CN113604499A - 一种带有可见光下裸眼可见的筛选标记桉树遗传转化方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于桉树遗传转化方法，特别是可见光下裸眼可视的筛选阳性转化子的桉树遗传转化方法。以尾巨桉无菌苗茎段为外植体诱导愈伤组织，用含报告基因RUBY的工程菌经农杆菌浸染法转化尾巨桉愈伤组织，通过不定芽诱导、芽增殖、不定芽伸长、再生苗生根及移栽，得到带有自然光下裸眼可见的红色蛋白报告基因RUBY的再生植株。本发明特点是以带有裸眼可见的红报告基因RUBY作为筛选标记，无需借助其他仪器及样品处理，是一种非破坏性的便捷性的鉴定阳性转化子的方法。采用本发明方法得到的裸眼可见的红色蛋白报告基因RUBY的的再生植株结果稳定，转化率良好，能直接应用于裸眼观察目的基因是否成功导入，也为桉树基因育种奠定了基础。

Description

一种带有可见光下裸眼可见的筛选标记桉树遗传转化方法
技术领域
本发明涉及一种带有可见光下裸眼可见的筛选标记桉树遗传转化方法，属于基因工程技术领域。
背景技术
农杆菌是普遍存在于土壤中的一种革兰氏阴性细菌，它能在自然条件下趋化性地感染大多数双子叶植物的受伤部位，并诱导产生冠瘿瘤或发状根。根癌农杆菌和发根农杆菌中细胞中分别含有Ti质粒和Ri质粒，其上有一段T-DNA，农杆菌通过侵染植物伤口进入细胞后，可将T-DNA插入到植物基因组中。因此，农杆菌是一种天然的植物遗传转化体系。人们将目的基因插入到经过改造的T-DNA区，借助农杆菌的感染实现外源基因向植物细胞的转移与整合，然后通过细胞和组织培养技术，再生出转基因植株。
RUBY(红宝石)是一种在可见光下可直接观察到表达产物的新型报告系统，其表型的观测不需要依赖特定的设备及昂贵的耗材。将催化甜菜红素合成的三种酶的基因CYP76AD1、DODA、GT偶联到一个开放阅读框中，组成报告系统RUBY。本研究通过带有RUBY基因的农杆菌转化对植物进行转化，可实现在植物转化后对阳性转化植物的形态学标记筛选，从而成为裸眼可视化筛选标记的转化方法。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种带有可见光下可视筛选标记的桉树遗传转化方法，利用报告基因系统RUBY的表达产物呈红宝石色这个特点，将它运用在没有该色素背景的尾巨桉基因工程实验中。
本发明涉及一种带有可见光下裸眼可见的筛选标记桉树遗传转化方法，属于基因工程技术领域。其特征在于：解决了定量检测需要依赖于间接检测的问题，发明了一种带有可见光下裸眼可见的筛选标记桉树遗传转化方法。具体步骤如下：
(1)由国家林业局桉树研究开发中心提供的尾巨桉无菌瓶苗。
(2)无菌苗茎段切成0.2-0.5cm长的小段，接种在愈伤诱导培养基上，暗培养一周，培养温度24±2℃。
(3)经愈伤诱导培养基上培养的愈伤组织转入浸染培养基，超声波30s后加入含有红色蛋白报告基因RUBY的农杆菌，避光28℃，200r摇床摇3h。
(4)将浸染后的愈伤组织转入愈伤诱导培养基上，在24±2℃暗培养4-5天。
(5)将愈伤组织转移到不定芽诱导培养基，24±2℃暗培养一周。然后转移到24±2℃、光照强度2000-2500lx条件下，光培养2-3周。
(6)经不定芽诱导培养基培养上的愈伤组织转入芽增殖培养基上，并在自然光下观察愈伤组织是否变成红色，然后在24±2℃、光照强度2000～2500lx条件下培养2～3周。
(7)经芽增殖培养基培养的愈伤组织转入不定芽伸长培养基上，在24±2℃、光照强度2000～2500lx条件下培养，促进芽伸长；
(8)当芽伸长到3～4cm时，将不定芽转入生根培养基上培养，以促其生根；
(8)将生根良好的幼苗从恒温光照培养箱移至室外自然环境中炼苗7d，揭开封瓶膜在练苗2d，移栽到灭菌的黄心土中生长，得到带有可见光下裸眼可见的红色蛋白报告基因RUBY的再生植株。
所述1/2MS(Murashige and Skoog)培养基为：大量元素为MS的一半，其余不变，蔗糖30g/L+琼脂6g/L，pH为5.8～6.0。
所述愈伤诱导培养基为：MS+PBU 1mg/L+IAA 0.05mg/L+Vc 100mg/L+乙酰丁香酮0.1mg/L+蔗糖30g/L+琼脂6g/L，pH 5.8-6.0。
所述浸染培养基为：MS+蔗糖30g/L。
所述不定芽诱导培养基为：1/2MS+萘乙酸(NAA)0.05mg/L+6-BA 100mg/L+腐胺500mmol/L+亚精胺100mmol/L+抗坏血酸(Vc)100mg/L+蔗糖30g/L+琼脂6g/L，pH 5.8～6.0。
所述芽增殖培养基为：1/2MS+6-BA 100mg/L+NAA 0.05mg/L+Cef 200mg/ml+蔗糖30g/L+琼脂6g/L，pH 5.8～6.0。
所述芽伸长培养基为：1/2MS+NAA 0.05mg/L+PBU 1mg/mL+Vc 1mg/mL+蔗糖30g/L+琼脂6g/L，pH 5.8～6.0。
所述生根培养基为：1/2MS+吲哚丁酸(IBA)0.5mg/L+蔗糖30g/L+琼脂6g/L，pH 5.8～6.0。
具体实施方式
以下对本发明进一步说明。
(1)获得尾巨桉无菌苗
(2)去掉尾巨桉无菌苗顶芽与根部，将下胚轴切成0.2～0.5cm长无芽点的小段，将此接种于愈伤诱导培养基(MS+PBU 1mg/L+IAA 0.05mg/L+Vc 100mg/L+乙酰丁香酮0.1mg/L+蔗糖30g/L+琼脂6g/L，pH 5.8-6.0)。暗培养一周，培养温度24±2℃。
(3)愈伤培养后，将愈伤组织置于浸染培养基(MS+蔗糖30g/L),超声波震荡30S后加入带有红色蛋白报告基因RUBY的农杆菌，避光于28℃、200r的摇床中摇3h。
(4)将浸染后的愈伤组织转移到愈伤诱导培养基(MS+PBU 1mg/L+IAA 0.05mg/L+Vc 100mg/L+乙酰丁香酮0.1mg/L+蔗糖30g/L+琼脂6g/L，pH 5.8-6.0)上24±2℃暗培养4-5天。
(5)将上述愈伤组织转移到不定芽诱导培养基(1/2MS+NAA 0.05mg/L+6-BA100mg/L+腐胺500mmol/L+亚精胺100mmol/L+Vc 100mg/L+蔗糖30g/L+琼脂6g/L，pH 5.8～6.0)上，24±2℃暗培养一周。然后转移到24±2℃、光照强度2000-2500lx条件下，光培养2-3周。
(6)将不定芽诱导后的愈伤组织移到芽增殖培养基(1/2MS+6-BA 100mg/L+NAA0.05mg/L+Cef 200mg/ml+蔗糖30g/L+琼脂6g/L，pH 5.8～6.0)上，暗培养1-2天，然后在24±2℃、光照12h·d-1、光照强度2000-2500lx条件下，培养2-3周。
(7)经不定芽培养后，肉眼观察愈伤组织和发芽的叶片是否带有明显红色。然后将带明显红色的芽的愈伤组织转移到芽伸长培养基(1/2MS+NAA 0.05mg/L+PBU 1mg/mL+Vc1mg/mL+蔗糖30g/L+琼脂6g/L，pH 5.8～6.0)上，在24±2℃、光照12h·d-1、光照强度2000～2500lx条件下，培养2-3周。
(8)将得到转化后的无菌苗转入生根培养基(1/2MS+IBA 0.5mg/L+蔗糖30g/L+琼脂6g/L，pH 5.8～6.0)上，在24±2℃、光照12h·d-1、光照强度2000～2500lx条件下，培养4周。
(9)将生根良好的幼苗从恒温光照培养箱移至室外自然环境中炼苗7d，揭开封瓶膜在练苗2d，移栽到灭菌的黄心土中生长，得到带有可见光下裸眼可见的红色蛋白报告基因RUBY的再生植株。
将带有红色蛋白报告基因RUBY的工程菌浸染愈伤组织，共培养后，愈伤组织有明显变红趋势。在可见光下，浸染后的愈伤组织与对照组愈伤组织对比，可以观察到新生愈伤为明显的宝石红色，表明RUBY基因成功表达。红色愈伤数及转化成功率见表1。这种基于RUBY表型的筛选方法，加快了筛选阳性转化子的效率。
表1愈伤生长情况
Tab 1The growth situation of callus
Figure BDA0003199673690000051
将表达出宝石红色表型的愈伤组织更换至促芽培养基，光培养，待不定芽生长后，可以观察到不定芽叶片呈现明显的宝石红色，表明在再生体的叶片中RUBY基因可以正常表达,红色愈伤组织出芽率见表2。与对照组不定芽相比较，能高分辨率的区分开。
表2出芽情况
Tab 2The condition of budding
Figure BDA0003199673690000052

Claims (1)

1.一种可见光下带有肉眼可见的筛选标记的桉树遗传转化方法，其特征在于一种可见光下裸眼可视化筛选标记的桉树遗传,转化方法包括以下步骤：
(1)去掉尾巨桉无菌苗顶芽与根部，将下胚轴切成0.2～0.5cm长无芽点的小段，将此接种于愈伤诱导培养基(MS+PBU 1mg/L+IAA 0.05mg/L+Vc 100mg/L+乙酰丁香酮2mg/L+蔗糖30g/L+琼脂6g/L，pH 5.8-6.0暗培养一周，培养温度24±2℃；
(2)愈伤培养后，将愈伤组织置于浸染培养基(MS+蔗糖30g/L),超声波震荡30S后加入带有红色蛋白报告基因RUBY的农杆菌，避光于28℃、200r的摇床中摇3h；
(3)将浸染后的愈伤组织转移到愈伤诱导培养基(MS+PBU 1mg/L+IAA 0.05mg/L+Vc100mg/L+乙酰丁香酮2mg/L+蔗糖30g/L+琼脂6g/L，pH 5.8-6.0)上24±2℃暗培养4-5天；
(4)将上述愈伤组织转移到不定芽诱导培养基(1/2MS+NAA 0.05mg/L+6-BA 100mg/L+腐胺500mmol/L+亚精胺100mmol/L+Vc 100mg/L+蔗糖30g/L+琼脂6g/L，pH 5.8～6.0)上，24±2℃暗培养一周,然后转移到24±2℃、光照强度2000-2500lx条件下，光培养2-3周；
(4)将不定芽诱导后的愈伤组织移到芽增殖培养基(1/2MS+6-BA 100mg/L+NAA0.05mg/L+Cef 200mg/L+蔗糖30g/L+琼脂6g/L，pH 5.8～6.0)上，暗培养1-2天，然后在24±2℃、光照12h·d-1、光照强度2000-2500lx条件下，培养2-3周；
(5)经不定芽培养后，肉眼观察愈伤组织和发芽的叶片是否带有明显红色,然后将带明显红色的芽的愈伤组织转移到芽伸长培养基(1/2MS+NAA 0.05mg/L+PBU 1mg/L+Vc 100mg/L+蔗糖30g/L+琼脂6g/L，pH 5.8～6.0)上，在24±2℃、光照12h·d-1、光照强度2000～2500lx条件下，培养2-3周；
(6)将得到转化后的无菌苗转入生根培养基(1/2MS+IBA 0.5mg/L+蔗糖30g/L+琼脂6g/L，pH 5.8～6.0)上，在24±2℃、光照12h·d-1、光照强度2000～2500lx条件下，培养4周；
(7)将生根良好的幼苗从恒温光照培养箱移至室外自然环境中炼苗7d，揭开封瓶膜在练苗2d，移栽到灭菌的黄心土中生长，得到带有可见光下裸眼可见的红色蛋白报告基因RUBY的再生植株。
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