CN116042694A - 禾本科狼尾草属植物非组培遗传转化方法 - Google Patents
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Abstract
禾本科狼尾草属植物非组培遗传转化方法，步骤为：生长到两米的巨菌草，拨开茎节处的叶子，选取大小为1.5‑2.5cm的嫩芽作为外植体，准备侵染；将含有目标基因的农杆菌加入转化缓冲液中，用注射器吸入含有农杆菌的转化缓冲液，接入针头，将针头伸入到嫩芽基部，注射至嫩芽中，直至侵染整个嫩芽，将接种好的嫩芽用黑色的塑料薄膜包裹，24小时候取下薄膜，完成转化。本发明通过茎节未抽枝的嫩芽作为外植体侵染农杆菌实现目标高效转化或基因编辑，抽枝后即可直接剪枝移栽到土壤或水培即得到了转基因材料。方法简单易操作，并且不要求无菌环境，无需组织培养。
Description
技术领域
本发明属于生物技术和植物基因工程领域，具体涉及一种禾本科狼尾草属植物非组培遗传转化方法。
背景技术
我国土壤环境状况总体不容乐观，部分地区土壤污染较重，耕地土壤环境质量堪忧，工矿业废弃地土壤环境问题突出。全国土壤总的超标率为16.1％，其中镉、汞、砷、铜、铅、铬、锌、镍8种无机污染物点位超标占全部超标点位的82.8％。受重金属污染的土地超过2000万公顷，每年造成的粮食减产超过1000万吨，另外被重金属污染的粮食超过1200万吨，每年造成的直接经济损失超过200亿元人民币。利用生物的生命代谢活动减少污染环境中有毒有害物的浓度或使其无害化，从而使污染了的环境能够部分的或完全的恢复到原初状态的过程。按所利用的生物种类，可分为微生物修复、动物修复和植物修复。
其中植物富集是去除污染土壤中重金属和金属的最重要、最有效的植物修复技术，能够原位将土壤中重金属提取出来，成本低廉，经济上更加实用，在修复重金属污染土壤的同时能够起到保持周围的水土环境的作用，而且植物修复法能够提高土壤有机质的含量，提高土壤质量，是一种更加新型、高效、绿色的治理方法，具有非常广阔的发展前景。但重金属超积累植物仍存在生长周期长、生物量小以及富集效率低等特点，相反一些非超积累植物的生物量较大但金属和重金属的富集能力较差。理想的植物修复材料不仅具有超强的吸收和转运金属和重金属的能力，还需具有较大的生物量和一定的经济效益。所以通过引入特定的基因，改变植物的遗传性状，实现生物量大，生长周期短的植物对金属和重金的高效吸收和转运，并固定在地上部，实现污染土壤的原位修复，是一种快捷、有效的生物修复方法。
禾本科狼草属植物(象草和巨菌草)抗逆性强，根系发达，利用期长，生长速度快，为直立丛生的多年生植物，植株高大，一般为3-5m，有的也可达到6-8m，是典型的C4植物，光合效率很高，是其他阔叶树的4-7.46倍，年产鲜草达200-400t/hm2。但建立组织培养遗传转化体系实现特定金属富集基因的转化，不仅耗时长而且难度大，迄今为止无人突破。建立禾本科狼属草植物遗传转化体系对金属和重金属污染土壤的修复具有重要的实践意义。
发明内容
解决的技术问题：针对当前环境污染问题越来越受到关注，建立生物量大，生长周期长的禾本科狼属草植物转化体系，为植物修复金属污染土壤提供了重要的富集材料。本发明提供一种禾本科狼尾草属植物非组培遗传转化方法，成功实现了目标基因在禾本科狼尾属草巨菌草的遗传转化，最终为解决土壤污染，培育生物量大，生长周期长的植物修复方法提供了基因资源和技术支持。
技术方案：禾本科狼尾草属植物非组培遗传转化方法，步骤为：生长到两米的巨菌草，拨开茎节处的叶子，选取大小为1.5-2.5cm的嫩芽作为外植体，准备侵染；将含有目标基因的农杆菌加入转化缓冲液中，用注射器吸入含有农杆菌的转化缓冲液，接入针头，将针头伸入到嫩芽基部，注射至嫩芽中，直至侵染整个嫩芽，将接种好的嫩芽用黑色的塑料薄膜包裹，24小时候取下薄膜，完成转化。
上述转化缓冲液的成分为：1/2MS 2.2g/L，蔗糖50g/L，4.4mM 6BA 100μL/L，Silvet L-77400μL/L，AS 200μm。
上述目标基因的核酸序列如SEQ ID NO.1所示。
如SEQ ID NO.1所示的目标基因在禾本科狼尾草属植物非组培遗传转化中的应用。
如SEQ ID NO.1所示的目标基因在制备禾本科狼尾草属植物非组培遗传转化试剂盒中的应用。
禾本科狼尾草属植物非组培遗传转化试剂盒，含有上述的转化缓冲液和SEQ IDNO.1所示的目标基因。
有益效果：本发明克服了国内外原有禾本科狼草属巨菌草遗传转化的困难，所提供的技术方案采用茎节处嫩芽作为外植体，通过注射器注射农杆菌侵染液，快速侵染茎节幼芽且不会致死，有利于实现目标基因在外植体中的快速表达，避免了组织培养的过程，同时本发明不要求无菌的环境，高效快捷简单。通过农杆菌侵染的嫩芽抽生的枝条提取DNA鉴定到目标基因，成功实现了禾本科狼草属非组培遗传体系的建立。
附图说明
图1禾本科狼草属巨菌草生长到2米左右；
图2禾本科狼草属巨菌草转基因的茎节嫩芽；
图3禾本科狼草属巨菌草侵染农杆菌的嫩芽抽生的嫩枝；
图4禾本科狼草属巨菌草转入的目标基因GFP的凝胶电泳检测结果示意图；
图5禾本科狼草属巨菌草转入目标基因的嫩芽抽生枝条中目标基因的鉴定。可以显示出来之前传统组织培养方法的困难性，污染率高，周期长，要求无菌操作，无菌培养，并且需要较大的组培室，占地面积大。更主要的是很难实现目标基因的导入。
具体实施方式
实施例1：
1)禾本科植物狼草属巨菌草材料的准备
生长到两米左右的巨菌草(见图1)，转基因前浇足水肥保持植株健壮生长，拨开茎节处的叶子找到大小为1.5-2.5cm的嫩芽作为外植体(见图2)，准备侵染。
2)侵染液的制备
将冻存在-80℃的农杆菌菌中划线，37℃活化2d后，挑去取单克隆。在液体LB培养基中37℃，200rpm，小摇1.5d后，以1:100(v/v)比例转大摇，37℃，200rpm，培养12h。用酶标仪对菌液浓度进行测定，当OD600在0.8-1.1时，将菌液4000rpm，15min室温条件下离心，收集菌体，去除上清液。
配制转化缓冲液，具体成分见表1。一般每300mL菌液离心的菌体加入300mL转化缓冲液。将重悬的菌液转移至干净的烧杯中，准备好1mL或5mL的注射器一到数支，根据转化的基因数目确定，不同的基因不能交叉使用同一套耗材。
3)农杆菌侵染外植体
用注射器吸入制备好的菌液，接入针头，将针头伸入到嫩芽基部，轻轻注射菌液至嫩芽中，直至菌液侵染整个嫩芽。将接种好的嫩芽用黑色的塑料薄膜包裹，24小时候取下薄膜，嫩芽一般呈粉红色(见图3)，用记号笔标记芽体所注射的质粒。待抽出嫩枝后，标记嫩枝下一步可以做PCR鉴定。
4)鉴定目标基因
转入目标基因GFP，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。使用聚合酶链式反应(PCR)技术检测外植体中目的基因是否表达，确定遗传转化体系的成功和稳定性，片段为720bp，见图4。经鉴定，目标基因成功转入到外植体中，该体系可实现禾本科狼草属非组培技术遗传转化见图5。
表1侵染液的成分
Claims (6)
1.禾本科狼尾草属植物非组培遗传转化方法，其特征在于，步骤为：生长到两米的巨菌草，拨开茎节处的叶子，选取大小为1.5-2.5cm的嫩芽作为外植体，准备侵染；将含有目标基因的农杆菌加入转化缓冲液中，用注射器吸入含有农杆菌的转化缓冲液，接入针头，将针头伸入到嫩芽基部，注射至嫩芽中，直至侵染整个嫩芽，将接种好的嫩芽用黑色的塑料薄膜包裹，24小时候取下薄膜，完成转化。
2.根据权利要求1所述禾本科狼尾草属植物非组培遗传转化方法，其特征在于，所述转化缓冲液的成分为：1/2 MS 2.2 g/L，蔗糖50 g/L，4.4 mM 6BA 100 µL/L，Silvet L-77400 µL/L，AS 200 µm。
3.根据权利要求1所述禾本科狼尾草属植物非组培遗传转化方法，其特征在于，所述目标基因的核酸序列如SEQ ID NO.1所示。
4.如SEQ ID NO.1所示的目标基因在禾本科狼尾草属植物非组培遗传转化中的应用。
5.如SEQ ID NO.1所示的目标基因在制备禾本科狼尾草属植物非组培遗传转化试剂盒中的应用。
6.禾本科狼尾草属植物非组培遗传转化试剂盒，其特征在于，含有权利要求2所述的转化缓冲液和SEQ ID NO.1所示的目标基因。
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