CN1307312C

CN1307312C - 四倍体刺槐转基因及组培快繁方法

Info

Publication number: CN1307312C
Application number: CNB2004100242083A
Authority: CN
Inventors: 夏阳; 梁慧敏; 孙仲序; 王太明; 陈受宜
Original assignee: Shandong Academy of Forestry
Current assignee: Shandong Academy of Forestry
Priority date: 2004-05-25
Filing date: 2004-05-25
Publication date: 2007-03-28
Anticipated expiration: 2024-05-25
Also published as: CN1582641A

Abstract

本发明公开一种四倍体刺槐转基因及组培快繁方法，由以下步骤组成：将四倍体刺槐当年生新梢的茎段，消毒后经启动培养基、诱导培养基培养，得到的愈伤组织，经含有双元载体pBin438的根癌农杆菌LBA4404菌系转基因处理后，再经分化培养和选择培养获得的Kan抗性植株，经分子检测筛选出转化植株，转入生根培养基，经过驯化炼苗后，栽入大田。本发明的方法为农杆菌介导的目的基因在木本植物上的转化及包括丛生芽分化、生根和移栽等组培快繁技术提供了依据。

Description

四倍体刺槐转基因及组培快繁方法

(一)技术领域

本发明涉及四倍体刺槐的繁育方法，尤其涉及对四倍体刺槐进行组培快繁和基因转化的方法，属于植物基因工程领域或农业生物技术领域。

(二)背景技术

由于抗盐耐旱植物材料的缺乏，特别是乔木树种的缺乏，严重制约了北方盐碱干旱地区生态工程建设和农村经济发展。四倍体刺槐是韩国通过染色体加倍育成的刺槐新品种，除保持普通刺槐的优良特点外(抗逆性强，适宜多种气候及土壤条件，木材坚硬，用途广，花为优良的蜜源植物，根有根瘤菌，能改善土壤)，还具有叶片大、蛋白质含量高、树体矮化等优良特性，如能提高其抗盐耐旱性，对于盐碱干旱地区生态和经济建设具有重要意义。

自1981年从菠菜分离和部分纯化获得甜菜碱醛脱氢酶基因(BADH)后，BADH基因工程日益受到重视。Manabu等将来源于大麦的BADH基因转入烟草，在渗透胁迫下，BADH量增加，酶活性也成倍增加。刘风华等利用农杆菌方法转入到草莓和烟草中、郭北海等和李银心等将BADH基因分别转入小麦、豆瓣菜上，得到的转基因植株的耐盐性也有一定提高。但至今尚未见到BADH基因在木本植物上的转化报道。关于刺槐的转基因技术研究，Davis等将种子苗的下胚轴接种根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)，对植株DNA进行Southern分析表明刺槐是农杆菌的宿主植物；在受伤子叶上接种携带双元载体pGA472的根癌农杆菌A281，结果子叶产生抗卡那霉素的愈伤组织，并检测证明NPT II基因顺序整合到刺槐基因组上；Han将下胚轴接种到含发根农杆菌R1601的培养基上，检测表明T-DNA整合到了基因组中，并且导入基因得到了表达(皱叶和大量根的产生)。但是，到目前为止，尚未有具有生产意义的目的基因导入刺槐。而四倍体刺槐是仅限于带腋芽的茎段进行组培扩繁的报道。

(三)发明内容

针对上述不足，本发明要解决的问题是提供一种进行四倍体刺槐农杆菌法介导目的基因转化，并进行转化植株的组培快繁的方法。

为实现上述目的，本发明的技术方案采用如下步骤：

(1)将四倍体刺槐当年生新梢的茎段，消毒后接种在启动培养基中，20天后转接到愈伤组织诱导培养基中，得到的愈伤组织，经如下含有双元载体pBin438的根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)LBA4404菌系转基因处理后，再接种到分化培养基中形成丛生芽；

上述MS培养基的组成为：KNO₃1900mg·L^-1，NH₄NO₃1650mg·L^-1，MgSO₄370mg·L^-1，KH₂PO₄170mg·L^-1，CaCl₂·2H₂O440mg·L^-1，MnSO₄·4H₂O22.3mg·L^-1，ZnSO₄·7H₂O8.6mg·L^-1，H₃BO₃6.2mg·L^-1，KI0.83mg·L^-1，NaMoO₄·2H₂O0.25mg·L^-1，CuSO₄·5H2O0.025mg·L^-1，CoCl₂·6H₂O0.025mg·L^-1，Na₂-EDTA 37.3mg·L^-1，FeSO₄·7H₂O27.8mg·L^-1，甘氨酸2.0mg·L^-1，盐酸噻胺0.1mg·L^-1，盐酸比哆醇0.5 mg·L^-1，烟酸0.5mg·L^-1，肌醇100mg；

上述启动培养基的组成为：MS培养基、6-BA 0.2～1.5mg·L^-1、NAA 0.08～2mg·L^-1、蔗糖25～35g·L^-1、琼脂6～8g·L^-1，加琼脂之前调节pH值为pH值5.8；

上述诱导培养基的组成为：MS培养基、KT 1.0～5 mg·L^-1、NAA 0.5～2mg·L^-1、蔗糖25～35g·L^-1、琼脂6～8g·L^-1，加琼脂之前调节pH值为pH值5.8；

上述分化培养基的组成为：MS培养基、IBA 0.2～1.5mg·L^-1、6-BA 2.0～4mg·L^-1、蔗糖25～35g·L^-1、琼脂6～8g·L^-1，加琼脂之前调节pH值为5.8；

上述培养条件为：昼温度25℃，夜温度18℃，光照强度40umol.m^-2.s^-1，光照时间14h·d^-1；

(2)挑选上述根癌农杆菌单菌落接种于含有卡那霉素(kanamycin，Kan)的YEB液体培养基中，25-34℃，160-220rin/m条件下，培养18～26小时，转接于无抗菌素的YEB培养基中培养，菌液在离心后，再加入适量无菌MS液体培养基稀释至OD₆₀₀0.3～0.7；

上述YEB培养基的组成为：每升含细菌蛋白胨5g，酵母浸膏1g，牛肉浸膏5g，MgSO₄.7H₂O 0.493 g，pH7.0；

(3)将上述愈伤组织切成小块或薄片，预培养1～5天后，侵染农杆菌菌液4～20分钟；向共培养培养基(即分化培养基)中加入15～40mg·L^-1的乙酰丁香酮(acetosyringone，AS)，培养3～8天后转入分化培养基；10～50天后转入选择培养基选择培养80～120天，继代3～4次得Kan抗性植株；

上述从转入分化培养基开始，加入浓度为400～600mg·L^-1的头孢霉素(cefotaxime，Cef)抑制农杆菌；

上述选择培养基的组成为：分化培养基、卡那霉素(kanamycin，Kan)50～100 mg·L^-1；

(4)将上述获得的Kan抗性植株，经分子检测获得转化植株，如转化植株的丛生芽小苗健壮，可直接生根，如小苗细弱，可转入拔高培养基，经壮苗后转入生根培养基；

上述拔高培养基的组成为：MS培养基、KT 1.0～4.0mg·L^-1、6-BA 0.1～2.0mg·L^-1、蔗糖25～35g·L^-1、琼脂6～8g·L^-1，pH值5.8～6.0；

上述生根培养基的组成为：MS培养基、IBA 1.0～3.0mg·L^-1、蔗糖25～35g·L^-1、琼脂6～8g·L^-1，pH值5.8～6.0；

(5)幼苗在生根培养基中生长30天以后，90％以上都会发育成健壮的生根幼苗，经过驯化炼苗后，栽入大田。

其中，上述步骤(1)所述的含有双元载体pBin438的根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)LBA4404菌系，其载体含有CaMV35s启动子、山波菜的甜菜碱醛脱氢酶基因(BADH)以及一个嵌合的NosNpt-II基因和35sGUS基因。

上述涉及的培养基的配方是：

启动培养基的组成为：MS培养基、6-BA 1.0mg·L^-1、NAA 1.0mg·L^-1、蔗糖30g·L^-1、琼脂7.0g·L^-1，加琼脂之前调节pH值为pH值5.8；

诱导培养基的组成为：MS培养基、KT 2.5mg·L^-1、NAA 1.5mg·L^-1、蔗糖30g·L^-1、琼脂7.0g·L^-1，加琼脂之前调节pH值为pH值5.8；

分化培养基的组成为：MS培养基、IBA 1.0mg·L^-1、6-BA 3.5mg·L^-1、蔗糖30g·L^-1、琼脂7.0g·L^-1，加琼脂之前调节pH值为pH值5.8：上述选择培养基的组成为：分化培养基、卡那霉素(kanamycin，Kan)60mg·L^-1；

拔高培养基的组成为：MS培养基、KT 3.5mg·L^-1、6-BA 1.5mg·L^-1、蔗糖30g·L^-1、琼脂7.0g·L^-1，加琼脂之前调节pH值为pH值5.8；

生根培养基的组成为：MS培养基、IBA 2.0mg·L^-1、蔗糖30g·L^-1、琼脂7.0g·L^-1，加琼脂之前调节pH值为pH值5.8。

上述步骤(2)中，菌液在离心后，再加入适量无菌MS液体培养基稀释至OD₆₀₀0.5。

上述步骤(3)中涉及的愈伤组织经预培养后，侵染农杆菌菌液10分钟。

上述步骤(3)中乙酰丁香酮的加入量为30mg·L^-1。

上述步骤(3)中头孢霉素的加入浓度为500mg·L^-1。

上述步骤(5)中，移栽组培苗时，开始时在温室内打开瓶口，逐渐降低湿度，并增强光照，4～5天后洗净培养基，移入营养钵中，利用间歇喷雾装置保持环境湿度，经过驯化炼苗15-20天后，栽入大田，适当遮荫，成活率可达95％以上。

采用本发明所述的方法可在8～12月之内获得转BADH基因的植株，建立了一个可重复的、转化效率高的林木基因转化技术体系，获得了抗盐性提高的转化植株，并建立了配套的组培快繁育苗技术体系。

(四)附图说明

图1为消毒后的当年生新梢的萌发。

图2为侵染后处于共培养中的愈伤组织。

图3为转基因植株的PCR检测(P-以质粒为模板的阳性对照(1.6kp)：1～4-Kan抗性植株；M-DNA marker；CK-以未转化植株为阴性对照)。

图4为转基因植株的PCR-Southern检测(P-以质粒为模板的阳性对照(1.6kb)，CK-以未转化植株为阴性对照，0-不加任何模板DNA的空白对照，1～5-转化株系)。

图5为5‰NaCl胁迫下转基因(左)和对照(右)丛生芽的分化。

图6为5‰NaCl胁迫下转基因(左)和对照(右)小苗生长情况。

图7为Kan抗性小苗的分化快繁情况。

图8为进行生根培育的分化苗。

图9为移栽成活的转基因小苗。

图10为刚移入大田的转基因植株。

图11为大田移栽成功的转基因小苗。

图12为Kan筛选120天后存活的抗性单芽苗。

(五)具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步说明：

实施例1：

植物材料为韩国引进的饲用型四倍体刺槐优良品种。外植体采自田间优株当年生新梢的带腋芽茎段，用自来水冲洗，70％酒精消毒，无菌水冲洗3-5次，再用升汞溶液消毒，无菌水冲洗5次，接种在启动培养基中，12天后茎段腋芽开始萌发，20天发出嫩梢，作为愈伤组织的诱导材料。

其中，启动培养基组成为MS+6-BA 0.3mg·L^-1+NAA 1.5mg·L^-1；愈伤组织诱导培养基是：MS+KT 1.5mg·L^-1+NAA 1.5mg·L^-1；分化培养基是：MS+IBA 1.0mg·L^-1+6-BA 3.5mg·L^-1。MS培养基组成为：KNO₃ 1900mg·L^-1，NH₄NO₃ 1650mg·L^-1，MgSO₄ 370mg·L^-1，KH₂PO₄ 170mg·L^-1，CaCl₂·2H₂O 440mg·L^-1，MnSO₄·4H₂O 22.3mg·L^-1，ZnSO₄·7H₂O8.6mg·L^-1，H₃BO₃6.2mg·L^-1，KI0.83mg·L^-1，NaMoO₄·2H₂O 0.25mg·L^-1，CuSO₄·5H₂O 0.025mg·L^-1，CoCl₂·6H₂O0.025mg·L^-1，Na_2-EDTA 37.3mg·L^-1，FeSO₄·7H₂O 27.8mg·L^-1，甘氨酸2.0mg·L^-1，盐酸噻胺0.1mg·L^-1，盐酸比哆醇0.5mg·L^-1，烟酸0.5mg·L^-1，肌醇100mg；

各培养基蔗糖浓度是30g·L^-1，琼脂6.0g·L^-1，pH值5.8。

挑选携带BADH基因的农杆菌单菌落接种于含有Kan的YEB液体培养基中，培养22小时(25℃，160rin/m)，转接于无抗菌素的YEB培养基中培养，菌液在离心后，再加入适量无菌MS液体培养基稀释至OD₆₀₀0.4。将愈伤组织切成小块，预培养时间1天后侵染农杆菌菌液4分钟；共培培养基中加入30mg·L^-1的AS，培养6天后转入分化培养基；30天后转入选择培养基(分化培养基+Kan 50mg·L^-1)，继代3-4次，选择80天；从转入分化培养基开始，加入浓度为600mg·L^-1的Cef抑制农杆菌。

对上述方法获得的转基因植株进行PCR和PCR-Southern检测，植物基因组DNA的提取采用SDS法，PCR扩增所用引物：

1：5′-AGAATGGCGTTCCCAATTCCTGCTC-3′，

2：5′-TTCAAGGAGACTTGATCCATCCCCA-3′；

25μlPCR反应体系：模板DNA 2μl，2种引物各0.4μmol，dNTP各0.1mmol，0.5U Taq酶95℃预变性10分钟，然后依次在93.5℃变性1分钟、58℃复性1分钟、72℃延伸1.5分钟，循环30次，最后在72℃延伸10分钟。取扩增产物10μl在1.0％的琼脂糖凝胶上进行电泳，GeneGenius全自动凝胶成像分析系统观察结果并照相。在凝胶电泳上，转化植株小苗扩增出了特异条带，与阳性对照扩增出的特异条带一致，阴性对照(未转化植株)没有扩增出任何条带，Kan抗性小苗的PCR阳性检测率为25％左右，表明外源基因已经整合到植株的基因组DNA中。

将分子检测得到的转基因植株的愈伤组织块(见图5)和分化20天的小苗(高2cm左右)(见图6)分别接种到含有不同NaCl浓度(2‰、3‰、4‰、5‰、6‰、7‰、8‰)的分化培养基上，每处理重复5次(瓶)，每重复(瓶)3个愈伤组织(或抗性小苗)，经20天时间的培养后，观察到转化植株的NaCl抗性比未转化植株提高2～3‰。

将获得转化植株分化增殖后(见图7)，转入拔高培养基MS+KT 3.5mg·L^-1+6-BA1.5mg·L^-1，经壮苗后转入生根培养基。幼苗在生根培养基MS+IBA 1.0mg·L^-1中生长30天以后，90％以上都会发育成健壮的生根幼苗(见图8)。在移栽组培苗时，开始时在温室内打开瓶口，逐渐降低湿度，并增强光照，4～5天后洗净培养基，移入营养钵中，注意保持环境湿度(最好利用间歇喷雾装置)，经过驯化炼苗15-20天后(见图9)，栽入大田，适当遮荫(见图10)，成活率达95％以上(见图11)。

实施例2：

四倍体刺槐外植体(新梢茎段)，消毒后接种在启动培养基MS+6-BA1.0mg·L^-1+NAA 1.0mg·L^-1中，12天后茎段腋芽开始萌发，15天发出嫩梢，再将嫩梢接种到愈伤组织诱导培养基MS+KT 1.5mg·L^-1+NAA 2.0mg·L^-1中，获得的愈伤组织再转接到分化培养基MS+IBA 1.5mg·L^-1+6-BA 2.5mg·L^-1中。各培养基蔗糖浓度是25g·L^-1，琼脂7.0g·L^-1，pH值5.8。

挑选携带BADH基因的农杆菌单菌落接种于含有Kan的YEB液体培养基中，培养过夜(25℃，180rin/m)，转接于无抗菌素的YEB培养基中培养，菌液在离心后，再加入适量无菌MS液体培养基稀释至OD₆₀₀0.5。将愈伤组织切成薄片，预培养时间3天后侵染农杆菌菌液10分钟；共培培养基中加入15mg·L^-1的AS，培养5天后转入分化培养基；30天后转入选择培养基〔分化培养基+Kan 60mg·L^-1〕，继代3-4次，选择120天(见图12)；从转入分化培养基开始，加入浓度为400mg·L^-1的Cef抑制农杆菌。

获得的Kan抗性植株经分子检测证实获得了转化植株，将转化株系转入生根培养基MS+IBA 2.0mg·L^-1中生长33天以后，发育成健壮的生根幼苗。在炼苗移栽后栽入大田，获得了转化苗木。

实施例3：

四倍体刺槐外植体(新梢茎段)，消毒后接种在启动培养基MS+6-BA 1.5mg·L^-1+NAA 0.5mg·L^-1中，15天后茎段腋芽开始萌发，18天发出嫩梢，将嫩梢接种到愈伤组织诱导培养基MS+KT 2.5mg·L^-1+NAA 1.5mg·L^-1中获得愈伤组织，再转接到分化培养基MS+IBA 0.5mg·L^-1+6-BA 3.5mg·L^-1中，。各培养基蔗糖浓度是35g·L^-1，琼脂8.0g·L^-1，pH值5.8。

挑选携带BADH基因的农杆菌单菌落接种于含有Kan的YEB液体培养基中，培养过夜(30℃，190rin/m)，转接于无抗菌素的YEB培养基中培养，菌液在离心后，再加入适量无菌MS液体培养基稀释至OD₆₀₀0.6。将愈伤组织切成薄片，预培养时间5天后侵染农杆菌菌液12分钟；共培培养基中加入35mg·L^-1的AS，培养4天后转入分化培养基；30天后转入选择培养基〔分化培养基+Kan 70mg·L^-1〕，继代3-4次，选择120天；从转入分化培养基开始，加入浓度为500mg·L^-1的Cef抑制农杆菌。

获得的Kan抗性植株经分子检测证实获得了转化植株，将转化株系转入生根培养基MS+IBA 3.0mg·L^-1中生长30天以后，发育成健壮的生根幼苗。在炼苗移栽后栽入大田，获得了转化苗木。

通过上述3个实例，经PCR和PCR-Southern检测，本项基因转化方法已获得70个转BADH基因的株系。

NaCl抗性试验表明，转基因植株丛生芽的分化在6‰～7‰NaCl胁迫下未受到影响，在8‰时还可基本正常分化，而未转化植株在5‰分化即受到明显影响，在8‰时基本停止分化，转化植株的分化对NaCl的相对抗性提高3‰～4‰。未转化植株的生长在3‰NaCl胁迫下即出现受害症状，表现为生长量减少，并随NaCl浓度的提高，出现嫩枝、叶片的黄化、干枯和死亡现象，生长量明显降低；而转基因植株丛生芽生长在6‰时生长才出现明显受害症状，说明其NaCl的相对抗性提高了2‰～3‰。转化植株能否稳定遗传是其开发利用的重要前提。本试验对初次kan选择、PCR检测和耐盐性实验的植株，在继代培育6～8代后，又进行了二次Kan选择(80天)、PCR检测和耐盐抗性实验，结果表明70％的株系表现稳定遗传特性(即Kan选择未出现黄化现象、PCR检测有特异条带和耐盐性提高)；20％的株系分化的部分丛生苗有黄化现象(疑为嵌合体)，现正在提纯；10％的株系明显黄化，已被淘汰。上述结果说明，经过连续选择淘汰，完全可以获得遗传稳定的转化株系。

本方法建立了农杆菌介导的高效、可重复的林木基因转化方法，已成功的将甜菜碱醛脱氢酶基因(BADH)整合到四倍体刺槐基因组中，获得了抗盐性提高的转化植株，现已成功移栽到大田，获得了大量转化植株；建立了转化植株的组培快繁、温室炼苗、营养钵移栽、大田成苗的全部技术。此项研究申报国家招标项目“国家转基因植物研究与产业化专项”获得通过，现正在进行产业化开发，在生产上极有推广利用价值。

Claims

1、一种四倍体刺槐转基因及组培快繁方法，由以下步骤组成：

(1)将四倍体刺槐当年生新梢的茎段，消毒后接种在启动培养基中，20天后转接到愈伤组织诱导培养基中，得到的愈伤组织，经如下含有双元载体pBin438的根癌农杆菌LBA4404菌系转基因处理后，再接种到分化培养基中形成丛生芽；

上述启动培养基的组成为：MS培养基、6-BA0.2～1.5mg·L^-1、NAA0.08～2mg·L^-1、蔗糖25～35g·L^-1、琼脂6～8g·L^-1，pH值5.8；

上述诱导培养基的组成为：MS培养基、KT1.0～5mg·L^-1、NAA0.5～2mg·L^-1、蔗糖25～35g·L^-1、琼脂6～8g·L^-1，pH值5.8；

上述分化培养基的组成为：MS培养基、IBA0.2～1.5mg·L^-1、6-BA2.0～4mg·L^-1、蔗糖25～35g·L^-1、琼脂6～8g·L^-1，pH值为5.8；

上述MS培养基的组成为：KNO₃1900mg·L^-1，NH₄NO₃1650mg·L^-1，MgSO₄370mg·L^-1，KH₂PO₄170mg·L^-1，CaCl₂·2H₂O440mg·L^-1，MnSO₄·4H₂O22.3mg·L^-1，ZnSO₄·7H₂O8.6mg·L^-1，H₃BO₃6.2mg·L^-1，KI0.83mg·L^-1，NaMoO₄·2H₂O0.25mg·L^-1，CuSO₄·5H₂O0.025mg·L^-1，CoCl₂·6H₂O0.025mg·L^-1，Na_2-EDTA37.3mg·L^-1，FeSO₄·7H₂O27.8mg·L^-1，甘氨酸2.0mg·L^-1，盐酸噻胺0.1mg·L^-1，盐酸比哆醇0.5mg·L^-1，烟酸0.5mg·L^-1，肌醇100mg；

(2)挑选上述根癌农杆菌单菌落接种于含有卡那霉素的YEB液体培养基中，25-34℃，160-220rin/m条件下，培养18～26小时，转接于无抗菌素的YEB培养基中培养，菌液在离心后，再加入无菌MS液体培养基稀释至OD₆₀₀0.3～0.7；

上述YEB培养基的组成为：每升含细菌蛋白胨5g，酵母浸膏1g，牛肉浸膏5g，MgSO₄.7H₂O0.493g，pH7.0；

(3)将上述愈伤组织切成小块或薄片，预培养1～5天后，侵染农杆菌菌液4～20min；向共培养培养基即分化培养基中加入15～40mg·L^-1的乙酰丁香酮，培养3～8天后转入分化培养基；10～50天后转入选择培养基选择培养80～120天，继代3～4次得Kan抗性植株；

上述从转入分化培养基开始，加入浓度为400～600mg·L^-1的头孢霉素抑制农杆菌；

上述选择培养基的组成为：分化培养基、卡那霉素50～100mg·L^-1；

(4)将上述获得的Kan抗性植株，经分子检测获得转化植株，如转化植株的丛生芽小苗健壮，直接生根，如小苗细弱，转入拔高培养基，经壮苗后转入生根培养基；

上述拔高培养基的组成为：MS培养基、KT1.0～4.0mg·L^-1、6-BA0.1～2.0mg·L^-1、蔗糖25～35g·L^-1、琼脂6～8g·L^-1，pH值5.8～6.0；

上述生根培养基的组成为：MS培养基、IBA1.0～3.0mg·L^-1、蔗糖25～35g·L^-1、琼脂6～8g·L^-1，pH值5.8～6.0；

(5)幼苗在生根培养基中生长30天以后，90％以上都会发育成健壮的尘根幼苗，经过驯化炼苗后，栽入大田。

2.如权利要求1所述的一种四倍体刺槐转基因及组培快繁方法，其特征在于，步骤(1)所述的含有双元载体pBin438的根癌农杆菌LBA4404菌系，其载体含有CaMV35s启动子、山波菜的甜菜碱醛脱氢酶基因以及一个嵌合的NosNpt-II基因和35sGUS基因。

3.如权利要求1所述的一种四倍体刺槐转基因及组培快繁方法，其特征在于，所述培养基的配方是：

启动培养基的组成为：MS培养基、6-BA1.0mg·L^-1、NAA1.0mg·L^-1、蔗糖30g·L^-1、琼脂7.0g·L^-1，加琼脂之前调节pH值为pH值5.8；

诱导培养基的组成为：MS培养基、KT2.5mg·L^-1、NAA1.5mg·L^-1、蔗糖30g·L^-1、琼脂7.0g·L^-1，加琼脂之前调节pH值为pH值5.8；

分化培养基的组成为：MS培养基、IBA1.0mg·L^-1、6-BA3.5mg·L^-1、蔗糖30g·L^-1、琼脂7.0g·L^-1，加琼脂之前调节pH值为pH值5.8；上述选择培养基的组成为：分化培养基、卡那霉素60mg·L^-1；

拔高培养基的组成为：MS培养基、KT3.5mg·L^-1、6-BA1.5mg·L^-1、蔗糖30g·L^-1、琼脂7.0g·L^-1，加琼脂之前调节pH值为pH值5.8；

生根培养基的组成为：MS培养基、IBA2.0mg·L^-1、蔗糖30g·L^-1、琼脂7.0g·L^-1，加琼脂之前调节pH值为pH值5.8。

4.如权利要求1所述的一种四倍体刺槐转基因及组培快繁方法，其特征在于，所述步骤(2)中，菌液在离心后，再加入适量无菌MS液体培养基稀释至OD₆₀₀0.5。

5.如权利要求1所述的一种四倍体刺槐转基因及组培快繁方法，其特征在于，所述步骤(3)中涉及的愈伤组织经预培养后，侵染农杆菌菌液10min。

6.如权利要求1所述的一种四倍体刺槐转基因及组培快繁方法，其特征在于，所述步骤(3)中乙酰丁香酮的加入量为30mg·L^-1。

7.如权利要求1所述的一种四倍体刺槐转基因及组培快繁方法，其特征在于，所述步骤(3)中头孢霉素的加入浓度为500mg·L^-1。

8.如权利要求1所述的一种四倍体刺槐转基因及组培快繁方法，其特征在于，所述步骤(5)中，移栽组培苗时，开始时在温室内打开瓶口，逐渐降低湿度，并增强光照，4～5天后洗净培养基，移入营养钵中，利用间歇喷雾装置保持环境湿度，经过驯化炼苗15-20天后，栽入大田，适当遮荫，成活率可达95％以上。