CN102533603A

CN102533603A - 一株用于防治棉花黄萎病的假单胞菌及其应用

Info

Publication number: CN102533603A
Application number: CN2012100062189A
Authority: CN
Inventors: 唐灿明; 赵明文; 韩琴; 李顺鹏
Original assignee: Nanjing Agricultural University
Current assignee: Nanjing Agricultural University
Priority date: 2012-01-10
Filing date: 2012-01-10
Publication date: 2012-07-04
Anticipated expiration: 2032-01-10
Also published as: CN102533603B

Abstract

本发明属于生物农药技术领域，涉及一株用于防治棉花黄萎病的假单胞菌及其应用。假单胞菌(Pseudomonas sp.)841P-3，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期：2011年12月13日，保藏号：CGMCC No.5583。所述的保藏号为CGMCC No.5583的假单胞菌841P-3在防治棉花黄萎病中的应用。通过微生物发酵获得大量假单胞菌841P-3菌株，且能产生诱导系统抗性，对人畜无毒，对农作物物毒害，绿色环保，防治棉花枯黄萎病效果显著，具有良好的生物农药开发前景。

Description

一株用于防治棉花黄萎病的假单胞菌及其应用

技术领域

本发明属于生物农药技术领域，涉及一株用于防治棉花黄萎病的假单胞菌及其应用。

背景技术

棉花黄萎病(cotton Verticillium wilt)是由大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)侵染引起的真菌性维管束系统病害，是棉花最严重病害之一。大丽轮枝菌的菌丝体能产生大量微菌核，这些微菌核在土壤中存活时间长，且寄主广泛，传播途径多，严重威胁棉花生产，给我国棉花生产造成严重损失。迄今尚无有效的防治方法。棉花黄萎病为土传维管束病害，防治困难，难以找到很好的抗源材料，因而多年来一直未能培育出高抗黄萎病的棉花新品种，研究开发的病害防治方法和药剂亦难以达到理想的防治效果。

植物内生细菌是指那些在其生活史的一定阶段或全部阶段生活于健康植物的各种组织和器官内部的细菌。被内生细菌感染的宿主植物(至少是暂时)不表现出外在病症，可通过组织学方法或从严格表面消毒的植物组织中分离，或从植物组织内直接扩增出微生物DNA的方法来证明其内生。内生细菌主要分布于细胞间与维管束组织，广泛存在于植物的果实、种子、胚、根、茎、叶中。内生细菌具有能增强宿主植物抗逆性的特性，研究者已经从棉花，水稻，小麦，茄子，马铃薯，可可等作物中筛选出许多拮抗病原菌的内生菌，并由此开发出一些植物生防菌剂。

大量的研究事实证明了生防菌处理植物后能达到促进生长与病害防治的目的。我国在这方面的研究主要在小麦、棉花等作物病害防治。目前，随着人们对无公害食品的要求和环境保护意识的日益增强，人们逐渐摆脱了防治病害完全依赖化学农药的观点，逐渐把生物防治与病害的综合治理联系起来，并成为其中重要组成部分。

假单胞菌是活跃在植物根际的一类微生物，属Plant Growth-promotingRhizobacteria(PGPR)一大类，假单胞菌的促生长作用机理一是产生活性物质或改善矿质营养直接促进植物生长；二是产生代谢物质或竞争作用抑制或阻碍根区病原微生物的发展，间接促进植物的生长。其生防作用机理包括有效的根部定殖、抗生作用、根际营养竞争(特别是对铁的竞争)、分泌降解微生物的酶和诱导植物抗性等。

诱导植物抗病性是国际上近期兴起的一个重要研究领域，利用植物诱导抗病性被认为是植物保护的新技术和新途径。利用植物自身的防御系统来防病也是今后农药发展的重要方向。研究开发既可以控制病害发生又能避免化学合成农药过量应用对人、畜及环境所产生的负面效果的新型生物农药产品，是国际上农药研发的一个方向。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的上述不足，提供一株假单胞菌。

本发明的另一目的是提供该菌株的应用。

本发明的目的可通过如下技术方案实现：

假单胞菌(Pseudomonas sp.)841P-3，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期：2011年12月13日，保藏号：CGMCC No.5583。

假单胞菌841P-3(CGMCC No.5583)形态特征如下：革兰氏阴性菌，极生鞭毛，可游动，(0.5-1.0)μm×(1.1-3.0)μm，单菌落具有扩散性，扁平而潮湿.各项理化分析结果如下：荧光、需氧性、氧化酶、过氧化氢酶、明胶液化、硝酸盐还原试验、简单碳源生长试验、产H₂S、靛基质试验、柠檬酸盐试验、赖氨酸脱羧酶和鸟氨酸脱羧酶均为阳性。肌醇和反消化为阴性.在42℃下，能生长PH5.7能生长。16SrDNA测序结果与假单胞菌科(Pseudomonadaceae)中的假单胞菌属同源性达到99.7％.对氨苄青霉素、氯霉素，链霉素具有较强的抗性。最适PH为为7.2，最适培养温度为28-30℃。最佳培养基成分：蛋白胨2g，琼脂1.5g，甘油1g，磷酸氢二钾0.15g，七水硫酸镁0.15g，蒸馏水100mL，PH7.2。

所述的保藏号为CGMCC No.5583的假单胞菌841P-3在防治棉花黄萎病中的应用。

有益效果：

本发明所述假单胞菌841P-3能强烈抑制棉花强致病性黄萎病菌系V107菌丝的生长和孢子萌发，使病原菌菌丝畸形，膨大，生长不正常，使病原菌孢子破裂，抑制孢子萌发。且能够诱导棉花的产生抗黄萎病性，处理后减少了病原菌对幼根和真叶的伤害。盆栽实验验证，841P-3菌株能促进棉花感病品种苏棉9号出苗，对苏棉9号，841P-3防治黄萎病V107的效应为46.9％。通过微生物发酵获得大量假单胞菌841P-3菌株，且能产生诱导系统抗性，对人畜无毒，对农作物物毒害，绿色环保，防治棉花枯黄萎病效果显著，具有良好的生物农药开发前景。

附图说明

图1841P-3细菌显微照片。

图2841P-3的划线形态。

图3841P-3对黄萎病菌V107的抑制作用。

图4841P-3菌对V107菌丝生长影响。

图5841P-3菌对V107孢子萌发的影响。

图6841P-3菌提高幼根抵抗黄萎病V107的作用。

图7841P-3菌提高苏棉9号真叶抵抗黄萎病V107的作用。

图8841P-3对苏棉9号出苗率的影响。

图9841P-3对苏棉9号防治黄萎病V107的效果。

生物材料样品保藏信息

假单胞菌(Pseudomonas sp.)841P-3，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏日期：2011年12月13日，保藏号：CGMCC No.5583。

具体实施方式

实施例1假单胞菌841P-3的获得

1.1细菌的分离

取健康的现蕾期棉M-8124-1159花根，用灭菌刀取主根5～10cm处，浸入70％酒精1min，以1.05％次氯酸钠对样品表面灭菌，灭菌时间为15～18min，取经检验表面灭菌彻底的材料1.00g于无菌研钵中，加灭菌的PBS缓冲液研磨，静置15min后加缓冲液定容至10mL，取1ml分离液梯度稀释后取0.1ml涂布于制备的S2(琼脂18g，蔗糖10g，甘油10ml，酪蛋白5g，碳酸氢钠1g，MgSO₄·7H₂O 1g，K₂HPO₄ 2.3g，月桂酰基肌氨酸钠1.2g，去离子水定容至1L)培养基，用于假单胞菌属的分离，平行三组，28℃下培养2～3天，计菌落数。根据菌落的形态、颜色、大小等挑取单菌落，反复划线纯化后接斜面保存，供测试鉴定。

1.2拮抗细菌的筛选

1.2.1平板对峙培养法

以棉花黄萎病菌大丽轮枝菌V107(由江苏农科院植保所提供)为指示菌，将1.1中分离到的细菌菌株采用平板对峙生长法进行拮抗性筛选。在长满大丽轮枝菌菌丝的平板边缘处用灭菌的打孔器打下直径为6mm的菌饼，然后将菌饼贴于PDA平板中央，26～28℃培养2天后，在距菌饼2cm处接种分离菌株，对照平板只接病原菌大丽轮枝菌菌饼，不点接筛选菌，28℃恒温箱中培养3～5天，观察待测菌株对大丽轮枝菌有无拮抗作用(图3)，每菌株重复3次。选择抑菌直径大于1cm的菌株进入下一轮筛选。

1.2.2平板扩散法

菌株的制备：将各供试菌株在LB平板上活化，挑取一环接种于含4mlLB培养液的试管中，28℃下170r/min振荡培养24h。

大丽轮枝菌孢子悬浮液的制备：取在PDA平板上活化的大丽轮枝菌V107菌丝块，接种于察贝克液体培养基中，25℃下120r/min恒温摇床振荡培养6天。用灭菌纱布滤去培养液中的菌丝，用无菌水将孢子浓度调为1×10⁷ml^-1，备用。

吸取制备好的大丽轮枝菌V107孢子悬浮液1ml，加入到熔化并冷却到45℃左右的100mlPDA培养基(琼脂含量为0.7％)中，混匀，倾覆在已凝固的PDA平板上，待上层培养基冷却凝固后，在平板上打孔(直径为6mm)，在每个孔内加入经平板对峙培养法初步筛选得到的优势菌株的发酵液40μl，以LB培养液作为空白对照，每处理设3个重复，将平板置于28℃恒温培养箱内培养36h后观察是否可产生抑菌圈(图3)。选择抑菌圈最大，效果稳定的菌株，命名为841P-3。841P-3：革兰氏阴性菌，极生鞭毛(图1)，可游动，(0.5-1.0)μm×(1.1-3.0)μm，单菌落具有扩散性，扁平而潮湿(图2)。各项理化分析结果如下：荧光、需氧性、氧化酶、过氧化氢酶、明胶液化、硝酸盐还原试验、简单碳源生长试验、产H₂S、靛基质试验、柠檬酸盐试验、赖氨酸脱羧酶和鸟氨酸脱羧酶均为阳性。肌醇和反消化为阴性.在42℃下，能生长PH5.7能生长。16SrDNA测序结果与假单胞菌科(Pseudomonadaceae)中的假单胞菌属同源性达到99.7％，鉴定为假单胞杆菌(Pseudomonas sp.)。假单胞杆菌841P-3对氨苄青霉素、氯霉素，链霉素具有较强的抗性，最适PH为为7.2，最适培养温度为28-30℃，最佳培养基成分：蛋白胨2g，琼脂1.5g，甘油1g，磷酸氢二钾0.15g，七水硫酸镁0.15g，蒸馏水100mL，PH7.2。将该菌株送交中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏日期：2011年12月13日，保藏号：CGMCC No.5583。

实施例2拮抗机理研究：

挑取对峙培养中拮抗菌假单胞杆菌841P-3(CGMCC No.5583)周围的菌丝和收集拮抗菌处理周围的孢子镜检观察菌丝生长和孢子萌发情况。结果表明处于假单胞杆菌841P-3(CGMCCNo.5583)周围的大丽轮枝菌V107菌丝出现畸形，膨大，生长不正常，孢子破裂，孢子萌发受到抑制(图4，5)。

实施例3诱导抗性验证

3.1提高棉花幼根抗性

菌体悬浮液制备：将假单胞杆菌841P-3(CGMCC No.5583)菌株接种在液体LB中，37℃恒温培养24h，离心去上清，无菌水重悬，稀释成OD₆₀₀＝0.1的菌悬液。浸泡灭菌棉花种子30min后，28℃培养48h后，移到生长2天的接有大丽轮枝菌V107的PDA平板上，共培养7天后观察伤害程度。结果表明假单胞杆菌841P-3(CGMCC No.5583)浸种后的幼根伤害程度显著小于用水处理的幼根，如图6。

3.2提高叶片抗性

用菌悬液浓度为OD₆₀₀＝0.2假单胞杆菌841P-3(CGMCC No.5583)灌根处理长有2片真叶的棉花植株48h后，取棉花真叶放在水琼脂平板上接种病原菌大丽轮枝菌菌块，28℃培养5天后观察伤害程度和病斑大小。结果表明假单胞杆菌841P-3(CGMCC No.5583)处理的真叶在接种大丽轮枝菌V107菌块5天后，未出现伤害程度和病斑，而用水处理真叶出现大面积的伤害，如图7。

实施例4种子出苗率的观察

用浓度为OD₆₀₀＝0.1的841P-3(CGMCC No.5583)菌悬液浸泡灭菌棉花种子30min后，28℃培养48h后，然后播种于盛有灭菌营养土的营养盒中，每处理播种50粒种子，每处理设3次重复。15天后调查棉苗数量，结果表明假单胞杆菌841P-3(CGMCC No.5583)浸种后能提高棉花幼苗出苗率(表1，图8)，比对照高出14％。

表1.841P-3对苏棉9号出苗率的影响

实施例5检测假单胞菌对强致病性棉花黄萎病的防效

菌体悬浮液制备。将假单胞杆菌841P-3(CGMCC No.5583)菌株接种在平板LB上，30℃恒温培养2d，离心去上清，无菌水重悬，稀释成OD＝0.1的菌悬液。

棉花黄萎病菌扩繁：活化大丽轮枝菌V107菌株，7d后用打孔器(直径8mm)取同菌龄的菌饼接种于查贝克培养基28℃下150mg/kg摇培7d后接种于灭菌后的麦粒培养基中，室温培养14d。

取有拮抗作用的菌液浸泡灭菌棉花种子30min，28℃培养48h的棉种播种于灭菌的蛭石中，生长10天后，移入盛放处理菌土(无菌土∶麦粒培养基＝1∶6)的塑料杯内，每钵2株幼苗，每处理10盆，重复三次。无菌蛭石为对照。苗期调查记录各处理株高，鲜重，黄萎病的发病率和病情指数，并计算生防菌对棉花黄萎病的相对防病效果。

病情指数统计方法：按5级分类标准

(0级，无病植株；1级，25％叶片发病的植株；2级，25％～50％叶片发病的植株；3级，50％～75％叶片发病的植株；4级，75％以上叶片发病的植株)

病情指数＝∑(级值×株数)4×总株数×100

防治效果(％)＝(对照病情指数-处理病情指数)/对照病情指数×100

结果表明假单胞杆菌841P-3(CGMCC No.5583)对棉花黄萎病有好的防治效果(表2，图9)，防治效果为46.9％。与CK相比株高和鲜重分多了0.284cm和0.177g。

表2.拮抗菌防治棉花黄萎病的温室盆栽效果

实施例6大田实验

6.1病圃制备

取南京六合棉花花黄萎病严重暴发的产棉区棉花黄萎病病株，按照王拱辰，倪良财.浙江省棉黄萎病菌的分离和鉴定简报.浙江农业科学，1987，4：172.进行分离，按照丁锦平，刘冬梅等，河南商丘地区棉花黄萎病菌分离鉴定和致病力分析.植物保护学报，2010，37(4)：295-299鉴定为大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)，命名为NJ-1。培养该大丽轮枝菌NJ-1孢子液，接种到用高压消毒过的2∶1麦粒砂混合物中，置于25℃温箱，培养15天左右备用。

以大丽轮枝菌V107作为对照，按照上述方法制备麦粒砂菌物。

6.2接菌步骤

土壤接菌：播种时将6.1中培养好的麦粒砂菌物，以每亩60斤，撒施到播种沟内，种植感病品种苏棉9号，试验小区采用随机区组排列，4次重复，每小区4行。设保护行5行。6.3菌体悬浮液制备

将假单胞杆菌841P-3(CGMCC No.5583)接种在平板LB上，30℃恒温培养24h，接种到LB液体培养基中，培养48h后，收集菌体，加入无菌水，充分混匀，制成OD＝0.1-0,2菌体悬浮液，播种前浸种30min(或与包衣剂混合，以种子量10％的菌体包衣剂对棉花种子进行包衣)，将浸种后的棉花种子播入营养钵中，每钵3粒，盖土并轻轻压实。播种后的营养钵放在塑料拱棚中。出苗1周后，每钵中留1棵壮苗。在棉苗有2片真叶时，移栽到大田。移栽时，每穴中灌入20ml OD＝0.8-1.0的供试细菌悬浮液。以清水浸种种子，穴中灌入清水为对照。在棉花花铃期，即黄萎病发生高峰时期，调查黄萎病发生情况，并计算病情指数和防治效果，结果如表6。

表6.大田验证841P-3(CGMCC No.5583)对苏棉9号防治黄萎病的效果

在我国黄萎病治病菌主要为大丽轮枝菌，目前已有众多文献公开了该菌的分离鉴定方法以及致病力分析。上述实施例只是举例说明本发明假单胞杆菌841P-3(CGMCC No.5583)对黄萎病菌的抑制作用，大丽轮枝菌V107是一株具有强致病力的黄萎病菌，本发明假单胞杆菌841P-3(CGMCC No.5583)对其具有较强的拮抗作用，意味着假单胞杆菌841P-3(CGMCC No.5583)对常规的黄萎病菌均有抑制作用，可用于黄萎病的防治，而不应仅仅局限为对大丽轮枝菌V107的抑制作用。

Claims

1.假单胞菌(Pseudomonas sp.)841P-3，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期：2011年12月13日，保藏号：CGMCC No.5583。

2.权利要求1所述的保藏号为CGMCC No.5583的假单胞菌841P-3在防治棉花黄萎病中的应用。