CN104255806A - 一种棉花黄萎病防治菌剂及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种棉花黄萎病防治菌剂及其方法。本发明采用单因子试验筛选最佳表面活性剂、紫外防护剂、防腐剂和pH，并通过Box-Behnken设计和响应面法对其最佳配比进行优化。棉花黄萎病拮抗菌B.axarquiensis液体菌剂中的最佳表面活性剂为吐温-20，防腐剂为尼泊金甲酯，紫外防护剂为山梨醇，调液体菌剂pH为7.8。拮抗菌B.axarquiensis液体菌剂中各种助剂最佳配比为山梨醇0.375％、防腐剂尼泊金甲酯为0.1％、表面活性剂吐温-20为1％且pH为7.8。在此条件下，拮抗菌B.axarquiensis液体菌剂中的活菌数最高为6.4×109cfu/mL。为开发棉花黄萎病拮抗菌B.axarquiensis液体菌剂的商品性、简单性和有效性以及大规模生产奠定基础。
Description
技术领域
本发明涉及一种棉花黄萎病防治菌剂及其制备方法，属于农业技术领域。
背景技术
棉花黄萎病是由大丽轮枝菌(Verticillium dahliae Kleb)引起的一种真菌性病害，也是棉花主要病害之一，其直接影响棉花质量，减少棉花产量，降低棉花经济效益，被称为棉花的“癌症”。本世纪90年代以来,棉花黄萎病逐年加重,并造成巨大的经济损失。据不完全统计，每年损失皮棉8万～10万吨。目前，棉农常用化学农药来防治棉花黄萎病，但是化学农药不但影响人类健康还破坏生态环境，长期使用后还加强植物病原菌的耐药性。近些年来，随着绿色农业、有机农业的兴起，利用生物防治棉花黄萎病备受人们关注。许多学者研究发现细菌、真菌、放线菌都能很好的防治棉花黄萎病。生防细菌中芽孢杆菌是生防细菌中研究最多的属。因为芽孢杆菌能产生热稳定的内生芽孢，繁殖速度快、抗逆能力强、易定殖在植物表面，营养要求简单、并且对多种病原真菌、细菌均有较强的抑制作用，具有广谱抗菌性，成为越来越受瞩目的生防研究材料之一。
微生物生防菌剂，由于其有效成分是生物活体及其代谢物，为保证其在储存过程中的稳定性，在田间条件下充分发挥作用，研制合理的剂型是非常必要的。从成本角度考虑，利用全发酵液开发液体剂型为首选。
阿萨尔基亚芽孢杆菌(Bacillus axarquiensis)是芽孢杆菌的一个种，具有繁殖快、抗逆性强等特点，具有作为优势生防细菌的潜力。据文献调研，目前对B.axarquiensis研究局限于其分类学方面，而对其生物活性方面未见相关报道。发明人研究发现其对棉花黄萎病具有防治作用，活性成分为B.axarquiensis次生代谢产物，如用全发酵液为原料研制剂型，不仅可降低成本，而且提高液体菌剂中活菌数量，为进一步开发生物活性奠定基础。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于提供一种棉花黄萎病防治菌剂制备方法及其应用。
本发明开发棉花黄萎病防治菌剂利用的原料为棉花黄萎病拮抗菌B.axarquiensis全发酵液，发酵液中出含有大量的拮抗菌外，还含有菌体分泌的蛋白(肽)类物质，残留的碳源、氮源等营养物质。在助剂选择时应考虑添加下列助剂：(1)防腐剂，用来保护发酵液，延长液体制剂贮藏期；(2)表面活性剂，在液体剂型中作为粘着剂，有利于液体剂型的均匀、稀释；(3)紫外防护剂，可保护液体剂型中的活菌数，降低紫外线对其产生的杀伤作用。(4)pH值，实验测出适于菌剂贮藏和发挥药效的pH值。
在本发明中，通过单因素实验、Box-Behnken设计和响应面法对其各种助剂进行筛选，并对其配比进行优化。本发明提供的棉花黄萎病防治菌剂，以棉花黄萎病拮抗菌B.axarquiensis全发酵液为原料研制剂型，不仅可降低成本，降低成本，而且提高液体菌剂中活菌数量。
本发明提供的棉花黄萎病防治菌剂，主要成分为B.axarquiensis全发酵液，还含有吐温-20、山梨醇、尼泊金甲酯、pH调节剂。
作为一种优选，本发明提供的棉花黄萎病防治菌剂，吐温-20的体积浓度为1％。
山梨醇的体积浓度为0.375％。
尼泊金甲酯的体积浓度为0.1％。
本发明的棉花黄萎病防治菌剂，pH为7.8。
上述棉花黄萎病防治菌剂的制备方法是：
1)将在平板上NA培养基上生长良好的拮抗菌B.axarquiensis单菌落接种到500mL培养液的三角瓶中(200mL)，于37℃、180r/min，振荡培养24h后，再按照5％的比例接种到20mL NB培养液的三角瓶中(100mL)，于37℃、180r/min，振荡培养24h后制成种子液，此过程得到B.axarquiensis种子液。
2)将种子液接种于NB培养液中继续扩大培养，培养48h后得B.axarquiensis全发酵液，向其全发酵液中添加1％吐温-20表面活性剂、0.375％山梨醇紫外防护剂、0.1％尼泊金甲酯防腐剂以及调整液体菌剂的pH为7.8，此过程得到B.axarquiensis液体菌剂。
3)采用平板菌落计数法检测B.axarquiensis液体菌剂中活菌数量。
小拮抗菌B.axarquiensis发酵液组和液体菌剂组对棉花黄萎病有一定生防效果，其中发酵液组相对生防值为38.04％～43.07％，而液体菌剂组相对防效值为40.29～46.23％。接种后130d，拮抗菌B.axarquiensis发酵液组对棉花黄萎病相对防效最大为43.07％，而液体菌剂组对棉花黄萎病相对防效最大为46.23％。拮抗菌B.axarquiensis液体菌剂组对棉花黄萎病相对防效优于B.axarquiensis发酵液组。
总之，本发明B.axarquiensis液体菌剂对棉花黄萎病菌有防治作用，且防治效果优于B.axarquiensis发酵液组。
附图说明
图1为表面活性剂和紫外防护剂交互影响活菌数的等高线图(1-1)和响应曲面图(1-2)。
图2为表面活性剂和防腐剂交互影响活菌数的等高线图(2-1)和响应曲面图(2-2)。
图3为表面活性剂和pH值交互影响活菌数的等高线图(3-1)和响应曲面图(3-2)。
图4为紫外防护剂和防腐剂交互影响活菌数的等高线图(4-1)及响应曲面图(4-2)。
图5为紫外防护剂和pH值交互影响活菌数的等高线图(5-1)及响应曲面图(5-2)。
图6为防腐剂与pH值交互影响活菌数的等高线图(6-1)及响应曲面图(6-2)。
具体实施方式
实施例1：拮抗菌B.axarquiensis种子悬液制备
将在平板上NA培养基上生长良好的拮抗菌B.axarquiensis单菌落接种到500mL培养液的三角瓶中(200mL)，于37℃、180r/min，振荡培养24h后，再按照5％的比例接种到20mL NB培养液的三角瓶中(l00mL)，于37℃、180r/min，振荡培养24h后制成种子液。
实施例2：菌剂活菌数的检测方法
平板菌落计数法：用标准方法将待测样品稀释，然后取适宜的稀释度样品与固体培养基混匀，凝固后培养，每一个活细胞就形成一个单菌落，然后计数平板上出现的菌落数乘以样品稀释度，即可计算出样品的含菌数。注：本文中稀释倍数为10-4。
实施例3：剂型分散性检测方法
将100mL待检样本一次性注入加有900mL标准硬水的烧杯中，均匀搅拌1min静置30min，用尺子量出没有悬浮或溶解的样品占总体积的百分比。用100％减去未悬浮或溶解的样品百分比则得出该样品分散性。
实施例4：表面活性剂筛选
按表1进行表面活性剂的筛选。以分散性好，活菌数多为筛选标准。
表1 剂型表面活性剂的筛选
注：试管是5mL的离心管，按要求配置好后取10μL接种到NA培养基，24h后计算菌落，下面活菌数的单位为4×102个。
由表1可知，添加无菌水的制剂的分散性为90％，而加入的两种表面活性剂任何一种制剂的分散性都是100％，即吐温-20和吐温-80对液体菌剂的分散性一样，都可以使菌体均匀分布在种子液中；但是吐温-80和吐温-20对活菌数的影响很不一样，添加吐温-80的种子液跟放无菌水的种子液里的活菌数相差不大。而添加吐温-20的种子液中活菌数明显比添加吐温-80的多，故考虑用吐温-20做表面活性剂。又由吐温-20的添加量可以知道，吐温-20添加量比例1％(40μL)时种子液中活菌数最多。
实施例5：紫外防护剂筛选
将加入表面活性剂的发酵全液称为初筛剂型。
将初选剂型与两种紫外防护剂按表2复配。随后在实验室内用紫外灯管模拟紫外照射对防护剂进行筛选。在40W紫外灯下，垂直距离30cm，照射10min。以拮抗菌活菌数多为标准。
表2 剂型紫外防护剂的筛选
注：试管是5mL的离心管，按要求配置好后取10μL接种到NA培养基，24h后计算菌落，下面活菌数的单位为4×102个。
由表2可知，加木质素磺酸钠的初筛剂型中的活菌数较加山梨醇的初筛剂型中的活菌数要少很多，甚至比加无菌水的初筛剂型的活菌数都少，可能是由于木质素磺酸钠本身的紫外防护能力很小，也有可能是木质素磺酸钠对此拮抗菌有微小抑制作用，故选择山梨醇作为紫外防护剂。又由山梨醇的添加量可以知道，山梨醇添加量比例0.375％(15μL)时初筛剂型中活菌数最多。
实施例6：防腐剂筛选
将加入表面活性剂和紫外防护剂的发酵全液称为再筛剂型。
将再选剂型与尼泊金甲酯、凯松按表3复配。以拮抗菌活菌数多为标准。
表3 剂型防腐剂的筛选
注：试管是5mL的离心管，按要求配置好后取10μL接种到NA培养基，24h后计算菌落，下面活菌数的单位为4×102个。
由表3可知，加凯松的菌剂中活菌数很少，都比加无菌水的少，可能是凯松对此菌有抑制作用，而加尼泊金甲酯的菌剂活菌数在加入量小于0.1％(4μL)时，随着尼泊金甲酯的添加量而增加；当添加量大于0.1％时，活菌数随添加量的增加而减少，可能是随着尼泊金甲酯防腐剂的增加，对此菌也产生抑制作用，活菌数随着减少。
实施例7：剂型pH筛选
将加入表面活性剂，紫外防护剂，防腐剂的发酵全液称为B.axarquiensis液体菌剂。配制NA培养基，分别调它们的pH值，使其pH值分别为7、8、9、10，pH＝7时为NA培养基原始pH值，取100μL B.axarquiensis液体菌剂涂布于四个不同pH值的NA培养基中，培养B.axarquiensis，计数活菌数。按4表配制。
表4 pH值对菌剂中活菌数的影响
注：试管是5mL的离心管，按要求配置好后取10μL接种到NA培养基，24h后计算菌落，下面活菌数的单位为4×102个。
从表4中可以看出，pH值小于8时，活菌数随着pH值得增大而增加；而当pH值大于8时，活菌数随着pH值得增大而减小。这说明酸碱度为8时比较适合拮抗菌B.axarquiensis的存活。
实施例8：响应面法优化最佳助剂含量及pH
拮抗菌液体菌剂配方响应面试验：在单因素实验基础上，选取表面活性剂，紫外防护剂，防腐剂，pH值进行Box-Bohnken中心组合实验并结合实际实验条件选取合理水平，以菌剂中活菌数和分散性为响应面设计了四因素三水平的响应面分析实验，其组合设计水平取值及编码见表5。每个实验3次重复，实验数据取平均值。
表5 水平因素表
采用响应面软件对表6中的所得数据进行分析，拟合回归方程，根据方程所得最优工艺配方及菌剂的pH值。回归方程为：Y＝1620-45A-4.58B+88.33C+12.08D+45AB+180AC+50AD+100BC+151.25BD-65CD-470.63A2-431.25B2-445.63C2-756.25D2，其中A表示吐温-20、B为山梨醇、C为尼泊金甲酯，D为pH值。
表6 响应面实验设计与结果
表7 回归方程显著性结果分析见下表
**表示极显著(P<0.01)；*表示显著(P<0.05)。
由表7可以看出，A2、B2、C2、D2均为极显著，而A、B、C、D和AC、AD、AB、BC、BD、CD不显著，模型极显著，失拟项不显著，相关系数为95.74％，说明响应值的变化与所选因素的相关度达到95.74％，该回归方程和实验数据的拟合程度很高，可以用来对实验结果进行分析和预测，使用该方程模拟真实的四因素三水平的分析是可行的。二次项对响应面结果也有很大的关系，交互作用的影响相对较小。实验所选的四个因素对菌体活菌数的影响排顺序：C>A>D>B，即尼泊金甲酯>吐温-20>pH>山梨醇。
实施例9：响应面法试验因素的相互影响
图1-6是响应值对各试验因子构成的三维空间的曲面图,见图1～6，等高图直观地反映出各因素互作用对响应值的影响。圆形表示二因素交互作用不显著,椭圆表示二因素交互作用显著。
实施例10：最优工艺的配方和验证
据所得模型，利用Design Expert.8.0软件对工艺条件进行优化，在模型取值范围内选择最低点为起始点，由模型使用快速上升法进行优化，可预测在稳定状态下的液体菌剂中表面活性剂吐温-20为40μL(1％)，紫外防护剂山梨醇为15μL(0.375％)，防腐剂尼泊金甲酯为4μL(0.1％)，pH值7.8，在此条件下，活菌数的理论预测值是1600个。
菌剂的制备过程具体如下：
1)将在平板上NA培养基上生长良好的拮抗菌B.axarquiensis单菌落接种到500mL培养液的三角瓶中(200mL)，于37℃、180r/min，振荡培养24h后，再按照5％的比例接种到20mL NB培养液的三角瓶中(100mL)，于37℃、180r/min，振荡培养24h后制成种子液，此过程得到B.axarquiensis种子液。
2)将种子液接种于NB培养液中继续扩大培养，培养48h后得B.axarquiensis全发酵液，向其全发酵液中添加1％吐温-20表面活性剂、0.375％山梨醇紫外防护剂、0.1％尼泊金甲酯防腐剂以及调整液体菌剂的pH为7.8，此过程得到B.axarquiensis液体菌剂。
3)采用平板菌落计数法检测B.axarquiensis液体菌剂中活菌数量。
并按此工艺配方进行三次平行实验，得到菌剂平均活菌数1620个，实验值和回归方程预测值吻合较好，说明优化配方可靠。
实施例11：B.axarquiensis液体菌剂小区防治棉花黄萎病的应用
拮抗菌B.axarquiensis对棉花黄萎病的田间药效试验于2012和2013年4－10月，于新疆生产建设兵团农一师12团28连棉田进行，选择常年发生黄萎病较重的地块。小区面积为30m2，随机区组排列。播种时间为2012和2013年4月15-20日，棉花品种为新陆中36，土壤为沙壤土，肥力中等，灌溉条件较好。一膜4行，每行30株棉花，每个处理120株棉花重复3次，当棉苗长至5～6片真叶时，发酵液组和液体菌剂组每株棉苗灌根拮接种抗菌B.axarquiensis 50mL(菌浓度为6×108mL-1)，对照组灌根50mL蒸馏水，接种后60d、90d、110d、130d和140d统计病情指数和相对防治效果。
表8 B.axarquiensis田间试验防治棉花黄萎病效果
小区试验结果如表8可知，拮抗菌B.axarquiensis对棉花黄萎病有一定生防作用。接种后60～140d对照组棉花黄萎病病情指数为13.87～49.08，病情指数呈增长趋势，接种后140d病情指数达到最大值为49.08；B.axarquiensis发酵液处理组病情指数分别为3.85～21.28(表8)，B.axarquiensis液体菌剂处理组病情指数分别为2.23～18.13(表8)。
拮抗菌B.axarquiensis发酵液组和液体菌剂组对棉花黄萎病有一定生防效果，其中发酵液组相对生防值为38.04％～43.07％，而液体菌剂组相对防效值为40.29～46.23％。接种后130d，拮抗菌B.axarquiensis发酵液组对棉花黄萎病相对防效最大为43.07％，而液体菌剂组对棉花黄萎病相对防效最大为46.23％。拮抗菌B.axarquiensis液体菌剂组对棉花黄萎病相对防效比发酵液高，可能是由于液体菌剂组中添加各种助剂对拮抗菌B.axarquiensis有保护作用所致。
Claims (6)
1.一种棉花黄萎病防治菌剂，主要成分为阿萨尔基亚芽孢杆菌全发酵液，还含有吐温-20、山梨醇、尼泊金甲酯和pH调节剂。
2.根据权利要求1所述的棉花黄萎病防治菌剂，其特征在于，吐温-20的体积浓度为1％。
3.根据权利要求1所述的棉花黄萎病防治菌剂，其特征在于，山梨醇的体积浓度为0.375％。
4.根据权利要求1所述的棉花黄萎病防治菌剂，其特征在于，尼泊金甲酯的体积浓度为0.1％。
5.根据权利要求1所述的棉花黄萎病防治菌剂，其特征在于，菌剂pH为7.8。
6.权利要求1所述的棉花黄萎病防治菌剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)将在平板上NA培养基上生长良好的拮抗菌B.axarquiensis单菌落接种到500mL培养液的三角瓶中，于37℃、180r/min，振荡培养24h后，再按照5％的比例接种到20mL NB培养液的三角瓶中，于37℃、180r/min，振荡培养24h后制成种子液；
2)将种子液接种于NB培养液中继续扩大培养，培养48h后得B.axarquiensis全发酵液，向其全发酵液中添加1％吐温-20表面活性剂、0.375％山梨醇紫外防护剂、0.1％尼泊金甲酯防腐剂以及调整液体菌剂的pH为7.8。
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