CN108277166B - 一株棘孢木霉及其在铅污染土壤修复中的应用 - Google Patents

一株棘孢木霉及其在铅污染土壤修复中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一株棘孢木霉(Trichoderma asperellum)，该菌株已于2018年1月22日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其生物保藏号为：CGMCC NO.15266。本发明筛选分离得到的棘孢木霉(Trichoderma asperellum)对多种重金属，特别是铅具有优异的耐受和吸附能力，在重金属污染的土壤中，特别是在铅污染的土壤中容易定殖、存活，适于进行土壤的微生物修复。

Description

一株棘孢木霉及其在铅污染土壤修复中的应用
技术领域
本发明涉及农业微生物及生态修复技术领域，具体涉及一株棘孢木霉及其在铅污染土壤修复中的应用。
背景技术
铅是重金属污染土壤中分布较广、具有强蓄积性的环境污染物。我国各个地区均有不同程度的铅污染现象，铅中毒事件也频频发生。大气、水体和土壤等环境要素中均存在铅污染的情况，但相比于大气和水体而言，土壤中铅污染现象更为普遍。进入土壤中的铅大多存在于表土层，几乎不向下移动。铅在土壤中易与有机物结合，极不易溶解。过量的铅会阻滞作物生长发育，主要表现为叶绿素下降，阻碍植物的呼吸及光合作用，从而降低产量和质量。铅具有强累积性，通过食物链的富集，人体中的铅能与多种酶结合从而干扰有机体多方面的生理活动，严重损害人的神经、消化、免疫和生殖系统，对人类健康造成威胁。土壤铅污染具有隐蔽性、长期性和不可逆性等特点，已经受到广泛关注，铅污染土壤的高效修复技术一直是研究的热点与难点。
目前，铅污染土壤的修复技术主要有物理化学修复、植物修复和微生物修复，其中，传统的物理化学修复方法收效较快，但工程量大，需要消耗大量能源或化学制品等，成品较高，而且某些钝化剂的使用甚至会造成修复污染土壤同时对土壤理化性质产生不良影响，从而影响土壤的后续利用；植物修复操作不便；而利用微生物修复则具有广阔的应用前景。
棘孢木霉是在生物防治和环境保护等方面研究较多的一种菌，目前有报道棘孢木霉对重金属铅具有优良的耐受和吸附能力，可以降低植物中的铅含量(CN105969668A)。但应用棘孢木霉进行铅污染土壤修复时，一般是将棘孢木霉添加到铅污染土壤中，土壤中的诸多非生物因子和生物因子会影响外源施入棘孢木霉的定殖能力和存活期，因此，筛选能够适应重金属污染土壤的微生物对于土壤修复而言具有重要的意义。
发明内容
针对上述现有技术，发明人经长期的技术与实践探索，从铅污染的土壤中分离筛选出一株棘孢木霉(Trichoderma asperellum)，该菌株对重金属铅具有优异的耐受和吸附能力；同时还对Cd、Cu、Zn等重金属具有耐受和吸附能力；而且可以在重金属污染的土壤环境中稳定存活并增殖，可以用于铅污染土壤的修复。
具体的，本发明涉及以下技术方案：
本发明的第一方面，提供了一株棘孢木霉(Trichoderma asperellum)，该菌株已于2018年1月22日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，其生物保藏号为：CGMCC NO.15266。
所述棘孢木霉(Trichoderma asperellum)具有如下特征：
28℃黑暗下培养7天菌落可铺满90mm，菌落周围有白色菌丝，分生孢子梗垂直对称分歧，绿色，尖端生分生孢子团。
本发明的第二方面，提供含有所述棘孢木霉(Trichoderma asperellum)的菌剂。
本发明的第三方面，提供所述棘孢木霉(Trichoderma asperellum)在重金属污染土壤修复中的应用。
进一步的，所述重金属包括：Pb、Cd、Cu和Zn。更为优选的，所述重金属为Pb。
本发明的第四方面，提供所述棘孢木霉(Trichoderma asperellum)在制备耐重金属污染降解试剂中的应用。
本发明的第五方面，提供一种用于重金属污染土壤修复的制剂，其活性成分为所述棘孢木霉(Trichoderma asperellum)、棘孢木霉(Trichoderma asperellum)的发酵液、菌悬液和/或上清液。优选的，所述重金属污染为铅污染。
本发明的第六方面，提供一种铅污染土壤修复的方法，步骤为：将所述棘孢木霉(Tr ichoderma asperellum)的发酵液、菌体裂解液或孢子悬液喷施于铅污染的土壤中；或者所述棘孢木霉(Trichoderma asperellum)接种到锯木屑中培养，调节pH至7.0，在30℃培养7-14天，然后将接种有棘孢木霉的锯木屑施入铅污染的土壤中。
本发明还提供所述棘孢木霉(Trichoderma asperellum)在降低土壤中铅对植物的胁迫作用、降低铅在植物中的累积以及促进植物生长中的应用。
优选的，所述植物为禾本科草本植物。
本发明的有益效果：
本发明筛选分离得到的棘孢木霉(Trichoderma asperellum)对重金属铅具有优异的耐受和吸附能力，同时还对Cd、Cu、Zn等重金属具有耐受和吸附能力，具有广泛的重金属耐受性。更为关键的是，本发明的棘孢木霉在重金属污染的土壤中，特别是在铅污染的土壤中容易定殖、存活，适于进行土壤的微生物修复。而且，该棘孢木霉(Trichodermaasperellum)对植物还具有促生作用，能够有效降低土壤中铅对植物的胁迫作用。
附图说明
图1：菌株对铅离子的去除率；
图2：菌株对铅离子的吸附量；
图3：总蛋白含量测定结果；
图4：生物量测定结果。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
正如背景技术部分所介绍的，利用微生物对铅污染土壤进行修复具有广阔的应用前景，但适应重金属污染环境是应用微生物进行生物修复的前提。目前虽然已有报道棘孢木霉具有耐铅能力，可用于铅污染土壤的治理。但是，由于在进行铅污染土壤修复时，一般需要将棘孢木霉添加到铅污染土壤中，外源加入的棘孢木霉在铅污染土壤这一特殊环境中的定殖能力与存活期的长短会直接影响铅污染土壤的修复效果。现有的棘孢木霉虽然具有耐铅能力，但由于土壤中诸多生物和非生物因子的影响，其在土壤中难以定殖与存活。基于此，本发明提供了一株棘孢木霉(Trichoderma asperellum)，该棘孢木霉对重金属铅具有优异的耐受和吸附能力，同时还对Cd、Cu、Zn等重金属具有耐受和吸附能力，在铅污染的土壤中容易定殖、存活，适于进行土壤的微生物修复。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本申请的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本申请的技术方案。如果实施例中未注明的实验具体条件，通常按照常规条件，或者按照试剂公司所推荐的条件；下述实施例中所用的试剂、耗材等，如无特殊说明，均可通过商业途径获得。
实施例1：菌株的分离和鉴定
1.菌株的分离：
选取10g采自山东某铅蓄电池厂污染区土壤置于三角瓶中，无菌条件下，加入90ml无菌水，充分振荡以使微生物从土壤中充分洗脱，然后静置20min，吸取上清液用无菌水稀释100倍；取1ml上清液均匀涂布到铅浓度为100mg/L的固体平板上(马丁氏培养基)，待菌落长成后，利用平板划线分离法接种到铅浓度为100-1500mg/L的马丁氏培养基中，30℃梯度驯化培养；将耐铅能力最强的菌落选出，对其单菌落连续采用平板划线分离法进行纯化，筛选得到具有最优耐铅能力的菌株作为进一步研究的供试菌株。
2.菌株的鉴定：
(1)形态学鉴定：
28℃黑暗下培养7天菌落可铺满90mm，菌落周围有白色菌丝，分生孢子梗垂直对称分歧，绿色，尖端生分生孢子团。
(2)分子鉴定：
在无菌条件下利用真菌DNA提取试剂盒抽提基因组DNA，提取产物利用PCR扩增后进行琼脂糖凝胶电泳检测，凝胶产物切割回收并纯化后利用真菌ITS序列测序，测序结果如SEQ ID NO.1所示，具体如下：
TCCTACCTGATCCGAGGTCACATTTCAGAAAGTTGGGTGTTTTACGGACGTGGACGCGCCGCGCTCCCGGTGCGAGTTGTGCAAACTACTGCGCAGGAGAGGCTGCGGCGAGACCGCCACTGTATTTCGGGGCCGGCACCCGTGTGAGGGGTCCCGATCCCCAACGCCGATCCCCCGGAGGGGTTCGAGGGTTGAAATGACGCTCGGACAGGCATGCCCGCCAGAATACTGGCGGGCGCAATGTGCGTTCAAAGATTCGATGATTCACTGAATTCTGCAATTCACATTACTTATCGCATTTCGCTGCGTTCTTCATCGATGCCAGAACCAAGAGATCCGTTGTTGAAAGTTTTGATTCATTTTGAATTTTTGCTCAGAGCTGTAAGAAATACGTCCGCGAGGGGACTACAGAAAGAGTTTGGTTGGTTCCTCCGGCGGGCGCCTGGTTCCGGGGCTGCGACGCACCCGGGGCGTGACCCCGCCGAGGCAACAGTTTGGTAACGTTCACATTGGGTTTGGGAGTTGTAAACTCGGTAATGATCCCTCCGCAGGTTCACCTACGGAG。
测序结果提交至Gene Bank并利用BLAST进行序列比对，利用序列相似性确定真菌的种属关系。
基于上述对菌株的形态学鉴定和分子学鉴定结果，将分离得到的菌株鉴定为棘孢木霉(Trichoderma asperellum)。并对该菌株进行生物保藏，保藏信息如下：
菌种名称：棘孢木霉
拉丁名：Trichoderma asperellum
保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
保藏机构简称：CGMCC
地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号
保藏日期：2018.01.22
保藏中心登记入册编号：CGMCC NO.15266。
实施例2：棘孢木霉(Trichoderma asperellum)对其他重金属耐受能力测定
将实施例1筛选分离的棘孢木霉(Trichoderma asperellum)接种在含重金属(Pb、Cd、Cu和Zn)的葡萄糖蛋白胨培养基上，逐渐提高重金属浓度，直至菌株无法正常生长，此浓度即为最小抑菌浓度，结果见表1。
表1：Pb、Cd、Cu和Zn对菌株的最小抑菌浓度
Figure BDA0001609104660000051
由表1可以看出，本发明的棘孢木霉(Trichoderma asperellum)对重金属Pd具有非常好的耐受能力，同时，对Cd、Cu、Zn等重金属也具有一定的耐受能力。
实施例3：棘孢木霉(Trichoderma asperellum)对铅离子的去除和吸附能力测定
在100ml含铅溶液，铅浓度分别为50，100，150，200，250，300，350，400，450，500mgL-1的锥形瓶中分别加入0.2g实施例1筛选分离的棘孢木霉(Trichoderma asperellum)，在150rpm min-1、30℃下恒温震荡24h，震荡完成后将溶液过滤，测定溶液中铅含量。
按如下公式计算棘孢木霉对铅离子的去除率和吸附量。
去除率(η％)＝(C0-CE)*100％/C0；
吸附量(Q)＝(C0-CE)*V/1000W；
式中：Q-微生物对铅的吸附量(mg/g)；C0-铅离子的初始浓度(mg/L)；CE-吸附达平衡时铅浓度(mg/L)；V-溶液的体积(mL)；W-菌株质量(g)。
结果分别如图1和图2所示。由图1和图2可以看出，本发明的棘孢木霉(Trichoderma asperellum)对不同浓度的铅离子均具有较好的去除和吸附能力。
实施例4：棘孢木霉(Trichoderma asperellum)在铅污染土壤中定殖量的测定
将实施例1筛选分离的棘孢木霉(Trichoderma asperellum)接种于山东某铅蓄电池厂污染区土壤中。分别于接种后7天、14天和21天取样检测棘孢木霉的定殖量，定殖量的检测方法参照CN103667517A的方法进行。
同时，以市售的棘孢木霉(
Figure BDA0001609104660000052
40993)作为对照，棘孢木霉在土壤中定殖量的检测结果见表2。
表2：棘孢木霉定殖量检测结果
Figure BDA0001609104660000053
Figure BDA0001609104660000061
实施例5：
将采自山东某铅蓄电池厂污染区土壤(铅含量为132.4mg/kg)，采用高温灭菌的方式(121℃，20min)将其灭菌。
实验组：将实施例1筛选分离的棘孢木霉(Trichoderma asperellum)接种于锯木屑中培养14d构成修复基质。将修复基质以10％的比例与灭菌土壤进行混合。
对照组：不加入任何物质。
分别以0.5kg/盆的装盆量将两组土壤装入花盆中，播种黑麦草种子，每组设置三个平行，放入18-20℃的温室中培养，在培养过程中定期浇水，并利用0.5％-0.6％的尿素水进行追肥，培养28d后终止培养。
分别将实验组和对照组的黑麦草采集洗净测定生物量与总蛋白含量。
结果如图3、图4所示。由图3、图4可以看出，添加本发明的棘孢木霉(Trichodermaasperellum)修复基质后，能够有效降低铅污染土壤对所种植植物的胁迫作用，增加植物体总蛋白含量，并显著提高了所种植植物的生物量。
以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。
序列表
<110> 山东农业大学
<120> 一株棘孢木霉及其在铅污染土壤修复中的应用
<130> 2018
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 565
<212> DNA
<213> 棘孢木霉(Trichoderma asperellum)
<400> 1
tcctacctga tccgaggtca catttcagaa agttgggtgt tttacggacg tggacgcgcc 60
gcgctcccgg tgcgagttgt gcaaactact gcgcaggaga ggctgcggcg agaccgccac 120
tgtatttcgg ggccggcacc cgtgtgaggg gtcccgatcc ccaacgccga tcccccggag 180
gggttcgagg gttgaaatga cgctcggaca ggcatgcccg ccagaatact ggcgggcgca 240
atgtgcgttc aaagattcga tgattcactg aattctgcaa ttcacattac ttatcgcatt 300
tcgctgcgtt cttcatcgat gccagaacca agagatccgt tgttgaaagt tttgattcat 360
tttgaatttt tgctcagagc tgtaagaaat acgtccgcga ggggactaca gaaagagttt 420
ggttggttcc tccggcgggc gcctggttcc ggggctgcga cgcacccggg gcgtgacccc 480
gccgaggcaa cagtttggta acgttcacat tgggtttggg agttgtaaac tcggtaatga 540
tccctccgca ggttcaccta cggag 565

Claims (1)

1.一种铅污染土壤修复的方法，其特征在于，步骤为：将棘孢木霉（Trichoderma asperellum）的发酵液或孢子悬液喷施于铅污染的土壤中；或者将棘孢木霉（Trichoderma asperellum）接种到锯木屑中培养，调节pH至7.0，在30℃培养7-14天，然后将接种有棘孢木霉的锯木屑施入铅污染的土壤中；
所述的棘孢木霉（Trichoderma asperellum），其生物保藏号为：CGMCC NO.15266。
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