CN115820901A

CN115820901A - 棉花中可视化的基因编辑检测方法及其应用

Info

Publication number: CN115820901A
Application number: CN202211028225.9A
Authority: CN
Inventors: 葛晓阳; 詹晶晶; 陈艳丽; 王智
Original assignee: Institute of Cotton Research of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Institute of Cotton Research of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2022-08-25
Filing date: 2022-08-25
Publication date: 2023-03-21

Abstract

本发明公开了棉花中可视化的基因编辑检测方法及其应用，技术方案是，通过棉花茎尖转化获得F3Hs转基因苗，然后构建基因编辑载体，将基因编辑载体导入F3Hs转基因苗，对F3Hs基因进行基因编辑，从而产生缺失或插入，形成F3Hs基因的突变体，与F3Hs转基因苗相比，编辑成功的事件的愈伤组织为白色。在本发明中，通过在棉花中过表达F3Hs获得了一种由于花青素积累使棉花植株以及愈伤表现为红色的材料。以此材料为基础，首次在棉花中通过编辑F3Hs基因证实编辑成功的事件中愈伤会由红色变成白色，使检测成功的敲除事件不需要借助于仪器设备，肉眼可识别，从而开发了测试基因编辑工具编辑效率的理想体系。

Description

棉花中可视化的基因编辑检测方法及其应用

技术领域

本发明涉及分子生物学、植物遗传学和植物生物工程领域。具体而言，本发明通过编辑棉花红色愈伤中F3Hs基因快速检测基因编辑工具在棉花中产生的编辑事件以及测定其编辑效率。该方法能够应用于基因编辑工具在棉花中的优化及编辑效率比较。

背景技术

基因编辑技术近年来发展迅速，大量高效编辑系统被开发出来。尤其以CRISPR/Cas9为核心的编辑技术广泛应用于动植物研究和开发。现阶段植物中使用最广泛的方法是基于原生质体通过荧光报告基因恢复发光功能统计基因编辑事件频率，此方法可用于快速评估基因编辑工具的效率，但是此方法存在一定的局限性，一些编辑系统的测试通过原生质体没有办法实现，如利用生殖特异性启动子或组织特异性启动子驱动Cas9表达提高基因编辑效率，利用成花素FT(Flowering Locus T)基因与外源基因融合通过VIGS投递sgRNA，获得基因编辑的后代等。因此随着越来越多植物基因组编辑的应用，一种灵敏、简便的检测基因编辑事件的方法迫切所需。

黄酮3β-羟化酶(F3Hs)是参与类黄酮生物合成的双加氧酶，也是花青素生物合成途径中一个关键酶，可以催化黄烷酮羟基化生成二氢黄酮醇，二氢黄酮醇是黄酮醇和花青素合成的共同前体物质。因此，它在花青素的合成途径中起着重要的作用，当F3Hs的表达被抑制时，这些色素的合成受到限制，花色、愈伤组织的颜色发生变化。在矮牵牛中F3Hs基因突变失活可阻断花色素的合成通路，从而产生白花；在果树中F3Hs在成熟期高表达，增加花青素的积累，从而影响果实颜色；在胡萝卜中，敲除紫色愈伤组织中的F3Hs基因，阻断紫色愈伤组织中花青素的生物合成，导致愈伤组织变为白色。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的是通过编辑棉花红色愈伤中F3Hs基因快速检测基因编辑工具在棉花中产生的编辑事件以及测定其编辑效率，这种简单而快速的方法可以作为一种简便有效的方法用于比较和验证新的CRISPR编辑系统，实现对基因编辑工具进行快速筛选和优化。

为了实现上述目的，本发明的技术方案是：

棉花中可视化的基因编辑检测方法，通过棉花茎尖转化获得F3Hs转基因苗，然后构建基因编辑载体，将基因编辑载体导入F3Hs转基因苗，对F3Hs基因进行基因编辑，从而产生缺失或插入，形成F3Hs基因的突变体，与F3Hs转基因苗相比，编辑成功的事件的愈伤组织为白色，部分编辑成功事件的愈伤组织为粉色，没有编辑成功事件的愈伤组织为红色。

所述基因F3Hs的序列如SEQ ID NO.1所示。

基因编辑载体的构建方法为：根据F3Hs基因的CDS序列，选择特异性靶点，扩增获得含有粘性末端的sgRNA表达盒，将sgRNA表达盒组装到载体中，获得重组质粒，测序，测序正确的重组质粒即为基因编辑载体。

sgRNA的编码序列如SEQ ID NO.4-6所示。

所述载体为载体p401-cas9、p401-cas12a、p401-casF。

一种基于CRISPR/Cas9/Cas12a/CasF对F3Hs基因进行编辑的特异sgRNA，编码序列如SEQ ID NO.4-6所示。

一种特异sgRNA在构建F3Hs编辑材料中的应用。

一种CRISPR/Cas9/Cas12a/CasF载体在F3Hs编辑材料中的应用。

本发明的有益效果：

在本发明中，通过在棉花中过表达F3Hs获得了一种由于花青素积累使棉花植株以及愈伤表现为红色的材料。以此材料为基础，首次在棉花中通过编辑F3Hs基因证实编辑成功的事件中愈伤会由红色变成白色，使检测成功的敲除事件不需要借助于仪器设备，肉眼可识别，从而开发了测试基因编辑工具编辑效率的理想体系。本发明利用该模型测试了Cas9/Cas12a/CasF在棉花中的靶向编辑效率，其中Cas9的效率高达90％以上。

附图说明

图1为实施例1中所获得的红色棉花材料。

图2为实施例2中F3Hs基因结构图及靶点序列。

图3为实施例2中所使用的构建好的有效重组质粒Cas9/Cas12a/CasF-F3Hs图谱。

图4为实施例3中编辑结果表型图。

图5为实施例3中表型统计结果柱形图。

图6为实施例4中编辑效率统计图。

图7为实施例4中阳性愈伤检测胶图。

图8为实施例4中编辑结果测序图。

图9为实施例4中Ti-TOM结果统计图。WT表示红色愈伤，line1和line2表示不同的单株苗，D表示缺失碱基(数)，I表示插入碱基(数)。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

实施例1：农杆菌介导的棉花茎尖遗传转化获得F3Hs转基因苗

棉花种子经硫酸脱绒后，依次用70％(v/v)乙醇溶液浸泡1min，质量分数0.1％升汞溶液浸泡15min，完成消毒，然后用无菌水洗涤5遍。消毒后的种子放入铺有双层滤纸的无菌平皿中，加入适量无菌水，于30℃植物培养箱中萌发。24h后剥离掉种子的外壳和两片子叶，暴露出顶端分生组织(外植体)。挑取含F3Hs cDNA(SEQ ID NO.1)的农杆菌单克隆，接种到加有50mg/L利福平和50mg/L卡那霉素的YEP液体培养基中，于28℃、180r/min振荡过夜培养。取上述农杆菌菌液1mL接种至新的含有50mg/L利福平和50mg/L卡那霉素的YEP液体培养基中，于28℃、180r/min振荡培养至OD₆₀₀＝0.6-0.8，4000r/min离心5min，收集菌体用M1重悬液重悬，备用。浸染前，向农杆菌重悬液中加入0.1％(v/v)的20mg/mL丁酰丁香酮(AS)和0.2％(v/v)的表面活剂Silwet-L77，作为侵染培养基。随后将外植体浸没在侵染培养基中，分别用超声波和真空处理促进外源基因整合到分生组织的干细胞中(超声时间40s，超声频率40KHz，侵染时间50min)；侵染完之后于35℃，共培养培养基中培养3天，随后转移到恢复培养基培养15天；接着在筛选培养基中诱导阳性芽产生，芽伸长培养基中诱导芽伸长；最后诱导阳性苗生根并移栽到花盆中。阳性幼苗于21℃避光培养2d，光下培养2d后，选取叶片红色植株移栽入花盆，后期整株及棉铃都呈现出红色(图1)。

M1重悬液的组成为：10ml/L CA母液，30g/L葡萄糖，4.2g/L MES(吗啉乙磺酸)(sigma公司产品，货号V900336)，0.1ml/LB5维生素(PhytoTech(西美杰)公司产品，货号G219)，1mg/L 6-BA(6-苄基腺嘌呤)，0.1mg/L NAA(萘乙酸)，pH值5.4。

共培养培养基的组成为：10ml/L CA母液，30g/L葡萄糖，4.2g/L MES，0.1ml/L B5维生素(G219)，1mg/L6-BA，0.1mg/L NAA，0.2mM乙酰丁香酮，200mg/mL半胱氨酸(CYS)，pH值5.4。

恢复培养基(R0)的组成为：4.4g/L MS盐和B5维生素的混合物(PhytoTech(西美杰)公司产品，货号M404)，20g/L葡萄糖，1.29g/L葡萄酸钙，4g/L琼脂(Agar)，1mg/L 6-BA，0.1mg/L NAA，100mg/L羧苄青霉素，100mg/L头孢霉素，pH值5.6。

筛选培养基的组成为：4.4g/L MS盐和B5维生素的混合物(PhytoTech(西美杰)公司产品，货号M404)，20g/L葡萄糖，1.29g/L葡萄酸钙，4g/L琼脂(Agar)，1mg/L 6-BA，0.1mg/L NAA，100mg/L羧苄青霉素，100mg/L头孢霉素，100mg/L壮观霉素，pH值5.6。

芽伸长培养基的组成为：4.4g/L MS盐和B5维生素的混合物(PhytoTech(西美杰)公司产品，货号M404)，20g/L葡萄糖，1.29g/L葡萄酸钙，4g/L琼脂(Agar)，100mg/L羧苄青霉素，100mg/L头孢霉素，100mg/L壮观霉素，pH值5.6。

实施例2：基因编辑载体构建

使用CRISPR靶点设计网站CRISPRdirect(http://crispr.dbcls.jp/)根据F3Hs基因的CDS序列，选择PAM位点和GC含量在40％～60％之间的高特异性靶点(图2)。靶点序列分别为：

Cas9：AGGTGTTGTCAGAGGCCATGGG(SEQ ID NO.2)

Cas12a/CasF：TTTCATCGTCTCCAGCCACCTTCAG(SEQ ID NO.3)

通过巢式PCR扩增获得的PCR片段为含有粘性末端的sgRNA表达盒(Cas9/Cas12a/CasF对应的sgRNA表达序列分别如SEQ ID NO.4-6所示)，获得sgRNA表达盒后，采用边切边连法将纯化的sgRNA表达盒组装进对应的p401-Cas9，p401-Cas12a，p401-CasF载体中，具体反应体系如表1。转化大肠杆菌，然后挑取单菌落测序，获得重组质粒，测序分析进一步证明载体构建成功。构建成功的载体分别命名为p401-Cas9-F3Hs，p401-Cas12a-F3Hs，p401-CasF-F3Hs，重组质粒结构如图所示(图3)，分别提取重组质粒转化LBA4404农杆菌备用。

表1酶切-连接体系

实施例3：农杆菌介导的棉花愈伤分化遗传转化及表型观察与统计

将脱绒的棉花种子(品种为F3Hs转基因苗)用质量浓度0.1％的次氯酸钠溶液杀菌，无菌水清洗数次后放入无菌苗培养基中，28℃暗培养7d；将棉花苗下胚轴切成0.8cm长的茎段，用活化后p401-Cas9-F3Hs，p401-Cas12a-F3Hs，p401-CasF-F3Hs的LBA4404农杆菌侵染，弃菌液，并吹干(分别侵染500个切断)；将下胚轴平铺在共培养培养基中，放入光照培养室，培养20-30d后对愈伤组织进行观察，发现愈伤颜色出现红色、白色和粉色三种类型(图4)，并根据颜色对愈伤进行了统计分析(图5)，具体计算方法如下：

白色或粉色的愈伤个数/总愈伤数(500个)×100％

发现p401-Cas9-F3Hs侵染的实验组白色和粉色的愈伤块占～15％，p401-Cas12a-F3Hs占比～10％，p401-CasF-F3Hs占比～5％。猜测白色愈伤和粉色愈伤可能为编辑成功的事件，且p401-Cas9的编辑效率最高，其次为p401-Cas12a，p401-CasF的编辑效率最低。

实施例4：Cas9/Cas12a/CasF系统基因编辑的结果检测与分析

为进一步统计编辑效率，需要对愈伤组织进行转基因阳性检测。首先取少量愈伤组织用CTAB的方法提取DNA，以载体特异引物进行PCR扩增，检测引物如下：

CasF-F1-155：5’-AAGAAGAACCGCCGAACT-3’(SEQ ID NO.7)

CasF-R1-435：5’-CTTGAGCACGCCATCATA-3’(SEQ ID NO.8)

Cas12a-F1-102：5’-GCTGTTGGTGGAAGATGAA-3’(SEQ ID NO.9)

Cas12a-R1-452：5’-GTGAATGCTGTTGTGAATCC-3’(SEQ ID NO.10)

Cas9-F1-30：5’-TGGGACTAACTCTGTTGGC-3’(SEQ ID NO.11)

Cas9-R1-824：5’-TCCAGGTCATCGTCGTATG-3’(SEQ ID NO.12)

使用Cas9-F1-30/Cas9-R1-824，Cas12a-F1-102/Cas12a-R1-452，CasF-F1-155/CasF-R1-435引物分别通过对p401-Cas9-F3Hs，p401-Cas12a-F3Hs，p401-CasF-F3Hs侵染培养后的愈伤块进行PCR扩增，扩增有条带的为阳性，没有条带的为阴性。统计发现白色愈伤块有～95％为阳性，粉色愈伤块有～60％为阳性，红色愈伤块仅有～7％为阳性(图6)，其中粉色愈伤的阳性检测可能与取样部位有关，部分转基因阳性愈伤鉴定如图所示(图7)，说明可以通过愈伤颜色初步判断转化是否成功。

对鉴定出来的阳性植株，分别使用测序引物扩增包含靶位点序列的DNA片段送公司进行Sanger测序，鉴定是否编辑成功。引物序列如下：

F3H-Cas9-F：5’-AGAGGGTTGGGTTGAAGTTA-3’(SEQ ID NO.13)

F3H-Cas9-R：5’-AAGAGTGTGATGGTGCCTG-3’(SEQ ID NO.14)

F3H-Cas12a/CasF-F：5’-CTTCCAGGTTGTGGATCATG-3’(SEQ ID NO.15)

F3H-Cas12a/CasF-R：5’-GCAATGTGCTTCTGGGAA-3’(SEQ ID NO.16)

结果显示～98％的白色愈伤和～85％的粉色愈伤的测序结果在靶位点序列出现双峰，说明这些事件编辑成功，使F3Hs基因编码受阻，从而引起愈伤表现出明显颜色变化。而红色愈伤的靶点均没有发生突变(图6，图8)。具体计算所用公式如下：

阳性率计算公式：阳性愈伤个数/愈伤总个数×100％

编辑效率计算公式：编辑成功愈伤个数/阳性愈伤个数×100％

根据二代测序原理，利用Hi-TOM(High-throughput Tracking Of Mutations)高通量建库测序的方法，可以分析每块愈伤的具体突变形式，因此，本发明设计了F3Hs基因的扩增靶点的特异性引物，并在前引物5’端添加接头序列ggagtgagtacggtgtgc；后引物5’端添加接头序列gagttggatgctggatgg，作为Hi-TOM测序的PCR扩增引物。引物序列如下：

Hi-TOM-F3H-Cas9-F：5’-ggagtgagtacggtgtgcAGAGGGTTGGGTTGAAGTTA-3’(SEQ IDNO.17)

Hi-TOM-F3H-Cas9-R：5’-gagttggatgctggatggAAGAGTGTGATGGTGCCTG-3’(SEQ IDNO.18)

Hi-TOM-F3H-Cas12a/CasF-F：5’-ggagtgagtacggtgtgcCTTCCAGGTTGTGGATCATG-3’(SEQ ID NO.19)

Hi-TOM-F3H-Cas12a/CasF-R：5’-gagttggatgctggatggGCAATGTGCTTCTGGGAA-3’(SEQ ID NO.20)

结果显示大部分表现为白色愈伤的靶位点序列的突变类型多样(图9)，总占比均大于70％，而红色愈伤(WT)的靶位点序列大部分表现为未突变状态，说明每个愈伤块是由不同编辑类型的细胞共同组成，同一愈伤块最终形成的转基因苗可能会产生多种编辑类型植株。

Claims

1.棉花中可视化的基因编辑检测方法，其特征在于，通过棉花茎尖转化获得F3Hs转基因苗，然后构建基因编辑载体，将基因编辑载体导入F3Hs转基因苗，对F3Hs基因进行基因编辑，从而产生缺失或插入，形成F3Hs基因的突变体，与F3Hs转基因苗相比，编辑成功的事件的愈伤组织为白色。

2.根据权利要求1所述的棉花中可视化的基因编辑检测方法，其特征在于，还包括部分编辑成功事件的愈伤组织为粉色，没有编辑成功事件的愈伤组织为红色。

3.根据权利要求1所述的棉花中可视化的基因编辑检测方法，其特征在于，所述基因F3Hs的序列如SEQ ID NO.1所示。

4.根据权利要求1所述的棉花中可视化的基因编辑检测方法，其特征在于，基因编辑载体的构建方法为：根据F3Hs基因的CDS序列，选择特异性靶点，扩增获得含有粘性末端的sgRNA表达盒，将sgRNA表达盒组装到载体中，获得重组质粒，测序，测序正确的重组质粒即为基因编辑载体。

5.根据权利要求4所述的棉花中可视化的基因编辑检测方法，其特征在于，sgRNA的编码序列如SEQ ID NO.4-6所示。

6.根据权利要求4所述的棉花中可视化的基因编辑检测方法，其特征在于，所述载体为载体p401-cas9、p401-cas12a、p401-casF。

7.一种基于CRISPR/Cas9/Cas12a/CasF对F3Hs基因进行编辑的特异sgRNA，编码序列如SEQ ID NO.4-6所示。

8.一种如权利要求7所述的特异sgRNA在构建F3Hs编辑材料中的应用。

9.一种CRISPR/Cas9/Cas12a/CasF载体在F3Hs编辑材料中的应用。