CN100469886C

CN100469886C - 一种非胚转基因法制备转基因棉花的方法

Info

Publication number: CN100469886C
Application number: CNB2006101715721A
Authority: CN
Inventors: 王坤波; 宋国立; 张香娣; 刘方; 黎绍惠; 王春英; 王玉红
Original assignee: Institute of Cotton Research of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Institute of Cotton Research of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2006-12-30
Filing date: 2006-12-30
Publication date: 2009-03-18
Anticipated expiration: 2026-12-30
Also published as: CN1985573A

Abstract

本发明提供了一种制备转基因棉花的方法。本方法采用无菌培养的棉花实生苗保留生长点的下胚轴切段为外植体，并纵切外植体的生长点，用携带外源基因的农杆菌感染外植体，进而使其通过器官分化过程培养分化成试管苗，通过嫁接移植成活。本方法主要特点是农杆菌感染的细胞或组织，不需要细胞经过脱分化和再分化进而形成胚性组织(胚性愈伤组织或胚状体和体细胞胚)的过程，而是通过器官分化直接培养成苗，明显缩短棉花外源基因转化的周期，没有受体材料的基因型限制，转化效率高，操作简单，成本低，外源基因以外的变异极小。

Description

一种非胚转基因法制备转基因棉花的方法

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种棉花遗传转化的方法。

背景技术

农杆菌是普遍存在于土壤中的一种革兰氏阴性细菌，它能在自然条件下趋化性地感染大多数双子叶植物的受伤部位，并诱导产生冠瘿瘤或发状根。根癌农杆菌和发根农杆菌的细胞中有一段T—DNA，农杆菌通过侵染植物伤口进入细胞后，可将T—DNA插入到植物基因中。因此，农杆菌是一种天然的植物遗传转化体系。人们将目的基因插入到经过改造的T—DNA区，借助农杆菌的感染实现外源基因向植物细胞的转移和整合。然后通过细胞和组织培养技术，再生出转基因植株。农杆菌介导法起初只被用于双子叶植物中，近几年来，农杆菌的介导转化在一些单子叶植物(尤其是水稻)中也得到了广泛应用。

但是常规的农杆菌介导转化法有其不足之处，表现在它必须经过细胞的脱分化和再分化形成胚性组织和胚性器官(胚性愈伤组织、胚状体和体细胞胚)的过程，其结果是：(1)周期长，常规方法从带外源基因的农杆菌感染外植体到试管苗移栽成活一般需要8～12个月，前两年改用试管苗嫁接，其周期仍然需要6～10个月；(2)受体材料受到限制，即所谓存在“基因型”限制问题；(3)外源基因以外的变异较大，即除了外源基因表达的以外，一部分是来源于组织培养(主要是愈伤组织的形成、细胞脱分化、再分化等)过程中产生的变异。

发明内容

本发明的目的在于针对上述不足提供一种转基因棉花的制备方法。

具体地说，本发明用于转化外源基因的外植体是植物有生长点的实生苗(幼芽)，纵切幼芽的生长点，用携带外源基因的农杆菌感染生长点，进行培养，生长点直接分化成幼苗，幼苗长到2cm以后嫁接移植。这里形成的T0代为嵌合体，包含非转基因细胞与一个或多个转基因细胞(events)共存的嵌合体。本发明的方法亦可称为“棉花农杆菌非胚转基因法”

本发明包括如下步骤：

1、制备无菌苗。将种子去种皮，灭菌消毒，无菌水冲洗，MS固体培养基上培养，使种子萌发；

2、制备携带外源基因的农杆菌菌液。用常规方法将外源基因导入到农杆菌。选择具携带外源基因的农杆菌在LB液体培养基中震荡培养，OD₆₆₀值＝0.5左右备用。所述外源基因可以为Ac/Ds基因。

3、感染外植体以及分化培养外植体。

1)用刀片去掉子叶和下胚轴多余部分，保留棉花幼芽生长点及以下约0.5至1cm长的切段，并用刀片从生长点向下纵向划一小伤口。

2)切段侵入制备好的农杆菌培养液中约5～15min，然后取出切段，用滤纸吸干切段上多余菌液，将切段放到共培养基(MSB5)上培养48小时。棉花幼芽可以为辽棉7号幼芽。嫁接用砧木苗可以为辽棉7号。

共培养基：MS盐，B5(Gamborg medium)维生素，2％葡萄糖，和0.8％的agar(琼脂)，0.1mg·L^-1kinetin和0.1mg·L^-12·4-D(2，4-二氯苯氧乙酸2，4-dichlorophenoxyacetic acid)

3)：然后切段在转移到选择培养基上培养。

选择培养基：

‘MSB5’，0.8％琼脂，2％葡萄糖，50mg·L^-1kanamycin(卡那霉素)和100mg·L^-1cefotaxime(头孢霉素)。

每3-4周继代培养一次，直到长成幼苗(主茎长达到2cm)。培养基及培养条件同上。

4、嫁接转移。将步骤3的幼苗嫁接到砧木苗上。

常规转化方法的核心技术是脱分化和再分化，即感染后的细胞或组织(愈伤组织)需要脱分化成为单细胞，然后单细胞再分化形成再生苗(非嵌合体)。本方法是不需要脱分化和再分化，感染后的生长点直接分化形成再生苗(一般是嵌合体)，即核心技术是用携带外源基因的农杆菌感染幼芽的生长点，结合试管苗嫁接移植(解决嵌合的问题)。

本发明的优点是：

(1)缩短周期明显，从农杆菌感染到试管苗的嫁接成活一般3～4个月，只有常规方法时间的一半或更短；

(2)没有受体材料限制问题；

(3)外源基因以外的变异极小，甚至等于零；

(4)技术方法简单，易于掌握和操作；

(5)成本明显降低，按照单一转化子计算，可能是常规方法的10～30％；

(6)外源基因的转化效率高。按照转化子占外植体百分率计算，可以达到20％，是常规方法的几倍乃至几十倍。

附图说明

图1是转基因植株的PCR检测图片，其中M表示核酸分子量标准，1是Ac/Ds的质粒DNA对照，2～4是通过卡纳霉素检测确认为转基因植株的进一步验证，7和16为清水对照，5、6、8～15、17～19为不同植株的叶片DNA。

具体实施方式

下面结合实施例进一步对本发明进行说明，但不用来限制本发明所要保护的范围。

Ac/Ds基因转化辽棉7号的具体方法：

一、无菌苗的制备

剥去棉籽(辽棉7号，购自中国农业科学院棉花研究所种质资源库)种皮。在超净台上，将棉种放入70％酒精中1-2min。再放入0.1％HgCl₂中浸泡7min。无菌水清洗三至六次，每次一分钟。接入苗培养基(1/2MS+0.8％琼脂+自来水)中，于24℃发芽5-10天。每天16小时光，8小时暗。

二、农杆菌培养液的制备

将外源基因Ac/Ds装入pBI121(购自拜尔迪公司)，导入农杆菌LBA4404，置-80℃冰箱保存备用。

从-80℃冰箱中取出菌株，在LB+1.5％琼脂的固体培养基上划平板，培养2天后，挑取单菌落接种到LB液体培养基中，27℃条件下180转/分钟震荡培养，16小时后转入新鲜的LB液体培养基中，16小时后测OD₆₆₀值＝0.5左右备用。LB固体、液体培养基中均加抗生素羧苄青霉素(carbenicillin)50mg·L^-1和卡那霉素(kanamycin)100mg·L^-1。

三、材料处理及感染

1：用手术刀去掉子叶和下胚轴多余部分，保留生长点以下约0.5至1cm长的切段，并用手术刀从生长点向下纵向划一小伤口；

2：切段侵入制备好的农杆菌培养液中10min，然后取出切段，用滤纸吸干切段上多余菌液，将切段放到预先放有一张滤纸的共培养基(MSB5)上，于24℃培养2天，每天16hrs光照。

共培养基：MS盐，B5(Gamborg medium)维生素，2％葡萄糖，和0.8％agar，0.1mg·L^-1kinetin和0.1mg·L^-12·4-D(2，4-二氯苯氧乙酸2，4-dichlorophenoxyacetic acid)；pH5.8

3：然后切段再转移到选择培养基上培养。28℃and 16hrs/天光照。

选择培养基：

‘MSB5’，0.8％琼脂，2％葡萄糖，50mg·L^-1karnamycin(卡那霉素)and 500mg·L^-1cefotaxime(头孢霉素)，pH5.8

每3-4周继代培养一次，直到长成幼苗(主茎长达2cm)。培养基及培养条件同上。

四、幼苗的嫁接转移

选择辽棉7号作为砧木苗品种，播种后十天，子叶平展后即可以使用。将上述幼苗嫁接到砧木苗上。

五、转化子的检测

首先经过卡那霉素鉴别，几次重复后，再进行PCR检测。

1、卡那霉素鉴别用于抗性鉴定的卡那霉素为市售医用硫酸卡那霉素注射液(Kanamycin sulphate injection)，由石家庄制药集团有限公司石家庄市第一制药厂生产，产品批号为9908092。用蒸馏水稀释卡那霉素，配制浓度为2000～4000ppm的鉴定液。鉴别的具体对象是F0代转基因植株各个节位的叶片(或者腋芽)，鉴别的具体方法是涂抹或浸润。涂抹时，采用毛笔或脱脂棉，在鉴定液里浸透，均匀地涂抹在叶片的正面。浸润时，脱脂棉捏成小球，在鉴定液里浸透，摆放在叶片的正面。识别方法是查看鉴定液处理部位有否颜色变化，凡是有黄色出现的就不是转基因叶片(腋芽)，凡是没有明显的颜色变化的叶片就是转基因的叶片(腋芽)。本例中共对16株转基因植株进行了检测，用上述方法鉴别出了其中3株为转基因植株。

2、PCR检测

PCR检测的靶基因是npt II。经过卡那霉素初步鉴别的转基因植株，取叶片提取DNA，然后采用npt II序列设计的引物进行PCR扩增，引物序列是：

5′-TGCGAATCGGGAGCGGCGATACCG-3′(P1)

5′-TGGGCACAACAGACAATCGGCTGC-3′(P2)。

Buffer10×(15mM Mg²⁺) 10μl

dNTPs(各10mM) 2μl

引物1(5μM) 10μl

引物2(5μM) 10μl

Taq酶(2.5U/μl) 1μl

模板DNA(1μg/μl) 1μl×4

加ddH₂O至100ul 63μl

100μl

体系配好后分别分装到四个PCR管中，即最终每管反应体系是25μl

反应程序：

Step Temperature Time

1 94℃ 6min

2 94℃ 45sec

3 55℃ 1min

4 72℃ 2min 32cycle from2 to 4

5 72℃ 10min

6 4℃

采用了16个转基因植株，PCR检测结果如图1所示，其中3株得到进一步验证(序号1是Ac/Ds的质粒DNA对照，2～4是通过卡纳霉素检测确认为转基因植株的进一步验证，7和16为清水对照，5、6、8～15、17～19为不同植株的叶片DNA。)。可见，应用本发明方法外源基因的转化效率高。

Claims

1、一种制备转基因棉花的方法，该方法包括如下步骤：

(1)取棉花幼芽生长点及以下0.5-1cm长的切段，并划伤生长点；

(2)将上述切段浸入携带外源基因的农杆菌培养液中5-15min，然后取出切段放到共培养基上培养；

(3)将共培养后的切段转移到选择培养基中培养，至长成幼苗；

(4)将步骤(3)所得幼苗嫁接到砧木苗上。

2、如权利要求1所述的方法，其特征在于所述幼芽为实生苗的幼芽。

3、如权利要求1所述的方法，其特征在于所述划伤生长点为从生长点向下纵向划一小伤口。

4、如权利要求1～3任一项所述的方法，其特征在于所述的外源基因为Ac/Ds基因。

5、如权利要求1～3任一项所述的方法，其特征在于所述的棉花幼芽为辽棉7号幼芽。

6、如权利要求1～3任一项所述的方法，其特征在于所述的砧木苗为辽棉7号。