CN102604869A - 防治西瓜细菌性果斑病生防菌株1jn2及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于农作物防病治病技术领域,公开了防治西瓜细菌性果斑病生防菌株1JN2及其应用。生防菌株1JN2,分类命名为Bacillus axarquiensis,2012年1月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏号为CGMCC N0.5731。将该菌在LB培养液中28℃180rpm振荡培养12-16h,然后6000rpm离心10min,用灭菌水进行稀释制成菌剂,菌剂成品中活菌总浓度为1×109-1×1010CFU/mL。温室大棚试验结果显示,含1JN2的生防菌剂对西瓜的促生作用效果显著,生物量增加达到55.92%,并且该生防菌剂对西瓜果斑病病害防效显著,高达50.13%。

Description

防治西瓜细菌性果斑病生防菌株1JN2及其应用
技术领域
本发明属于农业生物技术领域,涉及防治西瓜细菌性果斑病生防菌株1JN2及其应用。
背景技术
西瓜细菌性果斑病(Bacterial fruit blotch of watermelon,BFB)是西瓜上的一种危险性检疫病害,又称细菌性斑点病,该病最早于1969年由Crall和Schenck在美国佛罗里达州发现,当时只是对果斑病症状进行了描述,未做病原菌的鉴定;目前为止,在我国许多省市,像新疆,陕西,河北,山西,吉林,福建,甘肃等地都已有果斑病的报道。该病害主要危害果实,引起西瓜果实腐烂等,可造成毁灭性损失,一旦发病用药防治基本没有效果。而且带菌种子将成为下一年重要的初侵染源。该病的发生严重影响了西瓜的产量和品质,成为西瓜生产上亟待解决的难题之一。
该病害是由燕麦嗜酸菌西瓜亚种(Acidovorax avenae subsp.citrulli,Aac)引起的,西瓜果斑目前在瓜类作物中无免疫品种。西瓜细菌性果斑病是一种毁灭性的细菌性病害,大田生长期不易被发现,且发病突然、发展迅速,由于目前还没有发现种子处理的更好方法,目前生产中所采用的化学药剂有农用链霉素,可杀得,新植霉素,细菌杀,叶双青,加瑞农,琥胶肥酸铜等,虽然化学药剂对该病有一定的防治效果,但是防治效果不高,而且大量使用化学杀菌剂往往会造成环境污染、农药残留,以及引起病原菌抗药性等问题。生物防治是一种安全有效的防治手段,符合农业持续发展的方向。
发明内容
本发明的目的针对西瓜产业潜在危害较大的西瓜细菌性果斑病,提供开发一种防治西瓜细菌性果斑病的单一生防菌菌株及其应用。
本发明的目的可通过如下技术方案实现:
一种防治西瓜细菌性果斑病病害的生防菌株1JN2,分类命名为Bacillus axarquiensis,2012年1月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号,中国科学院微生物研究所,菌种保藏号为CGMCC NO.5731。
用所述的保藏号为CGMCC NO.5731的生防菌株1JN2制备的生防菌剂。
所述的保藏号为CGMCC NO.5731的生防菌株1JN2在防治西瓜细菌性果斑病中的应用。
所述保藏号为CGMCC NO.5731的生防菌株1JN2用于制备生防菌剂的方法:将所述的保藏号为CGMCC NO.5731的防治西瓜细菌性果斑病的生防菌株1JN2在LB培养液中28℃180rpm振荡培养12-16h,然后6000rpm离心10min,用灭菌水进行稀释制成菌剂,菌剂成品中活菌总浓度为1×109-1×1010CFU/mL。
所述的保藏号为CGMCC NO.5731的生防菌株1JN2制备的生防菌剂在防治西瓜细菌性果斑病中的应用。该菌剂可以兑水喷雾使用,或做成堆肥使用,也可稀释后在移栽时灌根。
有益效果
本发明的优点和积极效果表现在:本发明是专门针对西瓜细菌性果斑病病害开发的生防制剂。由于是生物制剂,完全没有因化学农药的使用所带来的一系列问题,因而有利于西瓜的无公害生产,农民可以不用或减少其他化学农药的用量,这不仅可为农民节省开支,而且有利于西瓜的出口贸易。
温室大棚试验结果显示,含1JN2(CGMCC NO.5731)的生防菌剂对西瓜的促生作用效果显著,生物量增加达到55.92%(表1),并且该生防菌剂对西瓜果斑病病害防效显著,高达50.13%(表2)。
生物样品保藏信息
生防菌株1JN2,分类命名为Bacillus axarquiensis,于2012年1月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,地址:北京市朝阳区北辰西路1号院中科院微生物研究所,菌种保藏号为CGMCC NO.5731。
具体实施方式
实施例1
一种防治西瓜细菌性果斑病病害的生防菌株1JN2,为Bacillus axarquiensis,由山东省莱芜市生姜茎内分离得到。其具体分离、筛选、鉴定方法如下:
1生防菌株1JN2的分离
剪掉生姜茎部3g,用1%的次氯酸钠1mL浸5min,70%酒精浸2min,无菌水清洗3次。(取最后一次清洗的溶液0.1mL涂R2A,或取0.1mL最后一次清洗液加入R2A培养液,30℃振荡培养,若48h后无菌生长则认为表面消毒干净)。用灭菌的研砵研碎表面消毒好的茎,加3mL无菌水,无菌棉布过滤,用无菌水稀释10倍,取0.1mL涂LB平板,每个点重复3次,28℃培养48h,计数,挑取平板上所有的菌落分离纯化,-70℃、40%甘油保存备用。
2生防菌株1JN2的筛选
将西瓜细菌性果斑病病原菌燕麦嗜酸菌西瓜亚种(Acidovoraxavenae)FC440(JianjunFeng,Erin L.Schuenzel,Jianqiang Li,and Norman W.Schaad.2009.Multilocus SequenceTyping Reveals Two Evolutionary Lineages of Acidovorax avenae subsp.Citrulli.Bacteriology.99(8):913-920)在LB培养液(氯化钠10g/L,胰蛋白胨10g/L,酵母浸粉5g/L,调节pH值为7.2)中培养16-24h至CFU为108/ml),加入熔化冷却至40℃左右的固体培养基中,体积比1∶200,将培养基每20mL倒入9cm直径的平板中。待冷却凝固后,牙签接种生防菌1JN2。置于28℃恒温培养箱培养,24h后记录抑菌圈环径,挑取抑菌圈最大的命名为1JN2,于2012年1月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,地址:北京市朝阳区北辰西路1号院中科院微生物研究所,菌种保藏号为CGMCC NO.5731。
3生防菌株1JN2的鉴定
3.1生防菌株1JN2的形态特征
菌落扁平、灰白色,边缘波纹状,较粘稠,菌体直杆状,大小为2.0×0.5μm,单生、对生或成短链状、丝状,周生多根鞭毛,内生孢子为椭圆形,在末端未膨大的孢子囊中,好气性,革兰氏反应阳性。
3.2生防菌株1JN2的生理生化特征
将生防菌1JN2活化在LB平板上(氯化钠10g/L,胰蛋白胨10g/L,酵母浸粉5g/L,调节pH值为7.2),28℃培养24h,用牙签挑取单菌落分别接种到蛋白酶,几丁质酶,纤维素酶,以及嗜铁素酶活测定的平板上,置于28℃恒温培养箱培养,培养2-3d,测量透明圈直径的大小。
表1.Bacillus axarquiensis 1JN2的生理生化特征
Figure BDA0000146205430000031
3.3生防菌株1JN2的分子学鉴定
细菌基因组试剂盒(赛百盛公司)提取细菌基因DNA后,用gyrB通用引物gyrB1(SEQ IDNO.1);gyrB2R(SEQ ID NO.2)从基因组DNA中扩增出gyrB基因片段。具体扩增体系及程序(25ul)如下:引物gyrB1、gyrB2R(10μM)各1μl;Mix:12.5μl;Taq:0.5μl。ddH2O:10μl;模板:1μl。94℃预变性5min,94℃变性1min,56℃退火2min,72℃延伸2min,35个循环,72℃延伸10min,4℃保存。PCR扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳进行检测,90V,30min;EB染色30min,检测扩增产物。扩增产物纯化后连接到pMD19-T载体,转化于Escherichia coliDH5α,提取阳性克隆质粒,委托TaKaRa公司测序,提交NCBI(National Center for Biotechnology Information)进行比对。与登录号为DQ903178.1的Bacillus axarquiensis strain LMG 22476DNA gyrase subunit B(gyrB)基因比对,相似度为99%,因此鉴定1JN2为Bacillus axarquiensis。
实施例2蜡质芽孢杆菌1JN2生防菌剂的制备
将上述防治西瓜细菌性果斑病的生防菌株1JN2(CGMCC NO.5731)在LB培养液28℃180rpm振荡培养12-16h,然后6000rpm离心10min,用灭菌水进行稀释制成菌剂,菌剂成品中活菌总浓度为1×109-1×1010CFU/mL,以下称该生防菌剂为蜡质芽孢杆菌1JN2生防菌剂。
实施例3蜡质芽孢杆菌1JN2温室促生试验
将催芽后的西瓜种子播种于装有无菌土壤中盆砵中,每盆一粒,16/8h光周期。待西瓜长到6叶期时,将悬浮好的蜡质芽孢杆菌1JN2生防菌剂(实施例2制备,下同)以108CFU/ml的浓度用手动式喷器将该菌成雾状喷施于叶片的表面,使叶片湿润而菌剂又恰好不流下来。置于温室中培养,28℃,70%相对湿度以上,生防菌接种30天后,分别取处理组和对照组植株,小心剔除根部土壤,清洗干净后,自然风干,分别统计地上部长,地下部长,植株鲜重。60℃,烘干72h后测量植株干重。
生物量增加(%)=(处理组植株干重-对照植株干重)/对照植株干重×100%
表2.Bacillus axarquiensis 1JN2对西瓜苗期的促生作用
Figure BDA0000146205430000041
温室促生试验结果显示,芽孢杆菌1JN2能够显著促进西瓜的生长,表现在西瓜的鲜根重,鲜茎重,干根重,干茎重,根长,茎长,与对照相比,都有显著的增加,结果计算得蜡质芽孢杆菌1JN2对西瓜的生物量增加能达55.92%。
实施例4蜡质芽孢杆菌1JN2温室大棚防效试验
将催芽后的西瓜种子播种于装有无菌土壤中盆砵中,每盆一粒,播种前保持土壤较为干燥。待西瓜长到6叶期时,将悬浮好的蜡质芽孢杆菌1JN2生防菌剂以108CFU/ml的浓度用手动式喷器将该菌成雾状喷施于叶片的表面,使叶片湿润而菌液又恰好不流下来,随后置于温室中培养,28℃,70%相对湿度以上,16/8h光周期。待接种生防菌5天后,进行病原菌的接种,接种浓度为107CFU/ml,同样用手动式喷器将该菌成雾状喷施于叶片的表面,使叶片湿润而菌液又恰好不流下来,接种前所有植株均未发病,接种病原菌3天后,开始发病并统计其发病率,并计算防效。
西瓜细菌性果斑病叶片分级标准:(Ofir Bahar(2009))
发病率统计(病情统计):分为0、1、2、3、4、5、6七个等级
0级:不发病;
1级:病叶上有零星病斑,病斑占叶面积的10%以下;
2极:病叶上有少量病斑,病斑占叶面积的11%~25%;
3级:病叶上病斑数量中等,病斑占叶面积的26%~50%;
4级:病叶上病斑数量较多,病斑占叶面积的51%~75%;
5级:病叶上有许多病斑,病斑占叶面积的76%~90%;
6级:病叶上有大量病斑,病斑占叶面积90%以上;
病害严重度%=[∑(病级株数×代表级数)/植株总数×最高代表级值]×100%;
防效%=(对照发病率-处理防病率)/对照发病率×100%;
表3.Bacillus axarquiensis 1JN2对西瓜细菌性果斑病的防效
试验结果显示,蜡质芽孢杆菌1JN2能够显著降低西瓜细菌性果斑病的发病率,其平均防效达50.13%。
Figure IDA0000146205520000011
Figure IDA0000146205520000021

Claims (5)

1.一种防治西瓜细菌性果斑病的生防菌株1JN2,分类命名为Bacillus axarquiensis,于2012年1月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,菌种保藏号为CGMCCNO.5731。
2.用权利要求1所述的保藏号为CGMCC NO.5731生防菌株1JN2制备的生防菌剂。
3.权利要求1所述的保藏号为CGMCC NO.5731生防菌株1JN2在防治西瓜细菌性果斑病中的应用。
4.权利要求1所述生防菌株1JN2用于制备生防菌剂的方法,其特征在于将权利要求1所述防治西瓜细菌性果斑病的生防菌株1JN2在LB培养液中28℃180rpm振荡培养12-16h,然后6000rpm离心10min,用灭菌水进行稀释制成菌剂,菌剂成品中活菌总浓度为1×109-1×1010CFU/mL。
5.权利要求2所述生防菌剂在防治西瓜细菌性果斑病中的应用。
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