CN101575611B - 一种农杆菌介导的四倍体硬粒小麦Stewart的遗传转化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种农杆菌介导的四倍体硬粒小麦Stewart的遗传转化方法。该方法包括如下步骤：用目的农杆菌侵染四倍体硬粒小麦的幼胚，再进行共培养，将目的基因导入小麦幼胚；所述目的农杆菌为将目的基因导入根癌农杆菌菌株AGL1得到的。本发明建立四倍体硬粒小麦Stewart的幼胚农杆菌转化体系，转化效率高，可达2.3-12.26％，平均效率6.32％，重复性好。本发明方法对提高小麦及其近缘属农杆菌转化效率，利用四倍体突变体库研究小麦的功能基因组学及我国小麦品种的遗传改良和创制转基因小麦新种质等具有十分重要的意义。
Description
技术领域
本发明涉及一种农杆菌介导的四倍体硬粒小麦Stewart的遗传转化方法。
背景技术
自1997年Cheng等首次利用农杆菌介导法转化小麦获得了转基因植株，农杆菌转化已逐步成为小麦功能基因组学研究的重要工具。与基因枪转化相比，农杆菌转化具有以下优势：目的基因多为单拷贝或低拷贝；插入边界多为T-DNA左右边界，重排率低；容易排除冗余的质粒DNA序列；容易获得无选择标记的转基因植株(Cheng等，2004；Jones，2005；Wu等，2006)。
与其它农作物相比，小麦农杆菌转化比较困难且进展缓慢。近年来，世界各国不同的研究小组从小麦基因型、外植体的选择和预处理、农杆菌菌株，Ti质粒、双元载体及接种和共培养条件等方面，进行了一系列的探索和研究。目前，小麦农杆菌可转化基因型已报道的主要有Bobwhite(春)，Cadenza(春)，Florida(冬)，Fielder(春)，Veery-5(春)，Vesna(春)和四倍体硬粒小麦Ofanto等。外植体类型主要有新鲜幼胚，预培养1-6天的幼胚，培养14天的胚性愈伤及芽尖和成熟胚愈伤组织(Jones等，2005)。对Cadenza(春)、Florida(冬)新鲜幼胚和预培养1-6天的胚性愈伤进行转化研究后发现，新鲜幼胚具有较好的再生和转化效率(Wu等，2003)。农杆菌菌株和双元载体主要有C58-ABI(pMON18365)，C58-ABI(pMON30139)，C58-CI(pPTN155)，LBA4404(pHK21)、AGL1(pAL154/pAL156)和AGL0(pBGXI)等，其中，AGL0和AGL1菌株因为还含有致毒力较强的Ti质粒pTiBo542，所以对寄主的侵染和致瘤能力更强(Cheng等，1997)。
Khanna等(2003)通过构建超级双元表达载体HK21和在培养基中加入多胺类化合物，转化效率达到了1.2-3.9％。Cheng等(2003)认为农杆菌感染后对外植体进行干燥处理可显著提高T-DNA转运水平和转化效率。值得指出的是，Hu等(2003)对基因枪法和农杆菌法转化小麦进行了同步比较，表明农杆菌转化效率明显高于基因枪法，而且农杆菌法获得的单拷贝整合植株比率显著多于基因枪法，并将EPSPS基因导入了小麦品种Bobwhite。
到目前为止，拓宽和筛选小麦农杆菌可转化的受体基因型仍然是世界各研究小组的工作重点之一。四倍体硬粒小麦cv Stewart为普通小麦和硬粒小麦杂交后代，是春小麦，染色体组为AABB。建立并完善其农杆菌转化系统，并提高其转化效率，对普通小麦D组染色体基因的功能研究和利用突变体库研究小麦的功能基因组学具有重要意义。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种转化四倍体硬粒小麦的方法。
本发明所提供的转化四倍体硬粒小麦的方法，包括如下步骤：用目的农杆菌侵染四倍体硬粒小麦的幼胚，再进行共培养，将目的基因导入小麦幼胚；所述目的农杆菌为将目的基因导入根癌农杆菌菌株AGL1得到的。
所述幼胚最好为授粉12-14天后的心型胚。
所述侵染可包括如下步骤：将所述幼胚盾片朝上放置于接种培养基上，再向其中倒入所述目的农杆菌菌液，在黑暗条件下浸泡1-3小时，优选为1小时；
所述接种培养基中含有乙酰丁香酮，乙酰丁香酮在接种培养基中的浓度为200uM-400uM，优选为400uM。
所述侵染方法中还可包括向其中加入表面活性剂的步骤，加入的表面活性剂在侵染体系中的终浓度为0.015％(体积百分含量)；所述表面活性剂具体可为表面活性剂(Silwet-77)(Lehle seeds，USA)。
其中，所用的菌液的OD600值为1-1.5为宜。
所述共培养的方法可包括如下步骤：将所述侵染后的幼胚置于共培养培养基中，在22-25℃的温度下暗培养1-3天；所述共培养培养基中包括终浓度为2-10mg/L的氨氯吡啶酸和200uM-400uM的乙酰丁香酮；所述共培养的时间优选为3天；所述氨氯吡啶酸的终浓度优选为10mg/L，所述乙酰丁香酮的终浓度优选为400uM。
本发明的另一个目的是提供一种培育四倍体硬粒小麦的转基因小麦的方法。
本发明所提供的培育四倍体硬粒小麦的转基因小麦的方法，包括如下步骤：用上述任一所述方法将目的基因导入四倍体硬粒小麦的幼胚中，再进行诱导培养、再生培养、筛选培养，得到转基因小麦。
所述诱导培养可包括如下步骤：将所述共培养后的幼胚置于诱导培养基中，在22-25℃温度下暗培养1-4周，得到愈伤组织；所述诱导培养基中包括终浓度为150-170mg/L的特美汀和终浓度为2-6mg/L的氨氯吡啶酸；所述氨氯吡啶酸的终浓度优选为2mg/L；所述特美汀的浓度优选为150mg/L；诱导培养的时间优选为3周。
所述再生培养可包括如下步骤：将所述愈伤组织置于再生培养基中，在温度为22-25℃、光照强度为700-800μEs-1m-2、光照时间为14-18h/d的条件下培养2-4周，得到再生苗；所述再生培养基中包括终浓度为150-170mg/l的特美汀；所述光照强度优选为750μEs-1m-2，所述光照时间优选为16h/d，所述培养的时间优选为3周；所述特美汀的浓度优选为150mg/l。
所述目的基因具体可以是通过重组载体导入根癌农杆菌AGL1中的。
所述筛选培养可包括如下步骤：将所述再生苗置于筛选培养基中，在温度为22-25℃、光照强度为700-800μEs-1m-2、光照时间为14-18h/d的条件下培养2-4周，得到存活植株；所述筛选培养基中包括终浓度为2-6mg/L的草丁膦和终浓度为150-170mg/l的特美汀；所述光照强度优选为750μEs-1m-2，所述光照时间优选为16h/d，所述培养的时间优选为3周；草丁膦的终浓度优选为2.5-4mg/L；特美汀的终浓度优选为150mg/l。
所述方法还可包括如下恢复培养的步骤：将所述存活植株移至恢复培养基中，在温度为22-25℃、光照强度为700-800μEs-1m-2、光照时间为14-18h/d的条件下培养2-4周；所述恢复培养基中包括终浓度为150-170mg/l的特美汀；所述光照强度优选为750μEs-1m-2，所述光照时间优选为16h/d，所述培养的时间优选为3周；特美汀的终浓度优选为150mg/l。
上述转化和培育方法中所述四倍体硬粒小麦为四倍体硬粒小麦品种Stewart。
本发明建立四倍体硬粒小麦Stewart的幼胚农杆菌转化体系，转化效率高，可达2.3-12.26％，平均效率6.32％，重复性好。本发明方法对乙酰丁香酮在共培养基中的浓度、Picloram在共培养基中的浓度对愈伤组织再生的影响进行了研究，结果表明，和浓度为200uM相比，乙酰丁香酮在接种培养基和共培养基中的浓度为400uM时，T-DNA转移效率大大提高，但并未影响到农杆菌侵染后的再生频率。共培养培养基中Picloram的浓度分别为2.0mg/l、4.0mg/l、10mg/l时，随着Picloram浓度提高，经农杆菌侵染后的幼胚愈伤组织再生频率大大提高。因此，本发明方法对提高小麦及其近缘属农杆菌转化效率，利用四倍体突变体库研究小麦的功能基因组学及我国小麦品种的遗传改良和创制转基因小麦新种质等具有十分重要的意义。
附图说明
图1为乙酰丁香酮在共培养基中浓度分别为200uM和400uM时，接种6天、20后6US基因的表达情况。
图2为共培养培养基中Picloram的浓度分别为2、4、10mg/l时，幼胚愈伤组织的诱导频率和再生频率比较。
图3为GUS在转化植株的叶子中的稳定表达检测。
图4为bar基因的PCR扩增结果。
图5为转基因株系的uidA基因PCR扩增结果。
图6为转基因植株的基因组Southern Blot结果(UidA基因探针)。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中用到的培养基及其组成如表1、表2和表3所示：
表1、接种培养基、共培养基和诱导培养基的组成
表2、再生、筛选和恢复培养基的组成成分
表3、MG/L培养基的组成(每升)
其中，各成分的配制方法如下：
1、MS Macrosalts(x10)：
16.5g/l NH4NO3(Fisher Scientific UK，Leicestershire，UK)
19.0g/l KNO3(Sigma-Aldrich，Dorset，UK)
1.7g/l KH2PO4(Fisher Scientific UK)
3.7g/l MgSO4.7H2O(Fisher Scientific UK)
4.4g/l CaCl2.2H2O(Fisher Scientific UK)
121℃高压灭菌20min，4℃保存。
2、MS Vitamins(x1000)：
0.1g/l Thiamine HCl(Sigma-Aldrich)，
0.5g/l Pyridoxine HCl(Sigma-Aldrich)，
0.5g/l Nicotinic acid(Sigma-Aldrich).
抽滤，4℃保存。
3、L7Microsalts(x1000)：
15.0g/l MnSO4(Fisher Scientific UK)
5.0g/l H3BO3(Fisher Scientific UK)
7.5g/l ZnSO4.7H2O(Fisher Scientific UK)，
0.75g/l KI(Fisher Scientific UK)
0.25g/l Na2MoO4.2H2O(VWR International Ltd.，Leicestershire，UK)
0.025g/l CuSO4.5H2O(Fisher Scientific UK)
0.025g/l CoCl2.6H2O(Sigma-Aldrich)
每次准备100ml，抽滤后4℃保存。
4、MS Vitamins/Inositol(x200)：
40.0g/l myo-Inositol(Sigma-Aldrich)，
2.0g/l Thiamine HCl，
0.2g/l Pyridoxine HCl，
0.2g/l Nicotinic acid，
0.2g/l Ca-Pantothenate(Sigma-Aldrich)，
0.2g/l Ascorbic acid(Sigma-Aldrich).
抽滤后，分装成10ml，-20℃保存。
5、2，4-Dichlorophenoxyacetic acid(2，4-D)(Sigma-Aldrich)：用70％乙醇溶解，至终浓度为1mg/ml。抽滤后，分装成1ml，-20℃保存。
6、Zeatin mixed isomers(Sigma-Aldrich)：将100mg Zeatin溶解在少量1M HCl，无菌水定容到10ml，使Zeatin的终浓度为10mg/ml。抽滤后，分装成1ml，-20℃保存。
7、Picloram(1mg/ml)(Sigma-Aidrich)：100mg Picloram溶解在少量无菌水中，几滴1MNaOH助溶，定容到100ml。抽滤后，分装成2ml，-20℃保存。
8、植物凝胶购自Sigma-Aidrich。
9、特美汀(Timentin)(Smithkline Beecham，UK；Ticarcillin∶clavulanicacid 15∶1)。
实施例1、共培养基中不同浓度的乙酰丁香酮对转化效果的影响
一、遗传转化：
1、重组农杆菌的构建：
选用农杆菌菌株为：根癌农杆菌菌株AGL1。载体：pAL154和pAL156(John InneCentre)，是由JIC基于pSoup/pGreen双元载体系统发展而来(Hellens RP，Edwards EA，Leyland NR，Bean S，Mullineaux PM.Pgreen：A versatile andflexible binary Ti vector for Agrobacterium-mediated plant transformation.Plant Mol Biol 2000，42：819-832。)。
pAL154作为辅助质粒，除具有促进pAL156复制和扩增功能外，还含有额外的15kb的Komari片段，大大增强和提高了菌株侵染和转移Ti质粒的效率。pAL156中含有UidA基因。pAL156含有一个T-DNA，这个T-DNA具有Bar和GUS基因的表达盒，均由Ubiquitin启动子启动表达(Christensen，and Quail，P.H.，1992.Ubiquitin romoter based vectors for high level expression ofselectable and/or screening marker genes in monocotyledonous plants.Transgen Res.5，213-218)，其中因GUS基因还带有内含子，在农杆菌中不能表达，因而减少了瞬时表达的假阳性，pAL156中还含有bar基因(该基因具有草丁膦(简称PPT)抗性)。
将载体pAL154和pAL156通过电击法导入农杆菌AGL1，电击参数按Biorad公司电击仪使用指南进行。
阳性重组农杆菌的筛选：将重组菌在含有200ug/ml羧苄青霉素和100ug/ml的卡那霉素的培养基中培养三天，筛选得到含有载体pAL154和pAL156的重组农杆菌，命名为重组农杆菌AGL1/pAL154/pAL156。
2、重组菌的培养及接种菌液的制备：
将重组农杆菌AGL1/pAL154/pAL156接种于MG/L培养基(表3)，进行培养，至其对数生长期；离心菌液，弃上清，收集菌体，然后用不含植物凝胶的接种培养基(如表1所示，其中不含Picloram和2，4D，乙酰丁香酮的浓度与下述接种步骤4中使用的接种培养基中的浓度相同)重悬菌体，使菌液OD600值为1.5。
3、受体材料和组织培养
本发明以四倍体硬粒小麦品种Stewart(国家种质资源库)的新鲜幼胚(心型胚)作为受体材料。
将四倍体硬粒小麦cv Stewart(来源于国家种质资源库)种植在可控温室条件下，条件为18-20℃/1O-14℃(白天/黑夜)，光照为16/8小时(光/暗)，400W钠灯，光强为750μEs-1m-2，湿度为50-70％。取授粉后12-14天的未成熟种子(其中含有心型胚)，在70％乙醇中浸泡30-60s，然后用10％次氯酸钠Bleach(Lever)消毒15min，再用无菌水冲洗3-5次，在无菌条件下分离幼胚，幼胚大小一般为0.8-1.5mm。
4、接种
将步骤3获得的新鲜剥离的幼胚盾片向上接种在含有植物凝胶的接种培养基上(如表1所示，其中乙酰丁香酮的浓度设置以下两个不同浓度：200μM和400μM，Picloram的浓度为10mg/L)，然后向其中倒入步骤2获得的接种菌液8ml，使幼胚浸泡在步骤2获得的接种菌液中，再向其中加入60ul 1％(体积百分比)表面活性剂(Silwet-77)(Lehle seeds，USA)至其终浓度为O.015％(体积百分含量)，然后在黑暗条件下浸泡3h。记录接种的胚的数目(即表4中的“接种胚数”)。
5、共培养
共培养：将侵染后的外植体转移到共培养培养基上，然后在24℃条件下暗培养3天。共培养的培养基如表1所示(其中，Picloram的浓度为10mg/L，乙酰丁香酮的浓度与步骤4中接种培养基中乙酰丁香酮的浓度相同)。
6、诱导培养
将共培养3天后的外植体转移到诱导培养基中，然后在24℃暗培养3周，形成愈伤组织。诱导培养基的组成如表1所示(其中，Picloram的浓度为2mg/L，特美汀的浓度为150mg/L)。Timentin的作用是控制农杆菌的生长。统计形成愈伤组织的胚的数目(即表4中的“诱导愈伤”)，并计算诱导率，诱导率的计算公式为：诱导率＝“诱导愈伤”/“接种胚数”。
7、再生培养
将诱导培养形成的愈伤组织转移到含有150mg/lTimentin的再生培养基(RDZ)中，然后在24℃、光照强度750μEs-1m-2、光照时间16h/d的条件下培养3周，得到再生苗，统计产生再生苗的愈伤数目(即表4中的“再生数”)和再生频率。再生培养基的组成如表2所示，再生频率的计算公式如下：再生频率＝“再生数”/“接种胚数”。
8、筛选培养与壮苗培养：
一次筛选：将再生苗转移到含有150mg/l Timentin的筛选培养基(RPPT)中，在24℃、光照强度750μEs-1m-2、光照时间16h/d的条件下培养3周，筛选得到存活苗。筛选培养基的组成如表2所示，其中Glufosinate ammonium(PPT)的浓度为2.5mg/l。
二次筛选：将一次筛选得到的存活苗再进行一次筛选，筛选培养基中PPT浓度为4.0mg/l，方法同第一次筛选相同。
壮苗培养：
将经过二筛的存活植株，转移到恢复培养基上进行壮苗培养2周。恢复培养基的组成如表2(其中，Timentin的浓度为150mg/l)。
9、移栽
将经过两轮PPT筛选仍然存活的植株，壮苗培养1-2周后移栽到温室土钵中，存活植株的生长状况较好。
二、阳性植株鉴定
(一)GUS瞬时表达率的检测
分别在接种后的第6天和第20天(以接种当天计作第1天)进行GUS基因瞬时表达情况检测。统计GUS表达胚数目和GUS瞬时表达率。GUS瞬时表达频率＝GUS表达胚数/“接种胚数”)。
检测结果如图1和表4所示。图1中，A、B表示接种农杆菌后第6天的检测结果，C、D表示第20天的检测结果。A、C表示乙酰丁香酮在共培养基中浓度为200uM、Picloram在共培养基中浓度为10mg/L时的检测结果；B、D表示乙酰丁香酮在共培养基中浓度为400uM、Picloram在共培养基中浓度为10mg/L时的检测结果。
(二)T-DNA转移效率的检测
T-DNA转移效率检测在接种农杆菌后第6天进行。
T-DNA转移效率的计算公式：T-DNA转移效率＝Gus Loci/接种胚数。(T-DNA转移效率统计是基于每个处理中接种胚具有GUS表达的位点的平均数)
(三)标记基因的检测
1、bar基因PCR检测：
扩增bar基因的引物序列如下：P1：5‘-GTCTGCACCATCGTCAACC-3’，P2：5‘-GAAGTCCAGCTGCCAGAAAC-3’；以实验一中筛选得到的抗性苗的叶片基因组DNA为模板，用上述引物进行PCR扩增，扩增产物用琼脂糖凝胶电泳进行检测，同时以未转入任何载体的植株作为对照。结果如图4所示(M：DNA Marker，CK+：pAL156质粒，CK：未转化植株，1：水，2：X015-1-2，3：X015-1-3，4：X015-1-5，5：X015-1-7，6：X015-2-6，7：X015-2-8，8：H027-1-1，9：H027-3-10，10：H028-1-3，2-10表示阳性转基因植株)，扩增产物大小为444bp左右，与bar基因的长度符合，表明扩增产物为目的基因。统计阳性植株数目(即表4中的“PCRbar”)。
2、GUS基因的表达检测：
将存活苗的胚状体、幼芽、叶片和小花等在X-Gluc缓冲液中，37℃培养过夜，检测GUS的表达。检测GUS基因表达的方法如文献(Jefferson RA(1987)Assayingchimeric genes in plants：the GUS gene fusion system.Plant Mol Biol Rep5：387-405)中所述。对存活苗的叶子进行GUS基因表达检测。
结果如图3所示，表明GUS基因在存活苗的叶子正常表达。(图3为随机取样进行GUS表达检测的结果，每个酶标板的四角为非转基因对照，没有GUS表达的样品为非转基因阴性植株。)
统计阳性植株数目(即表4中的“叶片GUS表达阳性”)。
3、UidA基因PCR检测：
扩增UidA基因的引物序列如下：
P3：5‘-AGTGTACGTATCACCGTTTGTGTGAAAC-3’，P4：5‘ATCGCCGCTTTGGACATACCATCCGTA-3’，以抗性苗叶片的基因组DNA为模板，用上述引物进行PCR扩增，扩增产物用琼脂糖凝胶电泳进行检测，结果如图5所示((M：DNA Marker，CK+：pAL156质粒，CK：未转化植株，1：水，2：X015-1-2，3：X015-1-3，4：X015-1-5，5：X015-1-7，6：X015-2-6，7：X015-2-8，8：H027-1-1，9：H027-3-10，10：H028-1-3)，扩增产物大小为1051bp左右，与UidA基因的长度符合，表明扩增产物为目的基因。
统计阳性植株数目(即表4中的“PCR UidA”)。
4、转基因植株的Southern Blot检测
利用UidA基因的PCR扩增产物做杂交探针，采用Promega公司Primc-a-GeneLabeling System试剂盒进行探针标记，α-32P-dCTP购自北京亚辉生物公司。
选择PCR检测呈阳性的植株，提取基因组DNA，取30ug进行BglII酶切处理，1％的琼脂糖电泳小时后，转至Hybond+尼龙膜，按Xia等(Lanqin Xia，Sandui Guo.2001.Integration and inheritance stability of Bt toxin gene in the bivalentinsect-resistant transgenic cotton plants.Chinese Science Bulletin，46(16)：1372-1375)方法进行Southern杂交。洗膜后，压磷屏24h，扫屏10分钟左右进行杂交信号检测。
结果如图6所示(所有杂交带均为目的条带，只是不同转基因株系中整合的拷贝数不同)，转基因植株与阳性对照一样，得到大于4092bp以上的杂交条带，而非转基因植株无这些条带，证实外源基因已整合到受体植株的基因组中(图6)。图6中，2、H027-4-3；3、H028-6-4；4、C024-1-5；5、X015-2-1；6、H027-7-1；8、H027-2-1；9、非转基因对照；10、阳性对照(该阳性对照为pAL156的BglII酶切产物)；M、1kb Marker。2-6、8表示不同转基因株系。
将bar基因或UidA PCR检测为阳性的存活苗认为是阳性转化苗。统计阳性转化苗数目和最终转化效率。最终转化效率的计算公式为：最终转化效率＝“阳性转化苗”数目/“接种胚数”。
当共培养基中的As浓度分别为200μM和400μM时，其对T-DNA转移效率、GUS瞬时表达及再生频率的影响统计结果见表4。结果表明，当As浓度为200μM时，GUS瞬时表达频率平均为76.53％；提高As浓度至400μM时，GUS瞬时表达频率为100％。提高As浓度后，T-DNA转移效率也大为提高，当As浓度分别为200μM和400μM时，T-DNA转移效率分别为8±0.8165和17±2.828。但对再生效率统计结果显示，并未影响了外植体的再生，当As浓度分别为200μM和400μM时，外植体的再生频率的平均值分别为49.46±17％和57.19±13％；转化效率大为提高，平均值为4.73±2.1％和6.32±3.4％。
表4.接种培养基中的As浓度对GUS瞬时表达频率、T-DNA转移效率、再生频率和最终转化效率的影响
| 实验批次 | 处理 | GUS瞬时表达率(％) | T-DNA转移效率 | 接种胚数 | 诱导愈伤 | 诱导率(％) | 再生数 | 再生频率(％) | 叶片GUS表达阳性 | PCRUidA | PCRbar | 最终转化效率(％) |
| C022-1 | As4P10 | 84 | 72 | 85.71 | 56 | 66.67 | 2 | 2 | 2 | 2.38 | ||
| H026-5 | As4P10 | 100 | 15 | 84 | 71 | 84.52 | 49 | 58.09 | 2 | 4 | 4 | 4.76 |
| H025-3 | As4P10 | 64 | 39 | 60.94 | 28 | 43.75 | 3 | 3 | 3 | 4.69 | ||
| H027-3 | As4P10 | 100 | 17 | 87 | 82 | 94.25 | 65 | 74.71 | 5 | 5 | 5 | 5.75 |
| H027-4 | As4P10 | 88 | 78 | 88.64 | 66 | 75.00 | 2 | 3 | 3 | 3.41 | ||
| H027-5 | As4P10 | 83 | 74 | 89.16 | 58 | 69.88 | 4 | 4 | 5 | 6.02 | ||
| H027-6 | As4P10 | 86 | 84 | 97.67 | 50 | 58.14 | 3 | 4 | 4 | 4.65 | ||
| C024-2 | As4P10 | 100 | 17 | 98 | 72 | 73.47 | 57 | 57.76 | 3 | 4 | 4 | 4.08 |
| C024-4 | As4P10 | 102 | 94 | 92.16 | 50 | 49.02 | 10 | 11 | 12 | 11.76 | ||
| Cll-2 | As4P10 | 62 | 52 | 83.87 | 31 | 50.00 | 3 | 3 | 3 | 4.84 | ||
| X015-1 | As4P10 | 106 | 96 | 90.57 | 45 | 42.45 | 13 | 13 | 13 | 12.26 |
| X015-2 | As4P10 | 100 | 19 | 98 | 70 | 71.43 | 40 | 40.82 | 11 | 11 | 11 | 11.22 |
| 平均值 | 100 | 17 | 84.37 | 57.19 | 6.32 | |||||||
| H027-2 | As2P10 | 76 | 53 | 69.47 | 48 | 62.89 | 1 | 1 | 1 | 1.32 | ||
| H027-7 | As2P10 | 77.78 | 7 | 60 | 45 | 75.00 | 33 | 55.00 | 4 | 4 | 4 | 6.67 |
| C024-1 | As2P10 | 115 | 102 | 88.70 | 73 | 63.48 | 6 | 6 | 6 | 5.22 | ||
| Cll-1 | As2P10 | 100 | 8 | 60 | 49 | 81.67 | 11 | 18.33 | 2 | 3 | 3 | 5.00 |
| H028-1 | As2P10 | 58.33 | 9 | 83 | 44 | 53.01 | 33 | 39.76 | 5 | 5 | 5 | 6.02 |
| H028-3 | As2P10 | 43 | 38 | 88.37 | 29 | 67.44 | 1 | 1 | 2.33 | |||
| H028-7 | As2P10 | 70. | 8 | 61 | 45 | 73.77 | 24 | 39.34 | 2 | 3 | 4 | 6.56 |
| 平均值 | 76.53 | 8 | 75.71 | 49.46 | 4.73 |
表4中，As4P10表示共培养基中As浓度为400μM、Picloram为10mg/l，As2P10则表示共培养基中As浓度为200μM、Picloram为10mg/l。
实施例2、共培养中Picloram的浓度对外植体愈伤诱导率、再生频率和最终转化效率的影响
一、遗传转化：
1、重组农杆菌的构建：
方法同实施例1中所述一致，得到重组农杆菌AGL1/pAL154/pAL156。
2、重组菌的培养及接种菌液的制备：
将重组农杆菌AGL1/pAL154/pAL156接种于MG/L培养基(表3)，进行培养，至其对数生长期；离心菌液，弃上清，收集菌体，然后用不含植物凝胶的接种培养基(如表1所示，其中不含Picloram和2，4-D，乙酰丁香酮的浓度为400μM)重悬菌体，使菌液OD600值为1。
3、受体材料和组织培养
本发明以四倍体硬粒小麦cv Stewart的新鲜幼胚(心型胚)作为受体材料。
将四倍体硬粒小麦cv Stewart(来源于国家种质资源库)种植在可控温室条件下，条件为18-20℃/10-14℃(白天/黑夜)，光照为16/8小时(光/暗)，400W钠灯，光强为750μEs-1m-2，湿度为50-70％。取授粉后12-14天的未成熟种子(其中含有心型胚)，在70％乙醇中浸泡30-60s，然后用10％次氯酸钠Bleach(Lever)消毒15min，再用无菌水冲洗3-5次，在无菌条件下分离幼胚，幼胚大小一般为0.8-1.5mm。
4、接种
将步骤3获得的新鲜剥离的幼胚盾片向上接种在含有植物凝胶的接种培养基上(如表1所示，其中乙酰丁香酮的浓度为400μM，Picloram的浓度与下述共培养培养基中Picloram的浓度相同)，然后向其中倒入步骤2获得的接种菌液8ml，使幼胚浸泡在步骤2获得的接种菌液中，再向其中加入60ul 1％(体积百分比)表面活性剂(Silwet-77)(Lehle seeds，USA)至其终浓度为0.015％(体积百分含量)，然后在黑暗条件下浸泡1h。记录接种的胚的数目(即表5中的“接种胚数”)。
5、共培养
共培养：将侵染后的外植体转移到共培养培养基上，然后在24℃条件下暗培养3天。共培养的培养基如表1所示(其中，Picloram的浓度设为以下3个：2mg/L、4mg/L、10mg/L，乙酰丁香酮的浓度为400μM)。
6、诱导培养
将共培养3天后的外植体转移到诱导培养基中，然后在24℃暗培养3周，形成愈伤组织。诱导培养基的组成如表1所示(其中，特美汀的浓度为150mg/L，Picloram的浓度为2mg/l)。Timentin的作用是控制农杆菌的生长。统计形成愈伤组织的胚的数目(即表5中的“诱导愈伤”)，并计算诱导率，诱导率的计算公式为：诱导率＝“诱导愈伤”/“接种胚数”。
7、再生培养
将诱导培养形成的愈伤组织转移到含有150mg/lTimentin的再生培养基(RDZ)中，然后在24℃、光照强度750μEs-1m-2、光照时间16h/d的条件下培养3周，得到再生苗，统计产生再生苗的愈伤数目(即表5中的“再生数”)和再生频率。再生培养基的组成如表2所示，再生频率的计算公式如下：再生频率＝“再生数”/“接种胚数”。
8、筛选培养与壮苗培养：
一次筛选：将再生苗转移到含有150mg/l Timentin的筛选培养基(RPPT)中，在24℃、光照强度750μEs-1m-2、光照时间16h/d的条件下培养3周，筛选得到存活苗。筛选培养基的组成如表2所示，其中Glufosinate ammonium(PPT)的浓度为2.5mg/l。
二次筛选：将一次筛选得到的存活苗再进行一次筛选，筛选培养基中PPT浓度为4.0mg/l，方法同第一次筛选相同。
壮苗培养：
将经过二筛的存活植株，转移到恢复培养基上进行壮苗培养2周。恢复培养基的组成如表2(其中，Timentin的浓度为150mg/l)。
9、移栽
将经过两轮PPT筛选仍然存活的植株，壮苗培养1-2周后移栽到温室土钵中，存活植株的生长状况较好。
二、阳性植株鉴定
(一)GUS瞬时表达率的检测
分别在接种后的第6天和第20天(以接种当天计作第1天)进行GUS基因瞬时表达情况检测。统计GUS表达胚数目和GUS瞬时表达率。GUS瞬时表达频率＝GUS表达胚数/“接种胚数”)。
乙酰丁香酮在接种和共培养基中浓度为400uM、Picloram在共培养基中浓度为10mg/L时的检测结果如图1中的B、D所示。B表示农杆菌接种后第6天的检测结果，D表示第20天的检测结果。
(二)T-DNA转移效率的检测
T-DNA转移效率是在农杆菌接种后第6天进行检测的。
T-DNA转移效率的计算公式：T-DNA转移效率＝Gus Loci/“接种胚数”。(T-DNA转移效率统计是基于每个处理中接种胚具有GUS表达位点的平均数)
(三)标记基因的检测
1、bar基因PCR检测：
扩增bar基因的引物序列如下：P1：5‘-GTCTGCACCATCGTCAACC-3’，P2：5‘-GAAGTCCAGCTGCCAGAAAC-3’；以实验一中筛选得到的抗性苗的叶片基因组DNA为模板，用上述引物进行PCR扩增，扩增产物用琼脂糖凝胶电泳进行检测，同时以未转入任何载体的植株作为对照。结果如图4所示(M：DNA Marker，CK+：pAL156质粒，CK：未转化植株，1：水，2：X015-1-2，3：X015-1-3，4：X015-1-5，5：X015-1-7，6：X015-2-6，7：X015-2-8，8：H027-1-1，9：H027-3-10；2-9表示阳性转基因植株)，扩增产物大小为444bp左右，与bar基因的长度符合，表明扩增产物为目的基因。统计阳性植株数目(即表5中的“PCR BAR”)。
2、GUS基因的表达检测：
将存活苗的胚状体、幼芽、叶片和小花等在X-Gluc缓冲液中，37℃培养过夜，检测GUS的表达。检测GUS基因表达的方法如文献(Jefferson RA(1987)Assayingchimeric genes in plants：the GUS gene fusion system.Plant Mol Biol Rep5：387-405)中所述。对存活苗的叶子进行GUS基因表达检测。
结果如图3所示，表明GUS基因在存活苗的叶子正常表达。
统计阳性植株数目(即表5中的“叶片GUS表达阳性”)。
3、UidA基因PCR检测：
扩增UidA基因的引物序列如下：
P3：5‘-AGTGTACGTATCACCGTTTGTGTGAAAC-3’，P4：5‘ATCGCCGCTTTGGACATACCATCCGTA-3’，以抗性苗叶片的基因组DNA为模板，用上述引物进行PCR扩增，扩增产物用琼脂糖凝胶电泳进行检测，结果如图5所示((M：DNA Marker，CK+：pAL156质粒，CK：未转化植株，1：水，2：X015-1-2，3：X015-1-3，4：X015-1-5，5：X015-1-7，6：X015-2-6，7：X015-2-8，8：H027-1-1，9：H027-3-10；2-9表示转基因阳性植物)，扩增产物大小为1051bp左右，与UidA基因的长度符合，表明扩增产物为目的基因。
统计阳性植株数目(即表5中的“PCR UidA”)。
4、转基因植株的Southern Blot检测
利用UidA基因的PCR扩增产物做杂交探针，采用Promega公司Primc-a-GeneLabeling System试剂盒进行探针标记，α-32P-dCTP购自北京亚辉生物公司。
选择PCR检测呈阳性的植株，提取基因组DNA，取30ug进行BglII酶切处理，1％的琼脂糖电泳小时后，转至Hybond+尼龙膜，按Xia等(Lanqin Xia，Sandui Guo.2001.Integration and inheritance stability of Bt toxin gene in the bivalentinsect-resistant transgenic cotton plants.Chinese Science Bulletin，46(16)：1372-1375)方法进行Southern杂交。洗膜后，压磷屏24h，扫屏10分钟左右进行杂交信号检测。
结果如图6所示，转基因植株与阳性对照一样，得到大于4092bp以上的杂交条带，而非转基因植株无这些条带，证实外源基因已整合到受体植株的基因组中(图6)。图6中，1、C023-3-1；2、H027-4-3；3、H028-6-4；5、X015-2-1；9、非转基因对照；10、阳性对照(该阳性对照为pAL156的BglII酶切产物)；M、1kb Marker；1、2、3和5为转基因植株。
将bar或UidA基因PCR检测为阳性的存活苗认为是阳性转化苗。统计阳性转化苗数目和最终转化效率。最终转化效率的计算公式为：最终转化效率＝“阳性转化苗”数目/“接种胚数”。
表5.共培养基中Picloram的浓度对接种农杆菌后外植体诱导愈伤率、再生频率和最终转化效率的影响
| 实验批次 | 处理 | GUS瞬时表达率(％) | T-DNA转移效率 | 接种胚数 | 诱导愈伤 | 诱导率(％) | 再生数 | 再生频率(％) | 叶片GUS表达阳性 | PCRUidA | PCRBAR | 最终转化效率(％) |
| C023-3 | As4P2 | 100 | 13 | 113 | 75 | 66.37 | 45 | 39.82 | 4 | 4 | 4 | 3.54 |
| C022-4 | As4P2 | 100 | 15 | 107 | 70 | 65.70 | 61 | 57.01 | 1 | 1 | 0.93 | |
| C023-1 | As4P2 | 100 | 11 | 104 | 73 | 70.19 | 25 | 24.04 | 3 | 4 | 4 | 3.85 |
| AVE | 67.42 | AVE | 40.29 | AVE | 2.77 | |||||||
| H025-1 | As4P4 | 100 | 21 | 59 | 44 | 74.58 | 33 | 55.93 | 6 | 6 | 6 | 10.17 |
| H026-3 | As4P4 | 73 | 57 | 78.08 | 47 | 63.97 | 6 | 7 | 7 | 9.59 | ||
| H026-6 | As4P4 | 100 | 19 | 52 | 35 | 67.31 | 30 | 57.31 | 1 | 1 | 1 | 1.92 |
| H027-1 | As4P4 | 100 | 11 | 73 | 56 | 76.71 | 39 | 53.42 | 1 | 1 | 1 | 1.37 |
| H028-6 | As4P4 | 60 | 40 | 66.67 | 28 | 46.67 | 4 | 4 | 4 | 6.67 | ||
| AVE | 72.67 | AVE | 55.46 | AVE | 5.94 | |||||||
| C022-1 | As4P10 | 84 | 72 | 85.71 | 56 | 66.67 | 2 | 2 | 2 | 2.38 | ||
| H026-5 | As4P10 | 100 | 15 | 84 | 71 | 84.52 | 49 | 58.09 | 2 | 4 | 4 | 4.76 |
| H025-3 | As4P10 | 64 | 39 | 60.94 | 28 | 43.75 | 3 | 3 | 3 | 4.69 | ||
| H027-3 | As4P10 | 87 | 82 | 94.25 | 65 | 74.71 | 5 | 5 | 5 | 5.75 | ||
| H027-4 | As4P10 | 88 | 78 | 88.64 | 66 | 75.00 | 2 | 3 | 3 | 3.41 | ||
| H027-5 | As4P10 | 83 | 74 | 89.16 | 58 | 69.88 | 4 | 4 | 5 | 6.02 | ||
| H027-6 | As4P10 | 86 | 84 | 97.67 | 50 | 58.14 | 3 | 4 | 4 | 4.65 | ||
| C024-2 | As4P10 | 98 | 72 | 73.47 | 57 | 57.76 | 3 | 4 | 4 | 4.08 | ||
| C024-4 | As4P10 | 102 | 94 | 92.16 | 50 | 49.02 | 10 | 11 | 12 | 11.76 | ||
| Cll-2 | As4P10 | 62 | 52 | 83.87 | 31 | 50.00 | 3 | 3 | 3 | 4.84 | ||
| X015-1 | As4P10 | 106 | 96 | 90.57 | 45 | 42.45 | 13 | 13 | 13 | 12.26 | ||
| X015-2 | As4P10 | 100 | 19 | 98 | 70 | 71.43 | 40 | 40.82 | 11 | 11 | 11 | 11.22 |
| AVE | 84.37 | AVE | 57.19 | AVE | 6.32 |
注：表5中，As4P2、As4P4和As4P10分别表示共培养基中As浓度为400μM、Picloram分别为2、4和10mg/l。
结果如表5所示。当共培养基中As浓度为400uM、Picloram的浓度分别为2mg/l、4mg/l和10mg/l时，平均诱导愈伤率分别为67.42±2.4％、72.67±5.3％和84.37±10.6％；平均再生频率为40.29±16.49％、55.46±6.27％和57.19±12.3％；平均转化频率为2.77±1.6％、5.94±4.1％和6.32±3.4％。
共培养培养基中和诱导培养基中Picloram的浓度分别为2、4、10mg/l和2.0mg/l时，幼胚愈伤组织的诱导频率和再生频率比较如图2所示。
因此，通过本实验得出，提高接种培养基中的As浓度和共培养基中Picloram的浓度，可大大提高硬粒小麦幼胚的最终转化效率。同时也表明，本发明已经建立了高效的硬粒小麦cv Stewart的农杆菌遗传转化体系。
Claims (13)
1.一种转化四倍体硬粒小麦Stewart的方法，包括如下步骤：用目的农杆菌侵染四倍体硬粒小麦Stewart的幼胚，再进行共培养，将目的基因导入小麦Stewart的幼胚；所述目的农杆菌为将目的基因导入根癌农杆菌菌株AGL1得到的；
所述幼胚为授粉12-14天后的心型胚；
所述侵染包括如下步骤：将所述幼胚盾片朝上放置于接种培养基上，再向其中倒入所述目的农杆菌菌液，在黑暗条件下浸泡0.5-3小时；所述接种培养基中含有乙酰丁香酮，乙酰丁香酮在接种培养基中的浓度为400μM；
所述共培养的方法包括如下步骤：将所述侵染后的幼胚置于共培养培养基中，在22-25℃的温度下暗培养1-3天；所述共培养培养基中包括终浓度为10mg/L的氨氯吡啶酸和400μM的乙酰丁香酮。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述侵染步骤中，在黑暗条件下浸泡的时间是1小时。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述共培养的时间为3天。
4.一种培育四倍体硬粒小麦Stewart的转基因小麦的方法，包括如下步骤：用权利要求1-3中任一所述方法将目的基因导入四倍体硬粒小麦Stewart的幼胚中，再进行诱导培养、再生培养、筛选培养，得到转基因小麦。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述诱导培养包括如下步骤：将所述共培养后的幼胚置于诱导培养基中，在22-25℃温度下暗培养1-4周，得到愈伤组织；所述诱导培养基中包括终浓度为150-170mg/L的特美汀和终浓度为2-6mg/l的氨氯吡啶酸。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：在所述诱导培养基中氨氯吡啶酸的终浓度为2mg/L；所述特美汀的浓度为150mg/L；所述诱导培养的时间为3周。
7.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于：所述再生培养包括如下步骤：将所述愈伤组织置于再生培养基中，在温度为22-25℃、光照强度为700-800μEs-1m-2、光照时间为14-18h/d的条件下培养2-4周，得到再生苗；所述再生培养基中包括终浓度为150-170mg/l的特美汀。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：在所述再生培养中，所述光照强度为750μEs-1m-2，所述光照时间为16h/d，所述培养的时间为3周；所述特美汀的浓度为150mg/l。
9.根据权利要求4-6中任一所述的方法，其特征在于：所述目的基因是通过重组载体导入根癌农杆菌AGL1中的。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：所述筛选培养包括如下步骤：将所述再生苗置于筛选培养基中，在温度为22-25℃、光照强度为700-800μEs-1m-2、光照时间为14-18h/d的条件下培养2-4周，得到存活植株；所述筛选培养基中包括终浓度为2-6mg/L的草丁膦和终浓度为150-170mg/l的特美汀。
11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于：在所述筛选培养中，所述光照强度为750μEs-1m-2；所述光照时间为16h/d；所述培养的时间为3周；所述草丁膦的终浓度为2.5-4mg/L；所述特美汀的终浓度为150mg/l。
12.根据权利要求10所述的方法，其特征在于：所述方法还包括如下步骤：将所述存活植株移至恢复培养基中，在温度为22-25℃、光照强度为700-800μEs-1m-2、光照时间为14-18h/d的条件下培养2-4周；所述恢复培养基中包括终浓度为150-170mg/l的特美汀。
13.根据权利要求12所述的方法，其特征在于：在所述恢复培养中，所述光照强度为750μEs-1m-2，所述光照时间为16h/d，所述培养的时间为3周；特美汀的终浓度为150mg/l。
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