CN104381128B - 一种提高绒毛白蜡组培快繁增殖率的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种提高绒毛白蜡组培快繁增殖率的方法，是在组培苗快繁增殖培养过程中，以WPM培养基为基本培养基，利用4种植物生长调节剂不同浓度配比，大幅度提高了绒毛白蜡组培苗的增殖倍数；以大量元素减半的1/2WPM培养基为基本培养基，附加2种生长素和1种细胞分裂素及低糖度的组合诱导组培苗生根获得完整植株。本发明方法有效解决了绒毛白蜡增殖率低的问题，实验统计：试管苗的增殖率由原来最高的3.59倍提高到10倍以上，增殖系数提高2～3倍，实现了绒毛白蜡快繁增殖的目的。应用本发明方法在短时间内能获得大量的种苗，可充分满足大面积盐碱地造林的需要。

Description

一种提高绒毛白蜡组培快繁增殖率的方法
技术领域
本发明涉及一种提高绒毛白蜡组培快繁增殖率的方法，尤其涉及一种利用4种植物生长调节剂不同浓度配比提高绒毛白蜡组培快繁增殖率的方法，属于生物技术领域。
背景技术
绒毛白蜡(FraxinusVelutinaTorr.)为木犀科(Oleaceae)白蜡属(FraxinusLinn.)落叶乔木，原产于北美，抗逆性强，主要应用于园林绿化、盐碱地造林和用材树种。早在1911年引种到济南(孟昭和等，2001)，1953年被转引到天津(杨瑞兴等,1996)，80年代后在华北华东地区广泛栽培。
土壤盐渍化是影响农林业生产和生态环境的重要因素。全球盐渍土约占陆地面积的三分之一，我国盐渍土面积约1亿hm2(张世功等，2000)。随着工业污染的加剧及化肥使用不当等原因，使次生盐渍化的土地面积还在继续扩大，而且有逐年增加的趋势(中国统计局，1997)。这些盐碱土地主要分布在新疆、甘肃、山东、河北、东北等沿海地区以及内陆干旱、半干旱地区(曹福亮，2000)。盐碱地是潜在的土地资源，如何开发盐碱地和撂荒土地发展林业、改善生态环境是当代林业迫切需要解决的重大课题。由于绒毛白蜡抗逆性较强，分布范围广，对盐碱地等不良环境表现出极强的适应能力，因此目前已成为我国部分沿海城市以及盐碱地区造林和绿化的优良树种(杨瑞兴等，1996)。
国内关于白蜡生态特性、生长习性方面的研究较多，主要侧重于白蜡的耐盐碱性、苗木繁育、造林技术等方面。樊宝敏(1992)报道，绒毛白蜡对呈碱性反应的滨海盐土较为敏感；孟康敏(1999)对5个滨海盐碱地引种的树种幼苗进行盆栽耐盐性试验，根据耐盐性生理指标进行综合分析，结果表明绒毛白蜡耐盐力最强；王友平等(2009)研究了盐渍生境下1-3年生绒毛白蜡不同营养器官中盐离子分布规律。陈之群等(2006)以绒毛白蜡幼嫩茎段为材料研究了其组织培养和植株再生技术；燕丽萍等(2013)开发碱绒毛白蜡耐盐SCAR标记，应用于辅助选择育种中。近年来国外报导多集中在欧洲白蜡(F.excelsior)、美国白蜡(Fraxinusamericana)、青、花白蜡等(ArrillagaI，etal，1992；SilveiraCE，etal，1993；HammattNetal,1992；KimMS，etal，1997)，通过腋芽增殖获得再生植株的报道。国内外对绒毛白蜡组培快繁的文献较少，且文献报道增殖率低，王磊等(2008)用绒毛白蜡成熟胚和茎段进行培养繁殖体，平均增殖系数为3.59，因此提高绒毛白蜡组培快繁增殖率，为迅速扩大绒毛白蜡优良品系的无性繁殖，满足大面积盐碱地造林需要，具有重要的意义。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的是提供一种提高绒毛白蜡组培快繁增殖率的方法，以解决绒毛白蜡增殖率低的问题。
本发明所述提高绒毛白蜡组培快繁增殖率的方法，步骤包括：(1)无菌苗建立，(2)快繁增殖；(3)组培苗生根；(4)炼苗移栽；
其特征在于：
步骤(1)所述无菌苗建立的方法是：选取无病虫害籽粒饱满的种子，去掉种皮，灭菌后接种到种子萌发培养基中，置于组培室，昼夜光照周期培养条件为：白天光照强度为2000～3000Lux，光照时间12～14h·d-1，温度25±1℃；夜间温度18±1℃；7～10d后种子萌发，获得无菌苗；
其中：所述种子萌发培养基配方是：WPM+6-BA0～0.3mg·L-1+蔗糖25～35g·L-1+琼脂4～5g·L-1，pH值5.8～6.0；
上述WPM培养基的组分是：NH4NO3400mg·L-1，Ca(NO3)2·4H20556mg·L-1，K2SO4990mg·L-1，CaCl2·2H2O96mg·L-1，KH2PO4170mg·L-1，Na2MoO4·2H2O0.25mg·L-1，MgS()4·7H2O370mg·L-1，MnSO4·4H2O22.4mg·L-1，ZnSO4·7H2O8.6mg·L-1，CuSO4·5H2O0.25mg·L-1，FeSO4·7H2O27.8mg·L-1，Na2-EDTA37.3mg·L-1，盐酸硫胺素1.0mg·L-1，烟酸0.5mg·L-1，盐酸比哆醇0.5mg·L-1，肌醇100mg·L-1，甘氨酸2.0mg·L-1。
步骤(2)所述快繁增殖的方法是：将步骤(1)获得的无菌苗剪成1～2cm长带芽茎段，转接于快繁增殖培养基中，以步骤(1)所述条件进行昼夜光照周期培养，25～30d后诱导形成丛生芽，增殖倍数8～10倍；
其中：所述快繁增殖培养基是以WPM培养基为基本培养基，于基本培养基中添加苯基噻二唑基脲(TDZ)、玉米素(ZT)、6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)、萘乙酸(NAA)四种植物生长调节剂制成，该快繁增殖培养基配方是：WPM+TDZ0.5～2.0mg·L-1+ZT1.0～2.0mg·L-1+6-BA0.5～1.5mg·L-1+NAA0.5～1.0mg·L-1+25～35mg·L-1蔗糖+4～5mg·L-1琼脂，pH值5.8～6.0；
步骤(3)所述组培苗生根的方法是：待步骤(2)培养的试管苗长到3～5cm时，将其切成单株，接种到生根培养基中，以步骤(1)所述条件进行昼夜光照周期培养，15～20d后获得生根植株，其生根数4～6条，根长1～3cm；
其中：所述生根培养基配方是：1/2WPM+0.7～2.1mg·L-1IBA+0.01～0.03mg·L-1NAA+0.1～0.2mg/LZT+18～25g·L-1蔗糖+4～5g·L-1琼脂，pH值5.7～5.9；
上述1/2WPM是指培养基的组分中WPM大量元素减半及其余为WPM全量元素，其具体组分为：NH4NO3400mg·L-1，Ca(NO3)2·4H20556mg·L-1，K2SO4990mg·L-1，CaCl2·2H2O96mg·L-1，KH2PO4170mg·L-1，Na2MoO4·2H2O0.25mg·L-1，MgS()4·7H2O370mg·L-1，MnSO4·4H2O22.4mg·L-1，ZnSO4·7H2O8.6mg·L-1，CuSO4·5H2O0.25mg·L-1，FeSO4·7H2O27.8mg·L-1，Na2-EDTA37.3mg·L-1，盐酸硫胺素1.0mg·L-1，烟酸0.5mg·L-1，盐酸比哆醇0.5mg·L-1，肌醇100mg·L-1，甘氨酸2.0mg·L-1；
步骤(4)所述炼苗移栽的方法是：把步骤(3)中已生根的瓶苗转移到炼苗温室中适应1～2d，然后用清水逐棵洗去苗根部残留的培养基，并将其移栽到装有轻型基质的无纺布营养杯中，放置于遮光度60％～70％遮荫网塑料大棚内，利用自动间歇喷雾装置保持棚内空气相对湿度在80％以上，炼苗8～10d后，棚内逐渐通风，再继续培养10～12d，移栽于大田；
其中：所述无纺布营养杯中的轻型基质的成分以体积比计为：蛭石﹕珍珠岩﹕草炭土＝2﹕3﹕5，且在无纺布营养杯中轻型基质上面还撒放一层厚度为1.5～2cm的细沙。
上述提高绒毛白蜡组培快繁增殖率的方法中，步骤(1)、(2)或(3)所述昼夜光照周期培养条件优选为：白天光照强度2500Lux，光照时间13h·d-1，温度25℃；夜温度18℃。
上述提高绒毛白蜡组培快繁增殖率的方法中，所述种子萌发培养基或快繁增殖培养基中，琼脂优选4.5g·L-1，蔗糖优选30g·L-1，pH值优选5.8。
上述提高绒毛白蜡组培快繁增殖率的方法中，步骤(2)所述的快繁增殖培养基配方优选是：WPM+TDZ1.5mg·L-1+ZT1.5mg·L-1+6-BA1.0mg·L-1+NAA0.7mg·L-1+30mg·L-1蔗糖+4.5mg·L-1琼脂，pH值5.8～6.0。
上述提高绒毛白蜡组培快繁增殖率的方法中，步骤(3)所述的生根培养基配方优选是：1/2WPM+1.0mg·L-1IBA+0.02mg·L-1NAA+0.15mg·L-1ZT+20g·L-1蔗糖+4g·L-1琼脂，pH值5.7。
本发明提供的提高绒毛白蜡组培快繁增殖率的方法，是在组培苗快繁增殖培养过程中，以WPM培养基为基本培养基，利用4种植物生长调节剂不同浓度配比，大幅度提高了绒毛白蜡组培苗的增殖倍数；以大量元素减半的1/2WPM培养基为基本培养基，附加2种生长素和1种细胞分裂素及低糖度的组合诱导组培苗生根，以获得完整植株。本发明方法有效解决了绒毛白蜡增殖率低的问题，经实验统计：试管苗的增殖率由原来最高的3.59倍提高到10倍以上，增殖系数提高2～3倍，实现了绒毛白蜡快繁增殖的目的。应用本发明方法在短时间内能获得大量的种苗，可充分满足大面积盐碱地造林的需要。
附图说明
图1无菌苗建立。
图2增殖培养。
图3生根培养。
图4炼苗移栽。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明内容作进一步阐明：
实施例1
挑选饱满无病虫害的绒毛白蜡种子，剥去种皮放于无菌的玻璃瓶中，用70％乙醇灭菌20秒，再用0.1％氯化汞灭菌6分钟，然后用无菌水洗涤4次，在无菌条件下接种到WPM+0.3mgL-16-BA+4.5gL-1琼脂+30gL-1蔗糖萌发培养基中(pH值5.9)，培养条件为昼温度25℃，夜温度18℃，光照强度2500Lx,光照时间13h·d-1(培养条件下同)，7d后种子萌发，获得无菌苗。
将无菌苗剪成1cm长带芽茎段，转接于WPM+TDZ0.5mg·L-1+ZT2.0mg·L-1+6-BA0.5mg·L-1+NAA0.5mg·L-1+25mg·L-1蔗糖+4mg·L-1琼脂增殖培养基中(pH值6.0)，以上述条件进行昼夜光照周期培养，25d后诱导形成丛生芽，增殖倍数8倍。
待试管苗长到3cm，将其切成单株，接种到生根培养基中(1/2WPM+0.7mg·L-1IBA+0.01mg·L-1NAA+0.1mg/LZT+18g·L-1蔗糖+4.5g·L-1琼脂，pH值5.8)，培养条件同上为昼夜光照周期培养，培养15d获得生根植株，生根数4条，根长1cm。
把生根的瓶苗转移到炼苗温室中适应1d后，用镊子将苗轻轻夹出，快速放到盛有清水的容器中，用清水洗去根部残留的培养基，并将其移栽到装有轻型基质(所述基质购于寿光市恒先育苗基质加工厂)的无纺布营养杯中，放置于遮光度60％～70％遮荫网塑料大棚内，利用自动间歇喷雾装置保持棚内空气相对湿度在80％以上，炼苗8d后，棚内逐渐通风，再继续培养10d，移栽于大田，成活率89％以上。
实施例2
挑选饱满无病虫害的绒毛白蜡种子，剥去种皮放于无菌的玻璃瓶中，用70％乙醇灭菌30秒，再用0.1％氯化汞灭菌7分钟，然后用无菌水洗涤5次，在无菌条件下接种到WPM+0.1mg/L6-BA+4g/L琼脂+25g/L蔗糖萌发培养基中(pH值5.8)，培养条件为昼温度25℃，夜温度18℃，光照强度2500Lx，光照时间13h·d-1(培养条件下同)，9d后种子萌发，获得无菌苗。
将无菌苗剪成1.5cm长带芽茎段，转接于WPM+TDZ1.5mg·L-1+ZT1.5mg·L-1+6-BA1.0mg·L-1+NAA0.7mg·L-1+30mg·L-1蔗糖+4.5mg·L-1琼脂增殖培养基中(pH值5.8)，以上述条件进行昼夜光照周期培养，30d后诱导形成丛生芽，增殖倍数10倍。
待试管苗长到5cm，将其切成单株，接种到生根培养基中(1/2WPM+1.0mg·L-1IBA+0.02mg·L-1NAA+0.15mg/LZT+20g·L-1蔗糖+4g·L-1琼脂，pH值5.7)，培养18d获得生根植株，生根数6条，根长2cm，培养条件为步骤(1)所述昼夜光照周期培养。
把生根的瓶苗转移到炼苗温室中适应2d后，用镊子将苗轻轻夹出，快速放到盛有清水的容器中，用清水洗去根部残留的培养基，移栽到装有轻型基质的无纺布营养杯中，放置于遮光度60％～70％遮荫网塑料大棚内，利用自动间歇喷雾装置保持棚内空气相对湿度在80％以上，炼苗10d后，棚内逐渐通风，再继续培养12d，栽植于大田，成活率92％以上。
实施例3
挑选饱满无病虫害的绒毛白蜡种子，剥去种皮放于无菌的玻璃瓶中，用70％乙醇灭菌25秒，再用0.1％氯化汞灭菌8分钟，然后用无菌水洗涤6次，在无菌条件下接种到WPM+5.0g/L琼脂+35g/L蔗糖萌发培养基中(pH值6.0)，培养条件为昼温度25℃，夜温度18℃，光照强度2500Lx,光照时间13h·d-1(培养条件下同)，10d后种子萌发，获得无菌苗。
将无菌苗剪成2cm长带芽茎段，转接于WPM+TDZ2.0mg·L-1+ZT1.0mg·L-1+6-BA1.5mg·L-1+NAA1.0mg·L-1+35mg·L-1蔗糖+5mg·L-1琼脂增殖培养基中(pH值5.7)，以上述条件进行昼夜光照周期培养，35d后诱导形成丛生芽，增殖倍数9倍。
待试管苗长到4cm，将其切成单株，接种到生根培养基中(1/2WPM+2.1mg·L-1IBA+0.03mg·L-1NAA+0.2mg/LZT+25g·L-1蔗糖+5g·L-1琼脂，pH值5.9)，培养20d获得生根植株，生根数5条，根长3cm，培养条件为昼夜光照周期培养。
把生根的瓶苗转移到炼苗温室中适应1d后，用镊子将苗轻轻夹出，快速放到盛有清水的容器中，用清水洗去根部残留的培养基，移栽到装有轻型基质的无纺布营养杯中，放置于遮光度60％～70％遮荫网塑料大棚内，利用自动间歇喷雾装置保持棚内空气相对湿度在80％以上，炼苗9d后，棚内逐渐通风，再继续培养11d，栽植于大田，成活率85％以上。
本发明方法实施例中采用的培养基及其配方是：
WPM培养基的组分为：NH4NO3400mg·L-1，Ca(NO3)2·4H20556mg·L-1，K2SO4990mg·L-1，CaCl2·2H2O96mg·L-1，KH2PO4170mg·L-1，Na2MoO4·2H2O0.25mg·L-1，MgS()4·7H2O370mg·L-1，MnSO4·4H2O22.4mg·L-1，ZnSO4·7H2O8.6mg·L-1，CuSO4·5H2O0.25mg·L-1，FeSO4·7H2O27.8mg·L-1，Na2-EDTA37.3mg·L-1，盐酸硫胺素1.0mg·L-1，烟酸0.5mg·L-1，盐酸比哆醇0.5mg·L-1，肌醇100mg·L-1，甘氨酸2.0mg·L-1。
1/2WPM是指培养基的组分中WPM大量元素减半及其余为WPM全量元素，其具体组分为：NH4NO3200mg·L-1，Ca(NO3)2·4H20278mg·L-1，K2SO4495mg·L-1，CaCl2·2H2O48mg·L-1，KH2PO485mg·L-1，Na2MoO4·2H2O0.25mg·L-1，MgS()4·7H2O370mg·L-1，MnSO4·4H2O22.4mg·L-1，ZnSO4·7H2O8.6mg·L-1，CuSO4·5H2O0.25mg·L-1，FeSO4·7H2O27.8mg·L-1，Na2-EDTA37.3mg·L-1，盐酸硫胺素1.0mg·L-1，烟酸0.5mg·L-1，盐酸比哆醇0.5mg·L-1，肌醇100mg·L-1，甘氨酸2.0mg·L-1。
萌发培养基配方是：WPM+6-BA0～0.3mg·L-1+蔗糖25～35g·L-1+琼脂4～5g·L-1，pH值5.8～6.0；
快繁增殖培养基配方是：WPM+TDZ0.5～2.0mg·L-1+ZT1.0～2.0mg·L-1+6-BA0.5～1.5mg·L-1+NAA0.5～1.0mg·L-1+25～35mg·L-1蔗糖+4～5mg·L-1琼脂，pH值5.8～6.0；
生根培养基配方是：1/2WPM+0.7～2.1mg·L-1IBA+0.01～0.03mg·L-1NAA+0.1～0.2mg/LZT+18～25g·L-1蔗糖+4～5g·L-1琼脂，pH值5.7～5.9；
上述无纺布营养杯中的轻型基质的成分以体积比计为：蛭石﹕珍珠岩﹕草炭土＝2﹕3﹕5，且在无纺布营养杯中轻型基质上面还撒放一层厚度为1.5～2cm的细沙。所述轻型基质可购于寿光市恒先育苗基质加工厂。

Claims (5)

1.一种提高绒毛白蜡组培快繁增殖率的方法，步骤包括：(1)无菌苗建立，(2)快繁增殖；(3)组培苗生根；(4)炼苗移栽；
其特征在于：
步骤(1)所述无菌苗建立的方法是：选取无病虫害籽粒饱满的种子，去掉种皮，灭菌后接种到种子萌发培养基中，置于组培室，昼夜光照周期培养条件为：白天光照强度为2000～3000Lux，光照时间12～14h·d-1，温度25±1℃；夜间温度18±1℃；7～10d后种子萌发，获得无菌苗；
其中：所述种子萌发培养基配方是：WPM+6-BA0～0.3mg·L-1+蔗糖25～35g·L-1+琼脂4～5g·L-1，pH值5.8～6.0；
步骤(2)所述快繁增殖的方法是：将步骤(1)获得的无菌苗剪成1～2cm长带芽茎段，转接于快繁增殖培养基中，以步骤(1)所述条件进行昼夜光照周期培养，25～30d后诱导形成丛生芽，增殖倍数8～10倍；
其中：所述快繁增殖培养基是以WPM培养基为基本培养基，于基本培养基中添加苯基噻二唑基脲(TDZ)、玉米素(ZT)、6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)、萘乙酸(NAA)四种植物生长调节剂制成，该快繁增殖培养基配方是：WPM+TDZ0.5～2.0mg·L-1+ZT1.0～2.0mg·L-1+6-BA0.5～1.5mg·L-1+NAA0.5～1.0mg·L-1+25～35mg·L-1蔗糖+4～5mg·L-1琼脂，pH值5.8～6.0；
步骤(3)所述组培苗生根的方法是：待步骤(2)培养的试管苗长到3～5cm时，将其切成单株，接种到生根培养基中，以步骤(1)所述条件进行昼夜光照周期培养，15～20d后获得生根植株，其生根数4～6条，根长1～3cm；
其中：所述生根培养基配方是：1/2WPM+0.7～2.1mg·L-1IBA+0.01～0.03mg·L-1NAA+0.1～0.2mg/LZT+18～25g·L-1蔗糖+4～5g·L-1琼脂，pH值5.7～5.9；
上述1/2WPM是指培养基的组分中WPM大量元素减半及其余为WPM全量元素，其具体组分为：NH4NO3400mg·L-1，Ca(NO3)2·4H2O556mg·L-1，K2SO4990mg·L-1，CaCl2·2H2O96mg·L-1，KH2PO4170mg·L-1，Na2MoO4·2H2O0.25mg·L-1，MgSO4·7H2O370mg·L-1，MnSO4·4H2O22.4mg·L-1，ZnSO4·7H2O8.6mg·L-1，CuSO4·5H2O0.25mg·L-1，FeSO4·7H2O27.8mg·L-1，Na2-EDTA37.3mg·L-1，盐酸硫胺素1.0mg·L-1，烟酸0.5mg·L-1，盐酸吡哆醇0.5mg·L-1，肌醇100mg·L-1，甘氨酸2.0mg·L-1；
步骤(4)所述炼苗移栽的方法是：把步骤(3)中已生根的瓶苗转移到炼苗温室中适应1～2d，然后用清水逐棵洗去苗根部残留的培养基，并将其移栽到装有轻型基质的无纺布营养杯中，放置于遮光度60％～70％遮荫网塑料大棚内，利用自动间歇喷雾装置保持棚内空气相对湿度在80％以上，炼苗8～10d后，棚内逐渐通风，再继续培养10～12d，移栽于大田；
其中：所述无纺布营养杯中的轻型基质的成分以体积比计为：蛭石﹕珍珠岩﹕草炭土＝2﹕3﹕5，且在无纺布营养杯中轻型基质上面还撒放一层厚度为1.5～2cm的细沙。
2.如权利要求1所述提高绒毛白蜡组培快繁增殖率的方法，其特征在于，步骤(1)、(2)或(3)所述昼夜光照周期培养条件为：白天光照强度2500Lux，光照时间13h·d-1，温度25℃；夜温度18℃。
3.如权利要求1所述提高绒毛白蜡组培快繁增殖率的方法，其特征在于，所述种子萌发培养基中，琼脂为4.5g·L-1，蔗糖为30g·L-1，pH值为5.8。
4.如权利要求1所述提高绒毛白蜡组培快繁增殖率的方法，其特征在于，步骤(2)所述的快繁增殖培养基配方是：WPM+TDZ1.5mg·L-1+ZT1.5mg·L-1+6-BA1.0mg·L-1+NAA0.7mg·L-1+30mg·L-1蔗糖+4.5mg·L-1琼脂，pH值5.8～6.0。
5.如权利要求1所述提高绒毛白蜡组培快繁增殖率的方法，其特征在于，步骤(3)所述的生根培养基配方是：1/2WPM+1.0mg·L-1IBA+0.02mg·L-1NAA+0.15mg·L-1ZT+20g·L-1蔗糖+4g·L-1琼脂，pH值5.7。
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