液浸染，或使用LUYOR-3415RG手持式荧光观测仪和荧光显微镜进行观测；

S7、PCR检测，

提取发状根的基因组DNA，进行目的基因的扩增。

2.根据权利要求1所述的桉树转基因方法，其特征在于，所述步骤S1中无菌桉树增殖芽苗为尾巨桉优良无性系芽苗。

3.根据权利要求1所述的桉树转基因方法，其特征在于，所述步骤S2中使用Bio-rad电激转化仪将含有35S: :GUS报告基因的载体pB1121质粒转入Ar1193的发根农杆菌感受态细胞。

4.根据权利要求1所述的桉树转基因方法，其特征在于，所述步骤S3中发根农杆菌重悬浮液的OD600值为0.5~0.7。

5.根据权利要求1所述的桉树转基因方法，其特征在于，所述步骤S4中在桉树增殖芽苗上放置在培养盆中培养，培养温度为24~25℃。

6.根据权利要求1所述的桉树转基因方法，其特征在于，所述步骤S5中基部浸染的桉树增殖芽苗在22~25℃的培养温度下光照培养16h、暗培养8h，每隔2天使用无菌水喷施叶面保湿，每周更换一次无菌水。

7.根据权利要求1所述的桉树转基因方法，其特征在于，所述步骤S6中将毛状根用GUS染色液浸染具体包括：将诱导的毛状根从培养盆中取出，用无菌水清洗后使用吸水纸将毛状根表面水吸干，然后放入玻璃瓶或培养管中，做好标记，加入GUS染色液，以刚好浸没毛状根为准，然后放置在恒温箱中，37℃暗处理12～24个小时后取出，使用无水乙醇清洗一次，然后换新鲜无水乙醇浸泡12小时后更换一次。

8.根据权利要求1所述的桉树转基因方法，其特征在于，所述步骤S7中目的基因的扩增具体包括采用rolA引物、rolB引物和GUS引物进行PCR 扩增。

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