CN111593066A - 一种带有筛选标记桉树遗传转化方法 - Google Patents
一种带有筛选标记桉树遗传转化方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN111593066A CN111593066A CN202010509039.1A CN202010509039A CN111593066A CN 111593066 A CN111593066 A CN 111593066A CN 202010509039 A CN202010509039 A CN 202010509039A CN 111593066 A CN111593066 A CN 111593066A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- culture medium
- eucalyptus
- bud
- genetic transformation
- transformation method
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
- C12N15/8202—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation by biological means, e.g. cell mediated or natural vector
- C12N15/8205—Agrobacterium mediated transformation
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
- A01H4/00—Plant reproduction by tissue culture techniques ; Tissue culture techniques therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/65—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression using markers
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- Botany (AREA)
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
Abstract
本发明公开了一种带有筛选标记桉树遗传转化方法,以尾巨桉无菌苗茎段为外植体诱导愈伤组织,经带有荧光标记基因mCherry的农杆菌转化、不定芽诱导、芽增殖、不定芽伸长、生根及移栽,得到带有可视化荧光标记基因mCherry的再生植株;本发明特点是以带有可视化荧光标记基因mCherry的农杆菌对尾巨桉无性系幼苗下胚轴为外植体经愈伤组织培养的转化,再经不定芽诱导、不定芽伸长、芽增殖以及生根培养、移栽,可以得到可视化荧光标记基因mCherry的再生植株。采用本发明的方法可得到可视化荧光标记基因mCherry的再生植株,结果稳定,转化率良好,能应用于观察目的基因是否成功导入,也为桉树基因育种奠定了基础。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域,具体是一种带有筛选标记桉树遗传转化方法。
背景技术
农杆菌是普遍存在于土壤中的一种革兰氏阴性细菌,它能在自然条件下趋化性地感染大多数双子叶植物的受伤部位,并诱导产生冠瘿瘤或发状根。根癌农杆菌和发根农杆菌中细胞中分别含有Ti质粒和Ri质粒,其上有一段T-DNA,农杆菌通过侵染植物伤口进入细胞后,可将T-DNA插入到植物基因组中。因此,农杆菌是一种天然的植物遗传转化体系。人们将目的基因插入到经过改造的T-DNA区,借助农杆菌的感染实现外源基因向植物细胞的转移与整合,然后通过细胞和组织培养技术,再生出转基因植株。
本方案通过带有mCherry基因的农杆菌转化对植物进行转化,以求的实现在植物转化后对阳性转化植物的形态学标记筛选,从而成为可视化筛选标记。
发明内容
本发明的目的在于提供一种带有筛选标记桉树遗传转化方法,以解决上述背景技术中提出的问题。
为实现上述目的,本发明提供如下技术方案:
一种带有筛选标记桉树遗传转化方法,具体包括以下步骤:
S1、获得尾巨桉无菌瓶苗;
S2、无菌苗茎段切成0.5~1cm长的小段,接种在愈伤诱导培养基上,暗培养一周,培养温度25 ± 2℃。然后转入光照12 h·d-1,光照强度为2000~500 lx,温度25 ± 2℃条件培养2-3周;
S3、经愈伤诱导培养基上培养的愈伤组织转入浸染培养基,超声波30s后加入含有可视化荧光标记基因mCherry的农杆菌,避光28℃,200r摇床摇3h;
S4、将浸染后的愈伤组织转入不定芽诱导培养基上,在25±2℃、暗培养1周后,再转到光照强度2000~500 lx条件下培养2~3周;
S5、经不定芽诱导培养基培养上的愈伤组织转入芽增殖培养基上,并切下芽在荧光微镜下观察是否有红色荧光,然后在25±2℃、光照强度2000~2500 lx条件下培养2~3周;
S6、经芽增殖培养基培养的愈伤组织转入不定芽伸长培养基上,在25±2℃、光照强度2000~2500 lx条件下培养,促进芽伸长;
S7、当芽伸长到3~4 cm时,将不定芽转入生根培养基上培养,以促其生根;
S8、将生根良好的幼苗从恒温光照培养箱移至室外自然环境中炼苗7d,揭开封瓶膜在练苗2d,移栽到灭菌的黄心土中生长,得到带有可视化荧光标记基因mCherry的再生植株。
进一步的,所述愈伤诱导培养基为:MS + LC 1.0mL/mL+ IAA 0.5mg/mL + Vc 1mg/mL+ 蔗糖30 g/L + 琼脂 7 g/L,pH 5.8~5.9 。
进一步的,所述浸染培养基为:MS+蔗糖30g/L。
进一步的,所述不定芽诱导培养基为:MS +6-BA 0.5mg/mL + 萘乙酸(NAA)0.5mg/mL+ 腐胺 500 mmol/L + 亚精胺 100mmol/L +维生素C( Vc) 1 mg/mL + 蔗糖30 g/L +琼脂 7 g/L,pH 5.8~5.9 。
进一步的,所述芽增殖培养基为:1/2 MS + 6-BA 0.5mg/mL +萘乙酸(NAA)0.5mg/mL + 蔗糖30 g/L + 琼脂 7 g/L,pH 5.8~5.9 。
进一步的,所述生根培养基为:1/2 MS + 吲哚丁酸(IBA)1mg/mL + 蔗糖30 g/L +琼脂7 g/L,pH 5.8~6.0 。
进一步的,所述1/2 MS(Murashige and Skoog)培养基为:大量元素为MS的一半,其余不变,蔗糖30 g/L + 琼脂 7 g/L,pH为5.8~5.9。
与现有技术相比,本发明的有益效果是:
本发明通过带有mCherry基因的农杆菌转化对植物进行转化,可实现在植物转化后对阳性转化植物的形态学标记筛选,从而成为可视化筛选标记的转化方法。
本发明特点是以带有可视化荧光标记基因mCherry的农杆菌对尾巨桉无性系幼苗下胚轴为外植体经愈伤组织培养的转化,再经不定芽诱导、不定芽伸长、芽增殖以及生根培养、移栽,可以得到可视化荧光标记基因mCherry的再生植株。采用本发明的方法可得到可视化荧光标记基因mCherry的再生植株,结果稳定,转化率良好,能应用于观察目的基因是否成功导入,也为桉树基因育种奠定了基础。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本专利的技术方案作进一步详细地说明。
一种带有筛选标记桉树遗传转化方法,本发明以尾巨桉无菌苗茎段为外植体诱导愈伤组织,经带有荧光标记基因mCherry的农杆菌转化、不定芽诱导、芽增殖、不定芽伸长、生根及移栽,得到带有可视化荧光标记基因mCherry的再生植株。
具体包括以下步骤:
S1、获得尾巨桉无菌苗,本实施例中的尾巨桉无菌苗为由国家林业局桉树研究开发中心提供的尾巨桉无菌瓶苗;
S2、将步骤S1中的尾巨桉无菌苗去掉顶芽与根部,将下胚轴切成0.5~1cm长的小段,将此接种于愈伤诱导培养基(MS + LC 1mg/mL + IAA 0.5mg/mL + Vc 1 mg/mL+ 蔗糖30 g/L+ 琼脂 7 g/L,pH 5.8 ~5.9),暗培养一周,培养温度25 ± 2℃。然后转入光照12 h·d-1,光照强度为2000~500 lx,温度25 ± 2℃条件培养2-3周;
S3、愈伤培养后,将步骤S2得到愈伤组织置于浸染培养基(MS+蔗糖30 g/L),超声波30S后加入带有荧光标记基因mCherry的农杆菌,避光于28℃、200r的摇床中摇3h,得到外植体;
S4、浸染后,将外植体转移到不定芽诱导培养基(MS+ 6-BA 0.5ml/mL + NAA 0.5mg/mL+ 腐胺 500mmol/L + 亚精胺 100mmol/L + Vc 1 mg/L + 蔗糖30 g/L + 琼脂 7 g/L,pH5.8~5.9)上,在25±2℃,暗培养1周后,然后在照强度2000~2500 lx条件下,培养2~3周;
S5、不定芽诱导培养2~3周后,观察愈伤组织外围是否长菌,并将愈伤组织转移到芽增殖培养基(MS + 6-BA 0.5mg/mL + NAA 0.5mg/mL + cef 200mg/ml+ 蔗糖30 g/L + 琼脂7 g/L,pH 5.8~5.9)上,在25±2℃、光照12 h·d-1、光照强度2000~2500 lx条件下,培养2~3周;
S6、将芽增殖培养得到的芽丛切成单株,并在荧光显微镜下观察,芽丛是否带有红色荧光。然后将芽丛转移到芽伸长培养基(1/2 MS + NAA 0.5mg/mL + LC 1mg/mL + Vc 1mg/mL+ 蔗糖30 g/L + 琼脂 7 g/L,pH 5.8~5.9)上,在25±2℃、光照12 h·d-1、光照强度2000~2500 lx条件下,培养2~3周;
S7、将3~5 cm高的无菌苗转入生根培养基(1/2 MS + IBA 1mg/mL + 蔗糖30 g/L +琼脂 7 g/L,pH 5.8~5.9)上,在25±2℃、光照12 h·d-1、光照强度2000~2500 lx条件下,培养2~3周;
S8、将生根良好的幼苗从恒温光照培养箱移至室外自然环境中炼苗7d,揭开封瓶膜在练苗2d,移栽到灭菌的黄心土中生长,得到带有可视化荧光标记基因mCherry的再生植株。
本实施例中的MS为MS培养基,1/2 MS培养基为:大量元素为MS的一半,其余不变,蔗糖30 g/L + 琼脂 7 g/L,pH为5.8~5.9。
上面对本专利的较佳实施方式作了详细说明,但是本专利并不限于上述实施方式,在本领域的普通技术人员所具备的知识范围内,还可以在不脱离本专利宗旨的前提下做出各种变化。
Claims (7)
1.一种带有筛选标记桉树遗传转化方法,其特征在于,具体包括以下步骤:
S1、获得尾巨桉无菌瓶苗;
S2、无菌苗茎段切成0.5~1cm长的小段,接种在愈伤诱导培养基上,暗培养一周,培养温度25 ± 2℃;
然后转入光照12 h·d-1,光照强度为2000~500 lx,温度25 ± 2℃条件培养2-3周;
S3、经愈伤诱导培养基上培养的愈伤组织转入浸染培养基,超声波30s后加入含有可视化荧光标记基因mCherry的农杆菌,避光28℃,200r摇床摇3h;
S4、将浸染后的愈伤组织转入不定芽诱导培养基上,在25±2℃、暗培养1周后,再转到光照强度2000~500 lx条件下培养2~3周;
S5、经不定芽诱导培养基培养上的愈伤组织转入芽增殖培养基上,并切下芽在荧光微镜下观察是否有红色荧光,然后在25±2℃、光照强度2000~2500 lx条件下培养2~3周;
S6、经芽增殖培养基培养的愈伤组织转入不定芽伸长培养基上,在25±2℃、光照强度2000~2500 lx条件下培养,促进芽伸长;
S7、当芽伸长到3~4 cm时,将不定芽转入生根培养基上培养,以促其生根;
S8、将生根良好的幼苗从恒温光照培养箱移至室外自然环境中炼苗7d,揭开封瓶膜在练苗2d,移栽到灭菌的黄心土中生长,得到带有可视化荧光标记基因mCherry的再生植株。
2.根据权利要求1所述的一种带有筛选标记桉树遗传转化方法,其特征在于,所述愈伤诱导培养基为:MS培养基 + LC 1.0mL/mL+ IAA 0.5mg/mL + Vc 1 mg/mL+ 蔗糖30 g/L +琼脂 7 g/L,pH 5.8~5.9 。
3.根据权利要求1所述的一种带有筛选标记桉树遗传转化方法,其特征在于,所述浸染培养基为:MS培养基+蔗糖30g/L。
4.根据权利要求1所述的一种带有筛选标记桉树遗传转化方法,其特征在于,所述不定芽诱导培养基为:MS培养基 +6-BA 0.5mg/mL + 萘乙酸(NAA)0.5mg/mL+ 腐胺 500 mmol/L+ 亚精胺 100mmol/L +维生素C( Vc) 1 mg/mL + 蔗糖30 g/L + 琼脂 7 g/L,pH 5.8~5.9 。
5.根据权利要求1所述的一种带有筛选标记桉树遗传转化方法,其特征在于,所述芽增殖培养基为:1/2 MS培养基 + 6-BA 0.5mg/mL +萘乙酸(NAA) 0.5mg/mL + 蔗糖30 g/L +琼脂 7 g/L,pH 5.8~5.9 。
6.根据权利要求1所述的一种带有筛选标记桉树遗传转化方法,其特征在于,所述生根培养基为:1/2 MS培养基 + 吲哚丁酸(IBA)1mg/mL + 蔗糖30 g/L + 琼脂7 g/L,pH 5.8~6.0 。
7.根据权利要求5或6所述的一种带有筛选标记桉树遗传转化方法,其特征在于,所述1/2 MS培养基为:大量元素为MS培养基的一半,其余不变,蔗糖30 g/L + 琼脂 7 g/L,pH为5.8~5.9。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202010509039.1A CN111593066A (zh) | 2020-06-07 | 2020-06-07 | 一种带有筛选标记桉树遗传转化方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202010509039.1A CN111593066A (zh) | 2020-06-07 | 2020-06-07 | 一种带有筛选标记桉树遗传转化方法 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN111593066A true CN111593066A (zh) | 2020-08-28 |
Family
ID=72182272
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN202010509039.1A Pending CN111593066A (zh) | 2020-06-07 | 2020-06-07 | 一种带有筛选标记桉树遗传转化方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN111593066A (zh) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN113430222A (zh) * | 2021-07-27 | 2021-09-24 | 中国林业科学研究院热带林业研究所 | 一种基于发根农杆菌介导的桉树转基因方法 |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US6563024B1 (en) * | 1999-05-07 | 2003-05-13 | Oji Paper Co., Ltd. | Process for transformation of mature trees of Eucalyptus plants |
CN102165918A (zh) * | 2011-01-20 | 2011-08-31 | 湛江师范学院 | 粗皮桉组培再生的方法 |
CN102168105A (zh) * | 2010-12-09 | 2011-08-31 | 湛江师范学院 | 尾叶桉遗传转化与再生的方法 |
-
2020
- 2020-06-07 CN CN202010509039.1A patent/CN111593066A/zh active Pending
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US6563024B1 (en) * | 1999-05-07 | 2003-05-13 | Oji Paper Co., Ltd. | Process for transformation of mature trees of Eucalyptus plants |
CN102168105A (zh) * | 2010-12-09 | 2011-08-31 | 湛江师范学院 | 尾叶桉遗传转化与再生的方法 |
CN102165918A (zh) * | 2011-01-20 | 2011-08-31 | 湛江师范学院 | 粗皮桉组培再生的方法 |
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
刘敏燕等: "基本培养基对尾巨桉愈伤组织诱导及再生的影响", 《广东农业科学》 * |
欧阳乐军等: "巨桉miR156 CRISPR/Cas9载体构建", 《森林与环境学报》 * |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN113430222A (zh) * | 2021-07-27 | 2021-09-24 | 中国林业科学研究院热带林业研究所 | 一种基于发根农杆菌介导的桉树转基因方法 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Meilan et al. | Poplar (Populus spp.) | |
CN102599052A (zh) | 一种植物原位再生的方法及其在遗传转化中的应用 | |
Olhoft et al. | Soybean (Glycine max) transformation using mature cotyledonary node explants | |
CN104561089A (zh) | 一种转基因甜瓜组培苗的培育方法及应用 | |
CN108085334B (zh) | 一种改良的农杆菌转化大麦小孢子方法 | |
CN111593066A (zh) | 一种带有筛选标记桉树遗传转化方法 | |
CN103798140A (zh) | 显著提高野生百合胚性愈伤组织继代增殖率的培养方法 | |
CN102499075A (zh) | 一种制备大豆复合型外植体的方法及用该外植体制备快速转基因大豆植株的方法 | |
KR101239643B1 (ko) | 장미 스위트엘로우 체세포배(배발생캘러스 포함)를 이용한 형질전환 식물체 대량획득방법 | |
CN110982820A (zh) | 一种烟草单倍体的基因编辑方法 | |
CN114836468B (zh) | 一种白桦根转基因方法 | |
CN116445535A (zh) | 一种农杆菌介导的莴苣遗传转化方法及其应用 | |
CN116472962A (zh) | 番茄红素在墨兰根状茎增殖培养中的应用 | |
CN113234750B (zh) | 快速获得以菘蓝转基因根为外植体的转基因植株的方法 | |
CN101096673A (zh) | 利用液体共培养系统进行根癌农杆菌介导香蕉基因转化方法 | |
CN113755521A (zh) | 一种由农杆菌介导的草莓‘甜查理’遗传转化体系的构建方法 | |
CN103146748A (zh) | 农杆菌介导的侵染月季芽点转基因的方法 | |
CN113604499A (zh) | 一种带有可见光下裸眼可见的筛选标记桉树遗传转化方法 | |
CN113025645A (zh) | 一种以愈伤为受体获得满天星转基因植株的方法 | |
CN100469886C (zh) | 一种非胚转基因法制备转基因棉花的方法 | |
CN106856998B (zh) | 一种利用盐芥与拟南芥的嫁接体系研究植物耐逆分子机理的方法 | |
CN116555328B (zh) | 文冠果XsMYB113-1基因在植物遗传转化体系建立中的应用 | |
CN112931200B (zh) | 一种利用石竹子叶的组织培养方法及其在石竹遗传转化中的应用 | |
CN109042297A (zh) | 一种玉米自交系sl1303幼胚转化方法 | |
CN109744148B (zh) | 一种基于顶端分生组织转分化的林木芽再生方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20200828 |