CN111117919B - 一株产蛋白酶、产铁载体的苏云金芽孢杆菌及其应用 - Google Patents

一株产蛋白酶、产铁载体的苏云金芽孢杆菌及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一株产蛋白酶、产铁载体的苏云金芽孢杆菌及其应用，属于微生物技术领域。该菌株已于2019年12月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其生物保藏号为CGMCC No.19224。本发明的苏云金芽孢杆菌其具有产生蛋白酶、产铁载体等功能，本发明筛选获得的苏云金芽孢杆菌能够明显改善生姜生长时期的铁营养状况，增强生姜的根系活力，促进生姜地径的生长，提高植株生物量，增加生姜茎叶干湿重，从而证明了本发明提供菌株的促生效果，具有良好的实际应用之价值。

Description

一株产蛋白酶、产铁载体的苏云金芽孢杆菌及其应用
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体涉及一株产蛋白酶、产铁载体的苏云金芽孢杆菌及其应用。
背景技术
本发明背景技术中公开的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
生姜是我国主要的经济蔬果之一，在我国的种植面积十分广泛，我国也成为世界上生姜栽培面积最大且生产总量最多的国家，统计在2018年中国生姜种植面积就到了29.9万hm2，其中北方则主要以山东省种植面积最大。但是随着种植面积的扩大，生姜病害也日益严重，许多问题也就逐渐凸显。由于长期使用化学农药，导致土壤板结，肥力下降不能供给足够的营养给生姜正常生长，造成大量减产。因此，筛选出有利于生姜生长的植物促生菌并制备菌剂，有效的遏制以上问题的发生成为一条新的途径，通过植物促生菌剂不仅可以提高农产品的质量和产量，而且不会对周围环境造成不良影响，还可以有效的改良土壤营养情况。
蛋白酶是水解蛋白质肽链的一类酶的总称，能催化蛋白质和多肽水解，广泛存在于动物内脏、植物茎叶、果实和微生物中。本发明的菌株具有产蛋白酶的作用，所产生蛋白酶可以降解土壤中的蛋白质来增加土壤中的氨基酸含量，促进植物的生长。
铁载体是一类具有很强的特异螯合Fe3+(螯合系数可达1020-1030)的小分子(1-2ku)化合物。铁元素虽在地壳中含量较高，但是由于地球上的富氧环境，铁元素以溶解度极低的氧化物形式存在,植物难以直接吸收利用。细菌则可以从周围环境中溶解铁分泌铁载体，形成复杂的铁-铁载体复合体，然后复合体可通过扩散移动返回到根系细胞表面，供植物利用。
目前，关于芽孢杆菌产蛋白酶和细菌产铁载体的报道较多，但关于同时具有产蛋白酶、产铁载体和在生姜上显著促生作用的芽孢杆菌却鲜有报道。
发明内容
针对现有技术中的不足，本发明的目的在于提供一株产蛋白酶、产铁载体的苏云金芽孢杆菌及其应用，经试验证明，本发明提供的苏云金芽孢杆菌能够明显改善生姜生长时期的铁营养状况，增强生姜的根系活力，促进生姜地径的生长，增加生姜茎叶干湿重等，并且有效的丰富了植物促生菌的菌种资源。
为实现上述发明目的，本发明公开以下技术方案：
本发明的第一个方面，提供一株苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)TA-202，该菌株已于2019年12月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，其生物保藏号为CGMCC No.19223。
本发明的第二个方面，提供一种微生物接种剂，其含有所述苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)TA-202。将本发明微生物接种剂在生姜定苗后灌根处理，可以显著促进生姜生长。
具体的，所述微生物接种剂是将所述苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)TA-202接种于液体培养基中进行培养获得；
其中，所述液体培养基优选为LB培养基；
所述LB培养基组分为：酵母浸膏，0.5％，蛋白胨，1％，氯化钠，1％，蒸馏水，1000mL。121℃灭菌20min，pH7.0。
培养条件具体为：在30～40℃(优选为37℃)培养20～30h(优选为24h)，转速：160-200rpm(优选180rpm)。
本发明的第三个方面，上述苏云金芽孢杆菌TA-202和/或微生物接种剂在如下1)-4)中全部或部分中的应用也是本发明保护的范围：
1)产蛋白酶；
2)产铁载体；
3)改善植物根际土壤营养情况；
4)促进植物生长。
其中，所述植物具体为生姜，本发明中改善植物根际土壤营养情况具体为上述苏云金芽孢杆菌TA-202和/或微生物接种剂在土壤中产生蛋白酶和铁载体，从而改善生姜根际土壤营养情况。
促进植物生长具体表现为：改善生姜生长时期的铁营养状况，增强生姜的根系活力，促进生姜地径的生长，增加生姜茎叶干湿重。
本发明的第四个方面，提供一种促进生姜生长的方法，所述方法包括在生姜定苗后，向生姜植株根际土壤中施用上述苏云金芽孢杆菌TA-202和/或微生物接种剂。具体的，施用方式包括但不限于喷施、灌注；更具体的，施用方式为将苏云金芽孢杆菌TA-202和/或微生物接种剂进行灌根处理。
与现有技术相比，本发明取得了以下有益效果：
本发明首次报道了一株产蛋白酶、产铁载体的苏云金芽孢杆菌，经盆栽试验证明，用本发明的产蛋白酶、产铁载体的芽孢杆菌的菌液在生姜定苗后灌根处理，在土壤中能产生蛋白酶和铁载体，改善生姜生长时期的铁营养状况，增强生姜的根系活力，促进生姜地径的生长，增加生姜茎叶干湿重。从而证明了本发明提供菌株的促生效果，因此具有良好的实际应用价值。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
图1为本发明实施例1中苏云金芽孢杆菌的镜检图。
图2为本发明实施例1中苏云金芽孢杆菌的LB平板菌落图。
图3为本发明实施例2中苏云金芽孢杆菌产蛋白酶能力图。
图4为本发明实施例2中苏云金芽孢杆菌的产铁载体能力图。
图5为本发明实施例3中苏云金芽孢杆菌盆栽试验促生效果图。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
现结合具体实例对本发明作进一步的说明，以下实例仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。如果实施例中未注明的实验具体条件，通常按照常规条件，或按照试剂公司所推荐的条件；下述实施例中所用的试剂、耗材等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
本发明的一个具体实施方式中，提供一株苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis)TA-202，该菌株已于2019年12月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，其生物保藏号为CGMCCNo.19223。
通过测定该菌株的16S rDNA基因序列(见SEQ ID NO.1)并通过形态特征及生理生化指标测定，确定该菌株为苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)。
具体的，所述苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)TA-202在LB平板培养基(酵母浸膏，0.5％，蛋白胨，1％，氯化钠，1％，琼脂，1.6％，蒸馏水，1000mL，121℃灭菌20min，pH7.0)上培养24h后菌落呈圆形规则状，乳白色，凸起，不透明；菌体呈长杆状，产芽孢，革兰氏阳性。
所述苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)TA-202的生理生化特征为：淀粉水解试验阳性，明胶液化试验阳性，葡萄糖发酵试验阳性，阿拉伯糖发酵试验阴性，甘露醇发酵试验阳性，木糖发酵试验阳性。
本发明的又一具体实施方式中，提供上述苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis)TA-202的培养方法，具体为：将活化后的苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis)TA-202置于LB液体培养基中培养，培养条件为37℃下有氧培养24h，如摇床振荡(180rpm)培养。
本发明的又一具体实施方式中，提供一种微生物接种剂，其含有所述苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)TA-202。
本发明的又一具体实施方式中，所述微生物接种剂的剂型可以为液剂、乳剂、悬浮剂、粉剂、颗粒剂、可湿性粉剂或水分散粒剂。
本发明的又一具体实施方式中，所述微生物接种剂还可包括菌剂可接受的辅料。
本发明的又一具体实施方式中，所述辅料选自分散剂、润湿剂、崩解剂、粘结剂、消泡剂、抗冻剂、增稠剂、填料和溶剂中的一种或多种。本发明对所述菌剂可接受的辅料的来源等没有特殊限制，一般采用市售产品即可。
其中，所述分散剂为阴离子型分散剂和/或非离子型分散剂，可选自木质素磺酸钠、萘磺酸钠甲醛缩合物、亚甲基双萘磺酸钠、甲醛缩合物硫酸盐、聚羧酸盐、烷基酚聚氧乙烯基磷酸酯和脂肪酸聚氧乙烯酯中的一种或多种。
所述湿润剂可选自十二烷基硫酸钠、十二烷基苯磺酸钠、皂角粉、无患子粉、茶枯粉和拉开粉BX中的一种或多种。
所述崩解剂可选自膨润土、硫酸铵、氯化铝、尿素、氯化镁和葡萄糖中的一种或多种。
所述粘结剂可选自淀粉、硅藻土、环糊精、松香、羧甲基纤维素、羧乙基纤维素和羧甲基纤维素盐中的一种或多种。
所述消泡剂可选自C8～C20脂肪醇类化合物、C10～C20饱和脂肪酸类化合物、环氧大豆油、乙醇、硅酮类化合物和有机硅油中的一种或多种。
所述抗冻剂可选自山梨醇、乙二醇、聚乙二醇、丙二醇、丙三醇、尿素和氯化钠中的一种或多种。
所述增稠剂可选自明胶、黄原胶、聚乙二醇和聚乙烯醇中的一种或多种。
所述填料可选自轻质碳酸钙、硅藻土、膨润土、凹凸棒土和白炭黑中的一种或多种。
所述溶剂可选自水(优选为去离子水)或油酸甲酯。
本发明的又一具体实施方式中，上述苏云金芽孢杆菌TA-202和/或微生物接种剂在如下1)-4)中全部或部分中的应用也是本发明保护的范围：
1)产蛋白酶；
2)产铁载体；
3)改善植物根际土壤营养情况；
4)促进植物生长。
其中，所述植物具体为生姜，本发明中改善植物根际土壤营养情况具体为通过上述苏云金芽孢杆菌TA-202和/或微生物接种剂在土壤中产生蛋白酶和铁载体，从而改善生姜根际土壤营养情况。
促进植物生长具体表现为：改善生姜生长时期的铁营养状况，增强生姜的根系活力，促进生姜地径的生长，增加生姜茎叶干湿重中的一种或多种。
本发明的又一具体实施方式中，提供一种促进生姜生长的方法，所述方法包括在生姜定苗后，向生姜植株根际土壤中施用上述苏云金芽孢杆菌TA-202和/或微生物接种剂。施用方式包括但不限于喷施、灌注。更具体的，施用方式为将苏云金芽孢杆菌TA-202和/或微生物接种剂进行灌根处理。
以下通过实施例对本发明做进一步解释说明，但不构成对本发明的限制。应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中为注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件进行。
实施例1：菌株鉴定
本发明通过对筛选获得的一株具有促生姜生长的菌株，经16S rDNA以及生理生化指标鉴定，确定该菌株为苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)。如图1和2所示，所述苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)TA-202的菌落及菌体特征为：在LB培养基上培养24h后菌落呈圆形规则状，乳白色，凸起，不透明；菌体呈长杆状，产芽孢，革兰氏阳性。
该菌株的生理生化特征为：淀粉水解试验阳性，明胶液化试验阳性，葡萄糖发酵试验阳性，阿拉伯糖发酵试验阴性，甘露醇发酵试验阳性，木糖发酵试验阳性。
所述苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)TA-202的16S rDNA序列如下：
GCTATAATGCAAGTCGAGCGAATGGATTAAGAGCTTGCTCTTATGAAGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCCATAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATAACATTTTGAACTGCATGGTTCGAAATTGAAAGGCGGCTTCGGCTGTCACTTATGGATGGACCCGCGTCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCAACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGCTTTCGGGTCGTAAAACTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTGCTAGTTGAATAAGCTGGCACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTATCCGGAATTATTGGGCGTAAAGCGCGCGCAGGTGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCACGGCTCAACCGTGGAGGGTCATTGGAAACTGGGAGACTTGAGTGCAGAAGAGGAAAGTGGAATTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATATGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTTTCTGGTCTGTAACTGACACTGAGGCGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGAGGGTTTCCGCCCTTTAGTGCTGAAGTTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCTGAAAACCCTAGAGATAGGGCTTCTCCTTCGGGAGCAGAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCATCATTAAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACGGTACAAAGAGCTGCAAGACCGCGAGGTGGAGCTAATCTCATAAAACCGTTCTCAGTTCGGATTGTAGGCTGCAACTCGCCTACATGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGTAACACCCGAAGTCGGTGGGGTAACCTTTTTGGAGCCAGCCGCCTA(SEQ IDNo.1)。
实施例2：苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)TA-202对生姜的促生试验
发酵液的制备方法：将斜面保存的菌种转接到装有5mL LB液体培养基的试管中，放在恒温摇床中培养12h，温度：37℃，转速：180rpm；将活化好的菌液按1％接种量接入到50mL LB液体培养基中，放入摇床培养24h，温度：37℃，转速：180rpm，制成发酵液。
其中，LB液体培养基：酵母浸膏，0.5％，蛋白胨，1％，氯化钠，1％，蒸馏水，1000mL。121℃灭菌20min，pH7.0。
将生姜幼苗移栽到盆栽土壤中，在生姜定苗后取2mL菌液稀释(稀释倍数为100倍)，然后盆栽中每株生姜使用200mL稀释后菌液进行灌根处理(CK组为取2mL灭菌LB液体培养基稀释到200mL后进行灌根处理)。在培养50d后检测对生姜的促生效果，结果如表1以及图3所示。可以看出：在盆栽条件下，用本发明苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)TA-202的菌液在实际土壤条件下对生姜生长初期灌根处理后，能够对生姜产生很好的促生效果，生姜株高、生姜地径、最大根长和茎叶湿重较对照组均有很大的增加，达到了显著或极显著差异。
表1促生效果
Figure BDA0002358337090000111
实施例3：菌株TA-202产蛋白酶、产铁载体试验
检测苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)TA-202产蛋白酶、产铁载体能力，结果如表2-3以及图4-5所示。
表2蛋白酶产生结果
Figure BDA0002358337090000121
表3铁载体定量结果
Figure BDA0002358337090000122
综上，本发明筛选获得的苏云金芽孢杆菌具有产蛋白酶、铁载体等作用，同时本发明筛选的菌株在盆栽条件下对生姜促生效果的研究，所采用的试验方法更贴近实际应用状态，通过直接以土壤种植生姜为试验样品，接近于生姜的农业种植方式，这也有力地说明了在生产种植中对生姜促生方面的效果是非常明显的。同时，本发明检测了盆栽生姜株高、最大根长、地径以及茎叶湿重等，证明了本发明菌株对生姜的促生效果。
应注意的是，以上实例仅用于说明本发明的技术方案而非对其进行限制。尽管参照所给出的实例对本发明进行了详细说明，但是本领域的普通技术人员可根据需要对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 山东农业大学
<120> 一种产蛋白酶、产铁载体的苏云金芽孢杆菌及其应用
<130>
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1429
<212> DNA
<213> 苏云金芽孢杆菌TA-202 16S rDNA
<400> 1
gctataatgc aagtcgagcg aatggattaa gagcttgctc ttatgaagtt agcggcggac 60
gggtgagtaa cacgtgggta acctgcccat aagactggga taactccggg aaaccggggc 120
taataccgga taacattttg aactgcatgg ttcgaaattg aaaggcggct tcggctgtca 180
cttatggatg gacccgcgtc gcattagcta gttggtgagg taacggctca ccaaggcaac 240
gatgcgtagc cgacctgaga gggtgatcgg ccacactggg actgagacac ggcccagact 300
cctacgggag gcagcagtag ggaatcttcc gcaatggacg aaagtctgac ggagcaacgc 360
cgcgtgagtg atgaaggctt tcgggtcgta aaactctgtt gttagggaag aacaagtgct 420
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gcaggtggtt tcttaagtct gatgtgaaag cccacggctc aaccgtggag ggtcattgga 600
aactgggaga cttgagtgca gaagaggaaa gtggaattcc atgtgtagcg gtgaaatgcg 660
tagagatatg gaggaacacc agtggcgaag gcgactttct ggtctgtaac tgacactgag 720
gcgcgaaagc gtggggagca aacaggatta gataccctgg tagtccacgc cgtaaacgat 780
gagtgctaag tgttagaggg tttccgccct ttagtgctga agttaacgca ttaagcactc 840
cgcctgggga gtacggccgc aaggctgaaa ctcaaaggaa ttgacggggg cccgcacaag 900
cggtggagca tgtggtttaa ttcgaagcaa cgcgaagaac cttaccaggt cttgacatcc 960
tctgaaaacc ctagagatag ggcttctcct tcgggagcag agtgacaggt ggtgcatggt 1020
tgtcgtcagc tcgtgtcgtg agatgttggg ttaagtcccg caacgagcgc aacccttgat 1080
cttagttgcc atcattaagt tgggcactct aaggtgactg ccggtgacaa accggaggaa 1140
ggtggggatg acgtcaaatc atcatgcccc ttatgacctg ggctacacac gtgctacaat 1200
ggacggtaca aagagctgca agaccgcgag gtggagctaa tctcataaaa ccgttctcag 1260
ttcggattgt aggctgcaac tcgcctacat gaagctggaa tcgctagtaa tcgcggatca 1320
gcatgccgcg gtgaatacgt tcccgggcct tgtacacacc gcccgtcaca ccacgagagt 1380
ttgtaacacc cgaagtcggt ggggtaacct ttttggagcc agccgccta 1429

Claims (13)

1.一株苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)TA-202，该菌株已于2019年12月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其生物保藏号为CGMCCNo.19223。
2.一种微生物接种剂，其特征在于，其含有权利要求1所述苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)TA-202。
3.如权利要求2所述的微生物接种剂，其特征在于，所述微生物接种剂由苏云金芽孢杆菌TA-202接种于液体培养基中进行培养得到的。
4.如权利要求3所述的微生物接种剂，其特征在于，所述液体培养基为LB培养基。
5.如权利要求3所述的微生物接种剂，其特征在于，培养条件具体为：在30～40℃培养20～30h，转速：160-200rpm。
6.如权利要求5所述的微生物接种剂，其特征在于，培养条件具体为：在37℃培养24h，转速：180rpm。
7.如权利要求2所述的微生物接种剂，其特征在于，所述微生物接种剂还包括菌剂可接受的辅料。
8.如权利要求7所述的微生物接种剂，其特征在于，所述辅料选自分散剂、润湿剂、崩解剂、粘结剂、消泡剂、抗冻剂、增稠剂、填料和溶剂中的一种或多种。
9.如权利要求2所述的微生物接种剂，其特征在于，所述微生物接种剂的剂型为液剂、乳剂、悬浮剂、粉剂、颗粒剂、可湿性粉剂或水分散粒剂。
10.权利要求1所述苏云金芽孢杆菌TA-202和/或权利要求2-9任一项所述微生物接种剂在如下1)-4)中全部或部分中的应用：
1)产蛋白酶；
2)产铁载体；
3)促进生姜生长。
11.权利要求10所述应用，其特征在于，促进生姜生长包括：
改善生姜生长时期的铁营养状况，增强生姜的根系活力，促进生姜地径的生长，提高植株生物量，增加生姜茎叶干湿重中的一种或多种。
12.一种促进生姜生长的方法，其特征在于，所述方法包括在生姜定苗后，向生姜植株根际土壤中施用权利要求1所述苏云金芽孢杆菌TA-202和/或权利要求2-9任一项所述微生物接种剂。
13.一种促进生姜生长的方法，其特征在于，所述施用方式包括：将权利要求1所述的苏云金芽孢杆菌TA-202和/或权利要求2-9任一所述的微生物接种剂对生姜进行灌根处理。
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