CN102604869A - 防治西瓜细菌性果斑病生防菌株1jn2及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于农作物防病治病技术领域，公开了防治西瓜细菌性果斑病生防菌株1JN2及其应用。生防菌株1JN2，分类命名为Bacillus axarquiensis，2012年1月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC N0.5731。将该菌在LB培养液中28℃180rpm振荡培养12-16h，然后6000rpm离心10min，用灭菌水进行稀释制成菌剂，菌剂成品中活菌总浓度为1×109-1×1010CFU/mL。温室大棚试验结果显示，含1JN2的生防菌剂对西瓜的促生作用效果显著，生物量增加达到55.92％，并且该生防菌剂对西瓜果斑病病害防效显著，高达50.13％。
Description
技术领域
本发明属于农业生物技术领域，涉及防治西瓜细菌性果斑病生防菌株1JN2及其应用。
背景技术
西瓜细菌性果斑病(Bacterial fruit blotch of watermelon，BFB)是西瓜上的一种危险性检疫病害，又称细菌性斑点病，该病最早于1969年由Crall和Schenck在美国佛罗里达州发现，当时只是对果斑病症状进行了描述，未做病原菌的鉴定；目前为止，在我国许多省市，像新疆，陕西，河北，山西，吉林，福建，甘肃等地都已有果斑病的报道。该病害主要危害果实，引起西瓜果实腐烂等，可造成毁灭性损失，一旦发病用药防治基本没有效果。而且带菌种子将成为下一年重要的初侵染源。该病的发生严重影响了西瓜的产量和品质，成为西瓜生产上亟待解决的难题之一。
该病害是由燕麦嗜酸菌西瓜亚种(Acidovorax avenae subsp.citrulli，Aac)引起的，西瓜果斑目前在瓜类作物中无免疫品种。西瓜细菌性果斑病是一种毁灭性的细菌性病害，大田生长期不易被发现，且发病突然、发展迅速，由于目前还没有发现种子处理的更好方法，目前生产中所采用的化学药剂有农用链霉素，可杀得，新植霉素，细菌杀，叶双青，加瑞农，琥胶肥酸铜等，虽然化学药剂对该病有一定的防治效果，但是防治效果不高，而且大量使用化学杀菌剂往往会造成环境污染、农药残留，以及引起病原菌抗药性等问题。生物防治是一种安全有效的防治手段，符合农业持续发展的方向。
发明内容
本发明的目的针对西瓜产业潜在危害较大的西瓜细菌性果斑病，提供开发一种防治西瓜细菌性果斑病的单一生防菌菌株及其应用。
本发明的目的可通过如下技术方案实现：
一种防治西瓜细菌性果斑病病害的生防菌株1JN2，分类命名为Bacillus axarquiensis，2012年1月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，菌种保藏号为CGMCC NO.5731。
用所述的保藏号为CGMCC NO.5731的生防菌株1JN2制备的生防菌剂。
所述的保藏号为CGMCC NO.5731的生防菌株1JN2在防治西瓜细菌性果斑病中的应用。
所述保藏号为CGMCC NO.5731的生防菌株1JN2用于制备生防菌剂的方法：将所述的保藏号为CGMCC NO.5731的防治西瓜细菌性果斑病的生防菌株1JN2在LB培养液中28℃180rpm振荡培养12-16h，然后6000rpm离心10min，用灭菌水进行稀释制成菌剂，菌剂成品中活菌总浓度为1×109-1×1010CFU/mL。
所述的保藏号为CGMCC NO.5731的生防菌株1JN2制备的生防菌剂在防治西瓜细菌性果斑病中的应用。该菌剂可以兑水喷雾使用，或做成堆肥使用，也可稀释后在移栽时灌根。
有益效果
本发明的优点和积极效果表现在：本发明是专门针对西瓜细菌性果斑病病害开发的生防制剂。由于是生物制剂，完全没有因化学农药的使用所带来的一系列问题，因而有利于西瓜的无公害生产，农民可以不用或减少其他化学农药的用量，这不仅可为农民节省开支，而且有利于西瓜的出口贸易。
温室大棚试验结果显示，含1JN2(CGMCC NO.5731)的生防菌剂对西瓜的促生作用效果显著，生物量增加达到55.92％(表1)，并且该生防菌剂对西瓜果斑病病害防效显著，高达50.13％(表2)。
生物样品保藏信息
生防菌株1JN2，分类命名为Bacillus axarquiensis，于2012年1月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院中科院微生物研究所，菌种保藏号为CGMCC NO.5731。
具体实施方式
实施例1
一种防治西瓜细菌性果斑病病害的生防菌株1JN2，为Bacillus axarquiensis，由山东省莱芜市生姜茎内分离得到。其具体分离、筛选、鉴定方法如下：
1生防菌株1JN2的分离
剪掉生姜茎部3g，用1％的次氯酸钠1mL浸5min，70％酒精浸2min，无菌水清洗3次。(取最后一次清洗的溶液0.1mL涂R2A，或取0.1mL最后一次清洗液加入R2A培养液，30℃振荡培养，若48h后无菌生长则认为表面消毒干净)。用灭菌的研砵研碎表面消毒好的茎，加3mL无菌水，无菌棉布过滤，用无菌水稀释10倍，取0.1mL涂LB平板，每个点重复3次，28℃培养48h，计数，挑取平板上所有的菌落分离纯化，-70℃、40％甘油保存备用。
2生防菌株1JN2的筛选
将西瓜细菌性果斑病病原菌燕麦嗜酸菌西瓜亚种(Acidovoraxavenae)FC440(JianjunFeng，Erin L.Schuenzel，Jianqiang Li，and Norman W.Schaad.2009.Multilocus SequenceTyping Reveals Two Evolutionary Lineages of Acidovorax avenae subsp.Citrulli.Bacteriology.99(8)：913-920)在LB培养液(氯化钠10g/L，胰蛋白胨10g/L，酵母浸粉5g/L，调节pH值为7.2)中培养16-24h至CFU为108/ml)，加入熔化冷却至40℃左右的固体培养基中，体积比1∶200，将培养基每20mL倒入9cm直径的平板中。待冷却凝固后，牙签接种生防菌1JN2。置于28℃恒温培养箱培养，24h后记录抑菌圈环径，挑取抑菌圈最大的命名为1JN2，于2012年1月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院中科院微生物研究所，菌种保藏号为CGMCC NO.5731。
3生防菌株1JN2的鉴定
3.1生防菌株1JN2的形态特征
菌落扁平、灰白色，边缘波纹状，较粘稠，菌体直杆状，大小为2.0×0.5μm，单生、对生或成短链状、丝状，周生多根鞭毛，内生孢子为椭圆形，在末端未膨大的孢子囊中，好气性，革兰氏反应阳性。
3.2生防菌株1JN2的生理生化特征
将生防菌1JN2活化在LB平板上(氯化钠10g/L，胰蛋白胨10g/L，酵母浸粉5g/L，调节pH值为7.2)，28℃培养24h，用牙签挑取单菌落分别接种到蛋白酶，几丁质酶，纤维素酶，以及嗜铁素酶活测定的平板上，置于28℃恒温培养箱培养，培养2-3d，测量透明圈直径的大小。
表1.Bacillus axarquiensis 1JN2的生理生化特征
3.3生防菌株1JN2的分子学鉴定
细菌基因组试剂盒(赛百盛公司)提取细菌基因DNA后，用gyrB通用引物gyrB1(SEQ IDNO.1)；gyrB2R(SEQ ID NO.2)从基因组DNA中扩增出gyrB基因片段。具体扩增体系及程序(25ul)如下：引物gyrB1、gyrB2R(10μM)各1μl；Mix：12.5μl；Taq：0.5μl。ddH2O：10μl；模板：1μl。94℃预变性5min，94℃变性1min，56℃退火2min，72℃延伸2min，35个循环，72℃延伸10min，4℃保存。PCR扩增产物用1％琼脂糖凝胶电泳进行检测，90V，30min；EB染色30min，检测扩增产物。扩增产物纯化后连接到pMD19-T载体，转化于Escherichia coliDH5α，提取阳性克隆质粒，委托TaKaRa公司测序，提交NCBI(National Center for Biotechnology Information)进行比对。与登录号为DQ903178.1的Bacillus axarquiensis strain LMG 22476DNA gyrase subunit B(gyrB)基因比对，相似度为99％，因此鉴定1JN2为Bacillus axarquiensis。
实施例2蜡质芽孢杆菌1JN2生防菌剂的制备
将上述防治西瓜细菌性果斑病的生防菌株1JN2(CGMCC NO.5731)在LB培养液28℃180rpm振荡培养12-16h，然后6000rpm离心10min，用灭菌水进行稀释制成菌剂，菌剂成品中活菌总浓度为1×109-1×1010CFU/mL，以下称该生防菌剂为蜡质芽孢杆菌1JN2生防菌剂。
实施例3蜡质芽孢杆菌1JN2温室促生试验
将催芽后的西瓜种子播种于装有无菌土壤中盆砵中，每盆一粒，16/8h光周期。待西瓜长到6叶期时，将悬浮好的蜡质芽孢杆菌1JN2生防菌剂(实施例2制备，下同)以108CFU/ml的浓度用手动式喷器将该菌成雾状喷施于叶片的表面，使叶片湿润而菌剂又恰好不流下来。置于温室中培养，28℃，70％相对湿度以上，生防菌接种30天后，分别取处理组和对照组植株，小心剔除根部土壤，清洗干净后，自然风干，分别统计地上部长，地下部长，植株鲜重。60℃，烘干72h后测量植株干重。
生物量增加(％)＝(处理组植株干重-对照植株干重)/对照植株干重×100％
表2.Bacillus axarquiensis 1JN2对西瓜苗期的促生作用
温室促生试验结果显示，芽孢杆菌1JN2能够显著促进西瓜的生长，表现在西瓜的鲜根重，鲜茎重，干根重，干茎重，根长，茎长，与对照相比，都有显著的增加，结果计算得蜡质芽孢杆菌1JN2对西瓜的生物量增加能达55.92％。
实施例4蜡质芽孢杆菌1JN2温室大棚防效试验
将催芽后的西瓜种子播种于装有无菌土壤中盆砵中，每盆一粒，播种前保持土壤较为干燥。待西瓜长到6叶期时，将悬浮好的蜡质芽孢杆菌1JN2生防菌剂以108CFU/ml的浓度用手动式喷器将该菌成雾状喷施于叶片的表面，使叶片湿润而菌液又恰好不流下来，随后置于温室中培养，28℃，70％相对湿度以上，16/8h光周期。待接种生防菌5天后，进行病原菌的接种，接种浓度为107CFU/ml，同样用手动式喷器将该菌成雾状喷施于叶片的表面，使叶片湿润而菌液又恰好不流下来，接种前所有植株均未发病，接种病原菌3天后，开始发病并统计其发病率，并计算防效。
西瓜细菌性果斑病叶片分级标准：(Ofir Bahar(2009))
发病率统计(病情统计)：分为0、1、2、3、4、5、6七个等级
0级：不发病；
1级：病叶上有零星病斑，病斑占叶面积的10％以下；
2极：病叶上有少量病斑，病斑占叶面积的11％～25％；
3级：病叶上病斑数量中等，病斑占叶面积的26％～50％；
4级：病叶上病斑数量较多，病斑占叶面积的51％～75％；
5级：病叶上有许多病斑，病斑占叶面积的76％～90％；
6级：病叶上有大量病斑，病斑占叶面积90％以上；
病害严重度％＝[∑(病级株数×代表级数)/植株总数×最高代表级值]×100％；
防效％＝(对照发病率-处理防病率)/对照发病率×100％；
表3.Bacillus axarquiensis 1JN2对西瓜细菌性果斑病的防效
试验结果显示，蜡质芽孢杆菌1JN2能够显著降低西瓜细菌性果斑病的发病率，其平均防效达50.13％。
Claims (5)
1.一种防治西瓜细菌性果斑病的生防菌株1JN2，分类命名为Bacillus axarquiensis，于2012年1月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为CGMCCNO.5731。
2.用权利要求1所述的保藏号为CGMCC NO.5731生防菌株1JN2制备的生防菌剂。
3.权利要求1所述的保藏号为CGMCC NO.5731生防菌株1JN2在防治西瓜细菌性果斑病中的应用。
4.权利要求1所述生防菌株1JN2用于制备生防菌剂的方法，其特征在于将权利要求1所述防治西瓜细菌性果斑病的生防菌株1JN2在LB培养液中28℃180rpm振荡培养12-16h，然后6000rpm离心10min，用灭菌水进行稀释制成菌剂，菌剂成品中活菌总浓度为1×109-1×1010CFU/mL。
5.权利要求2所述生防菌剂在防治西瓜细菌性果斑病中的应用。
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