CN106399359B - 利用植株幼苗进行遗传转化的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种利用植株幼苗进行遗传转化的方法，包括：将幼苗植株于上胚轴处切断，保留幼苗植株上胚轴至根部部分作为遗传转化材料，其中，该幼苗植株的茎粗达到1mm或以上。本发明操作过程简单；使用的培养基简单、节约资源；获得阳性转化子的工作周期短；获得的阳性转化子易于保存。

Description

利用植株幼苗进行遗传转化的方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种利用植株幼苗进行遗传转化的方法。
背景技术
至今，对于诸如橘类、橙类等植物的遗传转化上，尽管农杆菌介导的外植体遗传转化技术相对成熟，但该技术仍需要对遗传转化后的外植体或进行组织培养生根、或进行微芽嫁接才能获得完整植株，需要较繁琐的操作过程和较长的培养周期。比如，利用柑橘外植体进行遗传转化时，需要较多的组培过程，如转化后的共培养、筛选培养和生根培养(或微芽嫁接)等，操作环节较繁琐、实验条件(不同培养基配制、生长条件控制等)要求高。且遗传转化后获得完整植株约60d，需要周期较长。然而，目前尚没有直接便利快速地在诸如柑橘等幼苗植株上进行遗传转化的有效方法。
发明内容
本发明的一个目的是解决至少上述问题和/或缺陷，并提供至少后面将说明的优点。
本发明还有一个目的是提供一种利用植株幼苗进行遗传转化的方法，创建能直接在柑橘植株上进行的遗传转化技术，能实现避开柑橘外植体遗传转化的组培操作过程、便于转化子保存繁殖及性状观察，在很大程度上节约工作周期和成本。
为此，本发明提供的技术方案为：
一种利用植株幼苗进行遗传转化的方法，包括：将幼苗植株于上胚轴处切断，保留幼苗植株上胚轴至根部部分作为遗传转化材料，其中，该幼苗植株的上胚轴茎粗达到1mm或以上。
优选的是，所述的利用植株幼苗进行遗传转化的方法中，获得所述遗传转化材料后，还包括如下步骤：
利用农杆菌介导的遗传转化方法，将所述遗传转化材料的上胚轴伤口处浸于农杆菌转化液中浸染5～15min，将目的基因转化入所述遗传转化材料中，之后将所述遗传转化材料置于MS固体培养基中光照培养18～30天得到完整植株；
其中，所述农杆菌转化液中农杆菌浓度OD600＝0.8，且农杆菌细胞中含有所述目的基因或所述目的基因的表达载体。
优选的是，所述的利用植株幼苗进行遗传转化的方法中，获得所述幼苗植株的方法包括：取植物种子，将所述植物种子播种于MS固体培养基上暗培养15～25天，之后再光照培养8～12天。
优选的是，所述的利用植株幼苗进行遗传转化的方法中，所述光照培养的光照强度为50μmol/m2s，光照时间为12h/d；
且，所述光照培养和暗培养的培养温度均为26～28℃。
优选的是，所述的利用植株幼苗进行遗传转化的方法中，获得所述完整植株后，还包括如下步骤：
通过筛选，得到转化有所述目的基因的阳性转化子植株。
优选的是，所述的利用植株幼苗进行遗传转化的方法中，所述农杆菌细胞中包含有筛选标记GUS的基因序列，所述筛选标记GUS与所述目的基因序列同时表达。
优选的是，所述的利用植株幼苗进行遗传转化的方法中，所述农杆菌介导中采用的农杆菌为农杆菌EHA105。
优选的是，所述的利用植株幼苗进行遗传转化的方法中，在得到所述阳性转化子植株之后，还包括如下步骤：
将所述阳性转化子植株进行炼苗培养，之后定植于土壤中或接穗嫁接于对应植物砧木上。
优选的是，所述的利用植株幼苗进行遗传转化的方法中，所述植物种子为橘类、橙类、柚类、柠檬、石榴或梨中的任意一种。
优选的是，所述的利用植株幼苗进行遗传转化的方法中，在所述农杆菌介导的遗传转化方法中，在将所述遗传转化材料的上胚轴伤口处浸于农杆菌溶液中浸染5～15min之后，还包括利用脱脂棉吸干所述遗传转化材料上的水分，之后于无菌条件下2～4℃放置20～30min，再然后将所述遗传转化材料和所述脱脂棉共同插入MS固体培养基中暗培养3～7天，最后再将所述MS固体培养基中光照培养18～30天得到所述完整植株。
本发明至少包括以下有益效果：
本发明以幼苗植株上胚轴至根部物质作为遗传转化材料，创建了能直接在柑橘等植物植株上进行的遗传转化技术，能实现避开柑橘等植物外植体遗传转化的组培操作过程、便于转化子保存繁殖及性状观察，在很大程度上节约工作作周期和成本。
并且，本发明仅利用MS培养基即可进行柑橘等植物幼苗植株遗传转化前后的全过程培养，相比于传统遗传转化方法中需要多种培养基的配制，节省物质资源，同时也省时省力，便于实验的操作。
本发明操作过程简单；使用的培养基简单、节约资源；获得阳性转化子的工作周期短；获得的阳性转化子易于保存。
本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。
附图说明
图1为本发明其中一个实施例中柑橘幼苗植物上胚轴伤口处生长出再生芽并构成完整植株的照片；
图2为本发明其中一个实施例中剪取再生芽的部分叶片，利用GUS染色方法检测到部分再生芽叶片呈蓝色(箭头所示)。
具体实施方式
下面结合附图对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不配出一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。
本发明提供一种利用植株幼苗进行遗传转化的方法，包括：将幼苗植株于上胚轴处切断，保留幼苗植株上胚轴至根部部分作为遗传转化材料，其中，该幼苗植株上胚轴切断处的茎粗达到1mm或以上，植株上胚轴切断处距根基部约2cm。
本发明以幼苗植株上胚轴至根部物质作为遗传转化材料，创建了能直接在柑橘等植物植株上进行的遗传转化技术，能实现避开柑橘等植物外植体遗传转化的组培操作过程、便于转化子保存繁殖及性状观察，在很大程度上节约工作作周期和成本。
在上述方案中，作为优选，获得所述遗传转化材料后，还包括如下步骤：
利用农杆菌介导的遗传转化方法，将所述遗传转化材料的上胚轴伤口处浸于农杆菌转化液中浸染5～15min，将目的基因转化入所述遗传转化材料中，之后将所述遗传转化材料置于MS固体培养基中光照培养18～30天得到完整植株；
其中，农杆菌转化液中农杆菌浓度OD600＝0.8，且农杆菌细胞中含有所述目的基因或所述目的基因的表达载体。依照现有的农杆菌介导的遗传转化方法同样可以将外源基因转入该遗传转化材料中。
在上述方案中，作为优选，所述农杆菌细胞中包含有筛选标记GUS的基因序列，所述筛选标记GUS与所述目的基因序列同时表达。这样便于后期阳性转化子的删选，通过GUS染色技术即可快速完成阳性转化子材料的鉴定。
在上述方案中，作为优选，所述农杆菌介导中采用的农杆菌为农杆菌EHA105。
在本发明的其中一个实施例中，作为优选，所述光照培养的光照强度为50μmol/m2s，光照时间为12h/d；
且，所述光照培养和暗培养的培养温度均为26～28℃。
在本发明的其中一个实施例中，作为优选，获得所述完整植株后，还包括如下步骤：
通过筛选，得到转化有所述目的基因的阳性转化子植株。
在上述方案中，作为优选，在得到所述阳性转化子植株之后，还包括如下步骤：
将所述阳性转化子植株进行炼苗培养，之后定植于土壤中或接穗嫁接于对应植物砧木上。保存方法简单。
在本发明的其中一个实施例中，作为优选，获得所述幼苗植株的方法包括：取植物种子，将所述植物种子播种于MS固体培养基上暗培养15～25天，之后再光照培养8～12天。暗培养有利于上胚轴的生长，使其长度更长，便于后期操作。
在本发明的其中一个实施例中，作为优选，所述植物种子为橘类、橙类、柚类、柠檬、石榴或梨中的任意一种。
在本发明的其中一个实施例中，作为优选，在所述农杆菌介导的遗传转化方法中，在将所述遗传转化材料的上胚轴伤口处浸于农杆菌溶液中浸染5～15min之后，还包括利用脱脂棉吸干所述遗传转化材料上的水分，之后于无菌条件下2～4℃放置20～30min，再然后将所述遗传转化材料和所述脱脂棉共同插入MS固体培养基中暗培养3～7天，最后再将所述MS固体培养基中光照培养18～30天得到所述完整植株。将农杆菌溶液和遗传转化材料首先于低温下放置一段时间，然后再置于黑暗环境中一段时间，能够促进农杆菌的转化效率提高、抑制细菌，且能够促进完整植株的快速长成，而将脱脂棉和遗传转化材料共同放置于MS固体培养基中培养，由于脱脂棉的营养水分吸收和贮存作用，能够有效避免植株生长后期营养成分不足和培养基水分缺乏的问题，且材料易得方便，易于实施。
一、试剂、方法和菌株
GUS染色液成分(1mL)：
配制方法：
将N，N-二甲基甲酰胺加入到X-Gluc中，搅拌，直到溶解，再将磷酸盐缓冲液、5mM铁氰化钾和5mM亚铁氰化钾加入到X-Gluc溶液中，混匀，最后加入Triton X-100，混匀备用。
GUS染色：
将剪取的部分叶片浸入GUS染色液中，于37℃黑暗孵育2-24h至蓝色出现，用磷酸缓冲液冲洗叶片，用2％甲醛、0.5％戊二醛、100mM磷酸缓冲液室温固定45min，然后用系列浓度乙醇(50％、70％、100％)漂洗各5min，最后浸泡在75％乙醇中。
MS固体培养基成分(1L)为：NH4NO3 1.65g，KNO3 1.9g，CaCl2·2H2O 0.44g，MgSO4·7H2O 0.37g，KH2PO4 0.17g，KI 0.83mg，H3BO3 6.25mg，MnSO4·4H2O 22.3mg，ZnSO4·7H2O8.65mg，Na2MoO4·2H2O 0.25mg，CuSO4·5H2O 0.025mg，CoCl2·6H2O 0.025mg，FeSO4·7H2O27.8mg，Na2-EDTA·2H2O 37.3mg，蔗糖30g，琼脂粉8g。
转化液(1L)为：NH4NO3 0.825g，KNO3 0.95g，CaCl2·2H2O 0.22g，MgSO4·7H2O0.185g，KH2PO4 0.085g，KI 0.83mg，H3BO3 6.25mg，MnSO4·4H2O 22.3mg，ZnSO4·7H2O8.65mg，Na2MoO4·2H2O 0.25mg，CuSO4·5H2O 0.025mg，CoCl2·6H2O 0.025mg，FeSO4·7H2O27.8mg，Na2-EDTA·2H2O 37.3mg，蔗糖50g。
农杆菌菌株：EHA105
二、传统实验
利用农杆菌遗传转化柑橘外植体的柑橘遗传转化技术已比较成熟，该柑橘遗传转化法主要方案如下：
①取剥去外种皮并用NaClO杀菌消毒后的柑橘种子播种于MS等培养基上培养30d(生长温度保持在26-28℃)左右。在无菌条件下，切取柑橘节间茎段(1cm)、子叶、胚轴(1cm)等外植体。如外植体不是取自于无菌环境，需利用酒精(75％)、次氯酸钠(1％)等先将外植体杀菌消毒后再继续使用。
②在无菌条件下，将外植体在农杆菌溶液(菌浓度OD600：0.5-1.0)中浸染10-20min，用吸水纸吸干外植体表面的菌液于共培养基上暗培养2-5天(生长温度保持在26-28℃)，再移至筛选培养基上光照培养(12h光照/12h黑暗)到生长出再生芽(生长温度保持在26-28℃)。
③剪取再生芽的部分叶片，利用筛选标记(GUS)或特异序列PCR扩增鉴定及测序的方法进一步确定阳性转化子；
④在无菌条件下，切取再生芽(阳性转化子)于生根培养基上培养(12h光照/12h黑暗，生长温度保持在26-28℃)至生根以形成完整植株(约30d)；或在无菌条件下切取0.5cm长的再生芽(阳性转化子)，芽基部削成楔形后插入于暗生长14d的砧木实生苗上胚轴纵切处(约0.2cm深)以制备试管嫁接苗(12h光照/12h黑暗，生长温度保持在26-28℃；约15d后观察成活情况)形成完整植株。
⑤形成的完整植株经过炼苗培养(约20d)后，可直接定植在土壤等生长环境，也可切取其接穗嫁接到土壤等环境生长的砧木上保存繁殖。
上述方法，利用柑橘外植体进行遗传转化，需要较多的组培过程，如转化后的共培养、筛选培养和生根培养(或微芽嫁接)等，操作环节较繁琐、实验条件(不同培养基配制、生长条件控制等)要求高，实验周期长。并且，遗传转化后获得完整植株一般约60d，需要时间较长。
三、依照本发明操作方法
实施例1
一种利用植株幼苗进行遗传转化的方法包括如下步骤：
①取剥去外种皮并用1％NaClO处理10min的柑橘种子(克里迈丁橘)播种于MS盐培养基(pH值5.7)上暗培养约20d，再光照培养(12h光照/12h黑暗)10d。生长温度保持在26-28℃。此时幼苗植株茎粗达到1mm以上，株高大于5cm。
②在无菌条件下，用锐利的刀片在植株上胚轴处横截，留用植株上胚轴切口至根部作为遗传转化材料。将植株留用部分的上胚轴伤口处浸于农杆菌溶液(菌浓度OD600：0.8)中浸染10min，用吸水纸吸干上胚轴伤口处表面的菌液，再将根部插入于MS盐培养基(pH值5.7)上光照培养(12h光照/12h黑暗)，25d左右即可观察到植株上胚轴伤口处生长出的再生芽构成完整植株。
③剪取再生芽的部分叶片，利用筛选标记(GUS)或特异序列PCR扩增鉴定及测序的方法鉴定出阳性转化子；
④阳性转化子经过炼苗培养(约20d)后，可直接定植在土壤等生长环境，也可切取其接穗嫁接到土壤等环境生长的砧木上保存繁殖。
在本实施例中，用锐利的刀片在植株上胚轴处横截，约25d后可观察到植株上胚轴伤口处生长出的再生芽构成完整植株(如图1所示)，产生再生芽的植株约为94.5％(表1)。剪取再生芽的部分叶片，利用GUS染色方法检测到部分再生芽叶片呈蓝色(如图2所示)，表明该再生芽遗传转化成功，平均遗传转化效率约为4.67％(如表1所示)。
表1：柑橘幼苗植株转化方法的再生芽和阳性转化子数量统计
实施例2
一种利用植株幼苗进行遗传转化的方法包括如下步骤：
①取剥去外种皮并用1％NaClO处理10min的甜橙(冰糖橙)种子播种于MS固体培养基(pH5.7)上暗培养约15d，再光照培养(12h光照/12h黑暗)12d，光照强度为50μmol/m2s。生长温度保持在26℃。此时幼苗植株茎粗达到1mm以上，株高5cm以上。
②在无菌条件下，用锐利的刀片在植株上胚轴处横截，留用植株上胚轴切口至根部作为遗传转化材料。将植株留用部分的上胚轴伤口处浸于农杆菌转化液(菌浓度OD600：0.8)中浸染5min，用吸水纸吸干上胚轴伤口处表面的菌液，再将根部插入于MS固体培养基(pH值5.7)上光照培养(12h光照/12h黑暗)，25d后即可观察到植株上胚轴伤口处生长出的再生芽构成完整植株。
③剪取再生芽的部分叶片，利用筛选标记(GUS)或特异序列PCR扩增鉴定及测序的方法鉴定出阳性转化子；
④阳性转化子经过炼苗培养(约20d)后，可直接定植在土壤等生长环境，也可切取其接穗嫁接到土壤等环境生长的砧木上保存繁殖。
经实验统计，产生再生芽的植株的效率约为93％，遗传转化效率约为4.9％。
实施例3
一种利用植株幼苗进行遗传转化的方法包括如下步骤：
①取剥去外种皮并用1％NaClO处理10min的柚(菊花芯柚)种子播种于MS固体培养基(pH5.7)上暗培养约25d，再光照培养(12h光照/12h黑暗)12d，光照强度为50μmol/m2s。生长温度保持在26-28℃。此时幼苗植株茎粗达到1mm以上，株高5cm以上。
②在无菌条件下，用锐利的刀片在植株上胚轴处横截，留用植株上胚轴切口至根部作为遗传转化材料。将植株留用部分的上胚轴伤口处浸于农杆菌转化液(菌浓度OD600：0.8)中浸染15min，用吸水纸吸干上胚轴伤口处表面的菌液，再将根部插入于MS固体培养基(pH值5.7)上光照培养(12h光照/12h黑暗)，25d后即可观察到植株上胚轴伤口处生长出的再生芽构成完整植株。
③剪取再生芽的部分叶片，利用筛选标记(GUS)或特异序列PCR扩增鉴定及测序的方法鉴定出阳性转化子；
④阳性转化子经过炼苗培养(约20d)后，可直接定植在土壤等生长环境，也可切取其接穗嫁接到土壤等环境生长的砧木上保存繁殖。
经实验统计，产生再生芽的植株的效率约为91％，遗传转化效率约为4.56％。
实施例4
一种利用植株幼苗进行遗传转化的方法包括如下步骤：
①取剥去外种皮并用1％NaClO处理10min的椪柑(辛女椪柑)种子播种于MS固体培养基(pH5.7)上暗培养约25d，再光照培养(12h光照/12h黑暗)12d，光照强度为50μmol/m2s。生长温度保持在26-28℃。
②在无菌条件下，用锐利的刀片在植株上胚轴处横截，留用植株上胚轴切口至根部作为遗传转化材料。将植株留用部分的上胚轴伤口处浸于农杆菌转化液(菌浓度OD600：0.8)中浸染15min，用吸水纸吸干上胚轴伤口处表面的菌液，再将根部插入于MS固体培养基(pH值5.7)上光照培养(12h光照/12h黑暗)，25d后即可观察到植株上胚轴伤口处生长出的再生芽构成完整植株。
③剪取再生芽的部分叶片，利用筛选标记(GUS)或特异序列PCR扩增鉴定及测序的方法鉴定出阳性转化子；
④阳性转化子经过炼苗培养(约20d)后，可直接定植在土壤等生长环境，也可切取其接穗嫁接到土壤等环境生长的砧木上保存繁殖。
经实验统计，产生再生芽的植株的效率约为97％，遗传转化效率约为4.56％。
实施例5
一种利用植株幼苗进行遗传转化的方法包括如下步骤：
①取剥去外种皮并用1％NaClO处理10min的梨(圆黄)种子播种于MS固体培养基(pH5.7)上暗培养约22d，再光照培养(12h光照/12h黑暗)12d，光照强度为50μmol/m2s。生长温度保持在26℃。
②在无菌条件下，用锐利的刀片在植株上胚轴处横截，留用植株上胚轴切口至根部作为遗传转化材料。将植株留用部分的上胚轴伤口处浸于农杆菌转化液(菌浓度OD600：0.8)中浸染8min，用吸水纸吸干上胚轴伤口处表面的菌液，再将根部插入于MS固体培养基(pH值5.7)上光照培养(12h光照/12h黑暗)，30d后即可观察到植株上胚轴伤口处生长出的再生芽构成完整植株。
③剪取再生芽的部分叶片，利用筛选标记(GUS)或特异序列PCR扩增鉴定及测序的方法鉴定出阳性转化子；
④阳性转化子经过炼苗培养(约20d)后，可直接定植在土壤等生长环境，也可切取其接穗嫁接到土壤等环境生长的砧木上保存繁殖。
经实验统计，产生再生芽的植株的效率约为88％，遗传转化效率约为4.67％。
实施例6
一种利用植株幼苗进行遗传转化的方法包括如下步骤：
①取剥去外种皮并用1％NaClO处理10min的石榴(泰山红)种子播种于MS固体培养基(pH5.7)上暗培养约22d，再光照培养(12h光照/12h黑暗)12d，光照强度为50μmol/m2s。生长温度保持在27℃。
②在无菌条件下，用锐利的刀片在植株上胚轴处横截，留用植株上胚轴切口至根部作为遗传转化材料。将植株留用部分的上胚轴伤口处浸于农杆菌转化液(菌浓度OD600：0.8)中浸染8min，用利用脱脂棉吸干所述遗传转化材料上的水分，之后于无菌条件下4℃放置30min，再然后将所述遗传转化材料所述脱脂棉共同置于MS固体培养基(pH值5.7)中暗培养7天，再光照培养(12h光照/12h黑暗)，18d后即可观察到植株上胚轴伤口处生长出的再生芽构成完整植株。
③剪取再生芽的部分叶片，利用筛选标记(GUS)或特异序列PCR扩增鉴定及测序的方法鉴定出阳性转化子；
④阳性转化子经过炼苗培养(约20d)后，可直接定植在土壤等生长环境，也可切取其接穗嫁接到土壤等环境生长的砧木上保存繁殖。
经实验统计，产生再生芽的植株的效率约为92％，遗传转化效率约为5.23％。
实施例7
一种利用植株幼苗进行遗传转化的方法包括如下步骤：
①取剥去外种皮并用1％NaClO处理10min的柠檬(尤力克)种子播种于MS固体培养基(pH5.7)上暗培养约22d，再光照培养(12h光照/12h黑暗)12d，光照强度为50μmol/m2s。生长温度保持在26℃。
②在无菌条件下，用锐利的刀片在植株上胚轴处横截，留用植株上胚轴切口至根部作为遗传转化材料。将植株留用部分的上胚轴伤口处浸于农杆菌转化液(菌浓度OD600：0.8)中浸染8min，用利用脱脂棉吸干所述遗传转化材料上的水分，之后于无菌条件下2℃放置20min，再然后将所述遗传转化材料和所述脱脂棉共同置于MS固体培养基(pH值5.7)中暗培养3天，再光照培养(12h光照/12h黑暗)，28d后即可观察到植株上胚轴伤口处生长出的再生芽构成完整植株。
③剪取再生芽的部分叶片，利用筛选标记(GUS)或特异序列PCR扩增鉴定及测序的方法鉴定出阳性转化子；
④阳性转化子经过炼苗培养(约20d)后，可直接定植在土壤等生长环境，也可切取其接穗嫁接到土壤等环境生长的砧木上保存繁殖。
经实验统计，产生再生芽的植株的效率约为95％，遗传转化效率约为5.17％。
这里说明的模块数量和处理规模是用来简化本发明的说明的。对本发明的利用植株幼苗进行遗传转化的方法的应用、修改和变化对本领域的技术人员来说是显而易见的。
如上所述，根据本发明，由于利用切去植物冠部的植株幼苗作为遗传转化材料，因此具有如下效果：操作过程简单；使用的培养基简单、节约资源；获得阳性转化子的工作周期短；获得的阳性转化子易于保存。
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。

Claims (5)

1.一种利用植株幼苗进行遗传转化的方法，其特征在于，包括：将幼苗植株于上胚轴处切断，保留幼苗植株上胚轴至根部部分作为遗传转化材料，其中，该幼苗植株的茎粗达到1mm或以上，植株上胚轴切断处距根基部约2 cm；
获得所述遗传转化材料后，还包括如下步骤：
利用农杆菌介导的遗传转化方法，将所述遗传转化材料的上胚轴伤口处浸于农杆菌转化液中浸染5~15 min，将目的基因转化入所述遗传转化材料中，之后将所述遗传转化材料根部插入MS固体培养基中光照培养18~30天得到完整植株，在所述农杆菌介导的遗传转化方法中，在将所述遗传转化材料的上胚轴伤口处浸于农杆菌溶液中浸染5~15 min之后，还包括利用脱脂棉吸干所述遗传转化材料上的溶液，之后于无菌条件下2~4℃放置20~30min，再然后将所述遗传转化材料和所述脱脂棉共同插入MS固体培养基中暗培养3~7天，最后再将所述MS固体培养基中光照培养18~30天得到所述完整植株；其中，所述农杆菌转化液中农杆菌浓度OD600＝0.8，且农杆菌细胞中含有所述目的基因或所述目的基因的表达载体；
获得所述完整植株后，还包括如下步骤：
通过剪取再生芽的部分叶片，利用筛选标记GUS进一步确定阳性转化子，得到转化有所述目的基因的阳性转化子；
获得所述幼苗植株的方法包括：取植物种子，将所述植物种子播种于MS固体培养基上暗培养15~25天，之后再光照培养8~12天，所述植物种子为橘类、橙类、柚类、柠檬、石榴或梨中的任意一种。
2.如权利要求1所述的利用植株幼苗进行遗传转化的方法，其特征在于，所述光照培养的光照强度为50 μmol/m2s，光照时间为12 h/d；
且，所述光照培养和暗培养的培养温度均为26~28℃。
3.如权利要求1所述的利用植株幼苗进行遗传转化的方法，其特征在于，所述农杆菌细胞中包含有筛选标记GUS的基因序列，所述筛选标记GUS与所述目的基因序列同时表达。
4.如权利要求1所述的利用植株幼苗进行遗传转化的方法，其特征在于，所述农杆菌介导中采用的农杆菌为农杆菌EHA105。
5.如权利要求1所述的利用植株幼苗进行遗传转化的方法，其特征在于，在得到所述阳性转化子植株之后，还包括如下步骤：
将所述阳性转化子植株进行炼苗培养，之后定植于土壤中或接穗嫁接于对应植物砧木上。
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Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102533854A (zh) * 2012-03-08 2012-07-04 周口师范学院 一种农杆菌介导的大豆快速遗传转化方法
CN104293829B (zh) * 2014-10-20 2017-03-29 广东省农业科学院果树研究所 一种以柑橘土播实生幼苗为材料的快速转基因方法
CN105132457B (zh) * 2015-10-19 2018-08-03 宁夏农林科学院 一种快速遗传转化苜蓿的方法

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* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation and Gus gene expression in physalis minima;E.Sheeba等;《Global Journal of Biotechnology & Biochemistry》;20101231;第5卷(第1期);第41-43页 *

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