CN110447660A - 一种微生物抑菌剂及其制备方法 - Google Patents

一种微生物抑菌剂及其制备方法 Download PDF

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张建贵
赵桂琴
侯栋
胡彦婷
杨琰珊
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    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
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Abstract

本发明公开了一种微生物抑菌剂及其制备方法，属于微生物技术领域。该微生物抑菌剂包括：混合菌液和助剂，混合菌液为蕈状芽孢杆菌(Bacillus mycoidesGnyt1)和假单胞杆菌(Pseudomonas sp.ChO19)混合后的液体，助剂包括吐温‑80、山梨醇、尼泊金甲酯。本发明通过两种菌株与助剂协同作用，使得本微生物抑菌剂不仅防病促生，而且还有较好的湿润性、防腐性、分散性和紫外保护性。

Description

一种微生物抑菌剂及其制备方法
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，特别涉及一种微生物抑菌剂及其制备方法。
背景技术
燕麦为禾本科植物，《本草纲目》中称之为雀麦、野麦子。燕麦不易脱皮，所以被称为皮燕麦，是一种低糖、高营养、高能食品。燕麦性味甘平，能益脾养心、敛汗，有较高的营养价值，可用于体虚自汗、盗汗或肺结核病人。燕麦耐寒，抗旱，对土壤的适应性很强，能自播繁衍。燕麦富含膳食纤维，能促进肠胃蠕动，利于排便，热量低，升糖指数低，降脂降糖，也是高档补品之一，在贫苦地区是不可缺少的干粮。
现有技术中，农民专注于提高燕麦的高产、增益，过度使用化学农药来防控病虫害的发生，长期以来土地有害物质日积月累，造成土壤农药残留超标、环境问题和食品安全问题。
发明内容
为了解决现有技术的问题，本发明实施例提供了一种微生物抑菌剂及其制备方法。所述技术方案如下：
一方面，提供了一种微生物抑菌剂，所述微生物抑菌剂包括：混合菌液和助剂，所述混合菌液为蕈状芽孢杆菌(Bacillus mycoidesGnyt1)和假单胞杆菌(Pseudomonassp.ChO19)混合后的液体，所述助剂包括吐温-80、山梨醇、尼泊金甲酯。
进一步地，所述微生物抑菌剂各组成成分所占的质量百分比为：混合菌液1.00％～2.00％，吐温-801.30％～1.70％，山梨醇0.40％～0.60％和尼泊金甲酯0.40％～0.60％，余量用灭菌的LB液体培养基补至100％。
进一步地，所述蕈状芽孢杆菌(Bacillus mycoidesGnyt1)，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏时间为2017年4月10日，保藏编号为CCTCC NO:M2017177；所述假单胞杆菌(Pseudomonas sp.ChO19)保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏时间为2010年9月13日，保藏编号为CCTCC NO:M2010229。
另一方面，提供了一种微生物抑菌剂的制备方法，所述方法包括：
步骤(1)、制备混合菌液：分别将所述蕈状芽孢杆菌(Bacillus mycoidesGnyt1)和所述假单胞杆菌(Pseudomonas sp.ChO19)进行培养，然后混合，得到所述混合菌液；
步骤(2)、确定助剂配比：基于所述混合菌液，采用响应面分析法确定助剂配比；
步骤(3)、制备微生物抑菌剂：将制备的所述混合菌液与所述助剂混合，然后进行培养，得到所述微生物抑菌剂。
进一步地，所述步骤(1)包括：分别将所述蕈状芽孢杆菌(BacillusmycoidesGnyt1)和所述假单胞杆菌(Pseudomonas sp.ChO19)通过划线法接种于LB固体培养基中，并放置于28℃培养箱培养3d；挑取单菌落接种于装有50mLLB液体培养基的150mL三角瓶，于180r/min、28℃的摇床培养3d；上述2株培养好的菌悬液以体积比1：1的比例按10％的接种量接种于装有50mL LB液体培养基的150mL三角瓶，于180r/min、28℃的摇床培养3d，得到所述混合菌液。
进一步地，所述步骤(2)包括：多个150mL摇瓶中均装有50mL LB液体培养基，所述LB液体培养基中均含有助剂，且不同摇瓶中的LB液体培养基中含有的助剂的浓度不同；
向所述多个装有LB液体培养基的摇瓶中的其中一个，加5mL无菌LB液体培养基作为对照组；并向剩余的多个所述装有LB液体培养基的摇瓶中加入5mL所述混合菌液作为试验组；
摇瓶密封后放置于180r/min、28℃恒温摇床培养40h，每隔4h用紫外分光光度计测定各试验组和对照组的吸光度值(OD600)，试验重复3次，确定出助剂配比为吐温-801.30％～1.70％、山梨醇0.40％～0.60％和尼泊金甲酯0.40％～0.60％。
进一步地，所述步骤(3)包括：按质量比为混合菌液1.00％～2.00％、吐温-801.30％～1.70％、山梨醇0.40％～0.60％和尼泊金甲酯0.40％～0.60％进行混合，余量用灭菌的LB液体培养基补至100％，在28℃恒温摇床培养32h，得到所述微生物抑菌剂。
本发明实施例提供的技术方案带来的有益效果是：本微生物抑菌剂中两种菌株与助剂协同作用，使得本微生物抑菌剂不仅防病促生，而且还有较好的湿润性、防腐性、分散性、紫外保护性；其次，本微生物抑菌剂还具有成本低、使用安全、经济效益高、无环境污染等优点；另外，本微生物抑菌剂在喷施的过程一些会落到植物表面、另一些会从植物表面滴落到土壤表面，这些滴落到土壤表面的微生物在适宜的环境中可以大量繁殖，会分解有机物，从而可以改变土壤的结构和土壤微生物的多样性分布。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明实施例提供的一种制备微生物抑菌剂的方法流程图；
图2是本发明实施例提供的另一种制备微生物抑菌剂的方法流程图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明实施方式作进一步地详细描述。
微生物抑菌剂是指利用微生物或其代谢产物来防治农作物的病虫害且有益于作物的农药。虽然微生物抑菌剂没有化学农药见效快，但环保绿色、无毒无害，可在作物病虫害发生初期能够防治，也符合农业作物病害防治的理念——“防重于治”。典型的微生物农药有苏云金杆菌制剂、枯草芽孢杆菌制剂、哈茨木霉制剂和多粘类芽孢杆菌制剂等。这些微生物来源于自然界，对环境友好，无农药残留，对作物病虫害可起到持续防控的作用。微生物农药由于其环境友好的特点一直广受重视，但其田间效果不稳定，未得到广泛传播和施用。究其原因，主要是在田间应用过程中，活菌的定殖和繁殖易受田间环境因子的影响，如湿润性、分散性、温度、湿度和紫外线。此外，加工和贮存条件也容易使活菌活性降低。微生物农药剂型可以有效保护微生物在加工、贮存和田间应用过程中的活性，提高其施用便利程度。而助剂，则是剂型的“灵魂”。
助剂是农药中除有效成分之外的辅助成分，包括载体和表面活性剂等。微生物农药的有效成分是活体微生物，疏水性强，颗粒大，导致微生物农药的润湿性和悬浮性等理化性质不好，不易兑水施用，故微生物农药需要添加助剂以提高制剂的物化性质；活体微生物容易受加工条件和环境因素的影响而失活，故微生物农药需要添加助剂以保护活性成分。此外，由于很多助剂为化学合成，在微生物农药加工过程中还要考虑助剂自身与活体微生物的相容性。因此微生物农药助剂的研究重要而复杂。
实施例一
为详细说明本发明的技术内容、所实现的目的及效果，以下结合实施方式予以说明。
一种微生物抑菌剂，包括：混合菌液和助剂，混合菌液为蕈状芽孢杆菌(BacillusmycoidesGnyt1)和假单胞杆菌(Pseudomonas sp.ChO19)混合后的液体，助剂包括吐温-80、山梨醇、尼泊金甲酯。
需要说明的是，芽孢杆菌能产生对热、紫外线、电离辐射和某些化学药品有很强抗逆性的芽孢，可忍受各种不良环境，有利于生防菌剂的生产、剂型加工及在环境中存活和繁殖；吐温-80也叫聚山梨酯-80，为非离子型亲水性表面活性剂，微有特臭、味微苦、略涩，有温热感，可以用作注射剂的增溶剂及其他剂型的乳化剂和分散剂；山梨醇为白色结晶性粉末，无臭，味略甜，有吸湿、保水作用，易溶于水，溶于乙醇；尼泊金甲酯也称对羟基苯甲酸甲酯，白色结晶粉末或无色结晶，极微溶于水，主要用作有机合成、食品、化妆品、医药的杀菌防腐剂，也用作于饲料防腐剂，由于它具有酚羟基结构，所以抗细菌性能比苯甲酸、山梨酸都强。
由上可知，吐温-80、山梨醇、尼泊金甲酯各自的特性能够提高混合菌液的物化性质，并且能够保护混合菌液的活性成分。
进一步地，微生物抑菌剂各组成成分所占的质量百分比为：混合菌液1.00％～2.00％，吐温-801.30％～1.70％，山梨醇0.40％～0.60％和尼泊金甲酯0.40％～0.60％，余量用灭菌的LB液体培养基补至100％。
需要说明的是，经试验表明，本发明提供的微生物抑菌剂中采用的助剂浓度配比，可以使得混合菌液中的生防细菌生长效果最好，从而可以保证该微生物抑菌剂的抑菌效果最好。
进一步地，蕈状芽孢杆菌(Bacillus mycoidesGnyt1)，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏时间为2017年4月10日，保藏编号为CCTCC NO:M2017177；假单胞杆菌(Pseudomonas sp.ChO19)保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏时间为2010年9月13日，保藏编号为CCTCC NO:M2010229。
实施例二
一种微生物抑菌剂的制备方法，参见图1，该方法包括以下步骤：
步骤(1)、制备混合菌液：分别将蕈状芽孢杆菌(Bacillus mycoidesGnyt1)和假单胞杆菌(Pseudomonas sp.ChO19)进行培养，然后混合，得到混合菌液。
步骤(2)、确定助剂配比：基于混合菌液，采用响应面分析法确定助剂配比。
步骤(3)、制备微生物抑菌剂：将制备的混合菌液与助剂混合，然后进行培养，得到微生物抑菌剂。
实施例三
一种微生物抑菌剂的制备方法，结合图2，对上述图1所示的微生物抑菌剂的制备方法进行详细论述：
步骤(101)：分别将蕈状芽孢杆菌(Bacillus mycoidesGnyt1)和假单胞杆菌(Pseudomonas sp.ChO19)通过划线法接种于LB固体培养基中，并放置于28℃培养箱培养3d。
需要说明的是，划线法是指把混杂在一起的微生物或同一微生物群体中的不同细胞用接种环在平板培养基表面通过划线稀释而得到较多独立分布的单个细胞，经培养后生长繁殖成单菌落，通常把这种单菌落当作待分离微生物的纯种。有时这种单菌落并非都由单个细胞繁殖而来的，故必须反复分离多次才可得到纯种。其原理是将微生物样品在固体培养基表面多次作“由点到线”稀释而达到分离的目的。
步骤(102)：挑取单菌落接种于装有50mL LB液体培养基的150mL三角瓶，于180r/min、28℃的摇床培养3d。
步骤(103)：上述2株培养好的菌悬液以体积比1：1的比例按10％的接种量接种于装有50mL LB液体培养基的150mL三角瓶，于180r/min、28℃的摇床培养3d，得到混合菌液。
步骤(104)：多个150mL摇瓶中均装有50mL LB液体培养基，LB液体培养基中均含有助剂，且不同摇瓶中的LB液体培养基中含有的助剂浓度不同。
步骤(105)：向多个装有LB液体培养基的摇瓶中的其中一个，加5mL无菌LB液体培养基作为对照组；并向剩余的多个装有LB液体培养基的摇瓶中加入5mL步骤(103)中得到的混合菌液作为试验组。
步骤(106)：摇瓶密封后放置于180r/min、28℃恒温摇床培养40h，每隔4h用紫外分光光度计测定各试验组和对照组的吸光度值(OD600)，试验重复3次，确定出助剂配比为吐温-801.30％～1.70％、山梨醇0.40％～0.60％和尼泊金甲酯0.40％～0.60％。
需要说明的是，通过步骤(106)测定吸光度值后，可以采用响应面分析法确定助剂配比。响应面分析法，即响应曲面设计方法，是利用合理的试验设计方法并通过实验得到一定数据，采用多元二次回归方程来拟合因素与响应值之间的函数关系，通过对回归方程的分析来寻求最优工艺参数，解决多变量问题的一种统计方法。
通过步骤(106)测定得到的吸光度值的数据参见下表一：
表一：紫外分光光度计测定的吸光度值(OD600)
还需要说明的是，通过表一中的数据，采用多元二次回归方程来拟合因素与响应值之间的函数关系，对回归方程进行分析确定出最佳的助剂配比。
步骤(107)：按质量比为混合菌液1.00％～2.00％、吐温-801.30％～1.70％、山梨醇0.40％～0.60％和尼泊金甲酯0.40％～0.60％进行混合，余量用灭菌的LB液体培养基补至100％，在28℃恒温摇床培养32h，得到微生物抑菌剂。
需要说明的是，该微生物抑菌剂经液体发酵生成液体活菌制剂时，以体积比为液体活菌制剂：水＝1:100混合。
实施例四
本实施例中主要对病原菌麦根腐平脐蠕孢、链格孢、木贼镰刀菌、燕麦镰刀菌、尖孢镰刀菌和玉米弯孢菌进行试验，观察该微生物抑菌剂对这几种病原菌的抑制效果。
试验过程：将2株培养好的菌悬液以体积比1：1的比例按10％的接种量接种于装有LB液体培养基的三角瓶中，于180r/min、28℃的摇床培养3d，得到混合菌液。用平板对峙法初步筛选2种菌株对上述7种病原菌的拮抗作用。将保存的7种病原菌分别转接在PDA平板上，25℃，培养5-7d。同时将供试的混合菌液接种到含有吐温-8014.96mL/L、山梨醇5.60g/L和尼泊金甲酯5.12g/L的LB液体培养基中，并培养24h(28℃，180r/min)，得到微生物抑菌剂，并测定微生物抑菌剂浓度为108μg/mL左右备用。采用“十”字交叉法在PDA平板背面做好标记，分别在中心位置接种7种倒置直径为5mm的病原菌菌饼，在“十”字两端距中心位置23mm放置直径为5mm滤纸片，并用加液枪吸取2μL已培养好的微生物抑菌剂加在其上面，微生物抑菌剂与一个病原菌间的拮抗作用设3个重复，以只在中心位置接病原菌为对照，25℃培养5-7d，待对照铺满整个平板时，按照以下公式计算：
抑菌率＝(对照菌落半径-处理菌落半径)/对照菌落半径
将微生物抑菌剂与每一种病原菌进行三次试验，具体的试验结果参见下表二：
表二：微生物抑菌剂对病原菌的抑菌率
对表二中的数据进行分析整理，得到微生物抑菌剂对病原菌生防效果，具体数据参见下表三：
表三：微生物抑菌剂对病原菌生防效果
编号 病原菌名称 抑菌率(％)
1 麦根腐平脐蠕孢 70.79～73.38
2 链格孢 67.62～69.03
3 尖孢镰刀菌 82.07～84.62
4 厚孢镰刀菌 69.86～70.39
5 玉米弯孢菌 67.61～68.24
6 燕麦镰刀菌 71.36～73.17
7 木贼镰刀菌 73.63～74.38
从表三可以看出本发明的微生物抑菌剂对多种病原菌有生防效果，其中对病原菌麦根腐平脐蠕孢、链格孢、木贼镰刀菌、燕麦镰刀菌、尖孢镰刀菌和玉米弯孢菌都有抑制效果且抑菌率均大于67.60％。该微生物抑菌剂对麦根腐平脐蠕孢病原菌的抑菌率达到70.79％～73.38％，对尖孢镰刀菌的抑菌率达到82.07％～84.62％，对玉米弯孢菌的抑菌率达到67.61％～68.24％。该微生物抑菌剂对多种镰刀菌属、麦根腐平脐孺孢、链格孢和玉米弯孢菌等叶部、根部病原菌均有抑制性。可见，该微生物抑菌剂可用于作物根、茎和叶部病害防治进行施用。
实施例五
本实施例将以燕麦盆栽为例对本发明的微生物抑菌剂进行试验验证。
试验过程为：在燕麦盆栽上分别接种实施例四中的7种病原菌，三天后进行喷施上述微生物抑菌剂，共两次，早晚各1次，每盆每次2mL，每种病原菌进行三组试验，具体试验数据参见表四和表五。
表四：微生物抑菌剂对接种不同病原菌的燕麦盆栽的农艺性状的作用
表五：微生物抑菌剂对接种不同病原菌的盆栽燕麦的根部和叶部病害的防治效果
根部病害 叶部病害
编号 防治效果(％) 防治效果(％)
1 48.95 42.2
1 47.62 40.87
1 49.54 42.79
2 62.41 58.7
2 61.42 55.61
2 60.35 60.67
3 45.58 38.83
3 42.56 35.81
3 48.56 41.81
4 65.45 63.37
4 62.36 64.61
4 67.42 63.09
5 51.26 55.66
5 53.45 54.67
5 54.18 53.6
6 67.12 45.72
6 68.36 48.39
6 69.84 44.51
7 52.47 44.51
7 55.14 46.7
7 51.26 47.43
需要说明的是，上述表四中的PB为未喷施微生物抑菌剂时燕麦盆栽到农艺性状，PB+MP为喷施了微生物抑菌剂后燕麦盆栽到农艺性状，如检测微生物抑菌剂对接种了麦根腐平脐蠕孢的燕麦盆栽的农艺性状的作用时，第一组中株高的增加＝(40.00-38.86)/38.86×100％＝2.93％。
对上述表四和表五中的数据进行分析整理，得到微生物抑菌剂对接种不同病原菌的盆栽燕麦的农艺性状对比，具体数据参见下表六：
表六：微生物抑菌剂对接种不同病原菌的盆栽燕麦的农艺性状对比
需要说明的是，表四、表五和表六中1表示麦根腐平脐蠕孢，2表示链格孢，3表示尖孢镰刀菌，4表示厚孢镰刀菌，5表示玉米弯孢菌，6表示燕麦镰刀菌，7表示木贼镰刀菌。
从上述表六可以看出本发明的微生物抑菌剂经盆栽试验验证，结果表明，使用该微生物抑菌剂对不同病原菌处理燕麦叶部防病效果达38.82％～63.69％，对根部病害防治效果达45.57％～68.44％，其中对木贼镰刀菌处理的病害防治效果最好。使用该微生物抑菌剂对对燕麦苗期株高提高了0.33％～12.07％，对燕麦地上鲜重增加了0.02％～10.21％；对燕麦根长增加了0.08％～3.73％，其中该微生物抑菌剂对玉米弯孢菌处理时对燕麦株高增加效果较好为9.41％～12.07％，该微生物抑菌剂对木贼镰刀菌处理时对燕麦地上鲜重和根系增加效果较好分别为0.96％～5.56％、0.74％～3.73％。可见，施用本配方的微生物抑菌剂抑菌剂，既可以增加燕麦的产量，同时可以提高其品质。
值得说明的是，本微生物抑菌剂中两种菌株与助剂协同作用，使得本微生物抑菌剂不仅防病促生，而且还有较好的湿润性、防腐性、分散性、紫外保护性；其次，本微生物抑菌剂还具有成本低、使用安全、经济效益高、无环境污染等优点；另外，本微生物抑菌剂在喷施的过程一些会落到植物表面、另一些会从植物表面滴落到土壤表面，这些滴落到土壤表面的微生物在适宜的环境中可以大量繁殖，会分解有机物，从而可以改变土壤的结构和土壤微生物的多样性分布。
上述本发明实施例序号仅仅为了描述，不代表实施例的优劣。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种微生物抑菌剂，其特征在于，所述微生物抑菌剂包括：混合菌液和助剂，所述混合菌液为蕈状芽孢杆菌(Bacillus mycoidesGnyt1)和假单胞杆菌(Pseudomonassp.ChO19)混合后的液体，所述助剂包括吐温-80、山梨醇、尼泊金甲酯。
2.根据权利要求1所述的一种微生物抑菌剂，其特征在于，所述微生物抑菌剂各组成成分所占的质量百分比为：混合菌液1.00％～2.00％，吐温-80 1.30％～1.70％，山梨醇0.40％～0.60％和尼泊金甲酯0.40％～0.60％，余量用灭菌的LB液体培养基补至100％。
3.根据权利要求1所述的一种微生物抑菌剂，其特征在于，所述蕈状芽孢杆菌(Bacillus mycoidesGnyt1)，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏时间为2017年4月10日，保藏编号为CCTCC NO:M2017177；所述假单胞杆菌(Pseudomonas sp.ChO19)保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏时间为2010年9月13日，保藏编号为CCTCC NO:M2010229。
4.一种微生物抑菌剂的制备方法，其特征在于，所述方法包括：
步骤(1)、制备混合菌液：分别将所述蕈状芽孢杆菌(Bacillus mycoidesGnyt1)和所述假单胞杆菌(Pseudomonas sp.ChO19)进行培养，然后混合，得到所述混合菌液；
步骤(2)、确定助剂配比：基于所述混合菌液，采用响应面分析法确定助剂配比；
步骤(3)、制备微生物抑菌剂：将制备的所述混合菌液与所述助剂混合，然后进行培养，得到所述微生物抑菌剂。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)包括：分别将所述蕈状芽孢杆菌(Bacillus mycoidesGnyt1)和所述假单胞杆菌(Pseudomonas sp.ChO19)通过划线法接种于LB固体培养基中，并放置于28℃培养箱培养3d；挑取单菌落接种于装有50mL LB液体培养基的150mL三角瓶，于180r/min、28℃的摇床培养3d；上述2株培养好的菌悬液以体积比1：1的比例按10％的接种量接种于装有50mL LB液体培养基的150mL三角瓶，于180r/min、28℃的摇床培养3d，得到所述混合菌液。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)包括：
多个150mL摇瓶中均装有50mL LB液体培养基，所述LB液体培养基中均含有助剂，且不同摇瓶中的LB液体培养基中含有的助剂的浓度不同；
向所述多个装有LB液体培养基的摇瓶中的其中一个，加5mL无菌LB液体培养基作为对照组；并向剩余的多个所述装有LB液体培养基的摇瓶中加入5mL所述混合菌液作为试验组；
摇瓶密封后放置于180r/min、28℃恒温摇床培养40h，每隔4h用紫外分光光度计测定各试验组和对照组的吸光度值(OD600)，试验重复3次，确定出助剂配比为吐温-80 1.30％～1.70％、山梨醇0.40％～0.60％和尼泊金甲酯0.40％～0.60％。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)包括：按质量比为混合菌液1.00％～2.00％、吐温-80 1.30％～1.70％、山梨醇0.40％～0.60％和尼泊金甲酯0.40％～0.60％进行混合，余量用灭菌的LB液体培养基补至100％，在28℃恒温摇床培养32h，得到所述微生物抑菌剂。
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