CN104962491B - 一种除草剂2,4‑d的降解菌株及其生产的菌剂和应用 - Google Patents

一种除草剂2,4‑d的降解菌株及其生产的菌剂和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种除草剂2,4‐D的降解菌株及其生产的菌剂和应用，2015年4月15日保藏于中国典型培养物保藏中心，菌种保藏号为CCTCC NO:M 2015235。该菌株为革兰氏染色反应阴性菌株LZ35，经鉴定为无色杆菌属(Achromobacter sp.)。本发明所述的2,4‐D降解菌株LZ35可应用于除草剂2,4‐D的降解。一种用本发明所述的2,4‐D降解菌株LZ35生产的降解菌剂，2天内降解99％的液体培养基中的100mg/l的2,4‐D，直接施用可显著降低作物药害，解决了农业生产中除草剂残留超标问题，生产出无毒无公害的绿色农产品。

Description

一种除草剂2,4-D的降解菌株及其生产的菌剂和应用
技术领域
本发明属于微生物领域，提供一种除草剂2,4-D的降解菌株及其生产的菌剂和应用。
技术背景
有机氯农药是20世纪80年代前应用的最主要和最有效的农药品种之一，由于其具有价格低廉，高效广谱等特点，在世界范围内得到了广泛应用。而其中的苯氧乙酸类除草剂更是以其成本低，速度快等优势被大规模生产和使用。2,4-D(2,4-二氯苯氧乙酸；2,4-Dichlorophenyloxy acetic acid)是具有代表性的合成植物生长素的物质，同时也是一种常用的除草剂，在农林业中发挥了重大作用，尤其在水果(如柑橘)保鲜中应用广泛。在30ppm以下低浓度时2,4-D可作为植物生长调节剂，在500ppm以上高浓度时则可用作除草剂，可从根、茎、叶进入植物体内。2,4-D降解缓慢，且吸附性强，所以极易残留。因此，其毒性问题受到了广泛关注。此外，由于2,4-D残留导致的下茬作物药害问题也造成严重经济损失，影响粮食安全。大量研究都表明利用微生物来降解消除土壤中的除草剂残留，从而解除下茬作物药害，保障粮食安全，保护生态环境是可行的。
发明内容
本发明的目的在于针对目前日益严重的土壤中残留的除草剂2,4-D，开发研制出一种新型的2,4-D除草剂残留降解菌剂，使用本菌剂可以使土壤中2,4-D、二甲四氯两种除草剂的残留量降低90％以上，生产和使用成本较低。使用该降解菌剂可以有效解除下茬作物药害，保障下茬作物良好生长。
本发明的目的可通过以下技术方案实现：
一株除草剂2,4-滴降解菌株LZ35，2015年4月15日保藏于中国典型培养物保藏中心，菌种保藏号为CCTCC NO：M 2015235。。经鉴定LZ35属无色杆菌属(Achromobacter sp.)，主要生物学特性为G-，菌体为杆状，大小约0.4–0.7μm宽,1.4–2.8μm长，好氧；过氧化氢酶、氧化酶和V.P.反应为阳性；吲哚反应阴性；不能水解淀粉，能氧化葡萄糖产酸，使石蕊牛乳酸凝固，能抗氨苄青霉素、卡那霉素、庆大霉素、链霉素、氯霉素、四环素、壮观霉素和红霉素，该菌株16S rRNA基因的GenBank登录号为KP996670。
本发明所述的除草剂2,4-D降解菌株LZ35在降解除草剂2,4-D中的应用。
本发明所述的除草剂2,4-D降解菌株LZ35在制备降解除草剂2,4-D的菌剂中的应用。
一种用本发明所述的除草剂2,4-D残留降解菌株LZ35生产的降解菌剂。
所述的降解菌剂优选通过以下方法生产而成：
1)将所述的除草剂2,4-D降解菌株LZ35试管种接种于肉汤培养基摇瓶中，振荡培养至对数期；
2)将上述培养好的菌种按10％的接种量接种入种子罐，培养至对数生长期，种子罐所用的培养基配方为：葡萄糖0.8％，(NH4)2SO4 1％，K2HPO4 0.2％，MgSO4 0.05％，NaCl0.01％，CaCO3 0.3％，酵母膏0.02％，pH值7.2-7.5；
3)将种子液按10％的接种量接入生产罐培养，生产罐所用培养基与种子罐培养基相同；
4)发酵完成后培养液出罐直接用塑料包装桶或包装瓶分装成液体制剂或采用泥炭吸附用包装袋分装成固体菌剂制剂；
其中，在种子罐和生产罐的培养过程中无菌空气的通气量为1：0.6－1.2，搅拌速度为180－240转/分，培养温度为30－35℃，全流程培养时间为36－48小时,发酵结束后菌体数量达到10亿个/ml以上。
本发明所述的菌剂在降解除草剂2,4-滴中的应用，优选在降解土壤中残留的除草剂2,4-滴中的应用。
有益效果
使用该发明生产的2,4-D除草剂残留降解菌剂具有生产使用成本低，使用方便，去除土壤中残留2,4-D效果好的优点，适合于2,4-D使用后下茬作物产生药害的地区推广使用。本发明对于保护生态环境，保护人民的身体健康具有重要的意义。降解菌株LZ35在以2,4-D，二甲四氯为唯一碳源的无机盐培养基中，按1％的接种量接入降解菌株LZ35，于30℃，振荡培养24小时后，取样测定降解率，从结果中可以看出，降解菌LZ35对这两种除草剂的降解率都在90％以上，具有很好的降解效果，并且该菌为革兰氏阴性菌，而且抗逆性强，在田间的存活时间适当，不会影响以后除草剂的使用效果。
用本发明产品在实验室进行盆钵进行残留除草剂的降解效果试验。从表1中可以看出经降解菌处理后能显著降低土壤中残留除草剂对玉米植株的药害，菌株在土壤中定植能力强，能够显著降解土壤中的残留的除草剂，对后茬作物药害的解除具有巨大的应用前景(见实施例3)。
本发明成功地解决了农业生产中除草剂残留导致下茬作物药害的问题，既充分发挥了化学除草剂在植物杂草防治中的高效快速的作用，又可以充分解除对后茬作物的药害，保障粮食安全。
附图说明
图1:土壤中2,4-滴浓度为50ppm时对玉米植株生长的药害实验，处理为加入LZ35降解菌剂对2,4-滴药害的解除实验，空白对照为土壤中不加2,4-滴的实验。
图2：土壤中2,4-滴浓度为100ppm时对玉米植株生长的药害实验，处理为加入LZ35降解菌剂对2,4-滴药害的解除实验，空白对照为土壤中不加2,4-滴的实验。
图3：土壤中2,4-滴浓度分别为50ppm和100ppm时对玉米植株生长的药害实验，处理为加入LZ35降解菌剂对2,4-滴药害的解除实验，空白对照为土壤中不加2,4-滴的实验。
图4：菌株LZ35对玉米植株在浓度为50ppm的2,4-D土壤中生长的残留药害的解除作用比较，包括对玉米植株根，茎，叶的影响比较。
图5：菌株LZ35对玉米植株在浓度为100ppm的2,4-D土壤中生长的残留药害的解除作用比较，包括对玉米植株根，茎，叶的影响比较。
图6，菌株LZ35对玉米植株在浓度分别为50ppm和100ppm的2,4-D土壤中生长的残留药害的解除作用比较，包括对玉米植株根，茎，叶的影响比较。
图7.在实验室条件下，将菌株LZ35接种到含有2,4-D终浓度为50ppm无机盐液体培养基中，30℃培养3天后，直接取1ml液体培养基，离心取上清后用紫外分光光度计进行检测。对照为只加有2，4-D终浓度为50ppm无机盐液体培养基。
图8：在实验室条件下，将菌株LZ35接种到含有2,4-D终浓度为50ppm无机盐液体培养基中，30℃培养3天后，直接取1ml液体培养基，离心取上清过0.22μm水相滤膜后用HPLC进行检测。对照为只加有2,4-D终浓度为50ppm无机盐液体培养基。
图9：在实验室条件下，调节菌株LZ35在液体无机盐培养基中初始OD600至0.1，其降解起始浓度为200ppm的2,4-D对时间作的降解曲线。Control为不加菌体的对照。
生物材料保藏信息
除草剂2,4-D降解菌株LZ35，分类命名为Achromobacter sp.LZ35，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉武汉大学，保藏日期为2015年4月15日，保藏编号CCTCC NO：M 2015235。
具体实施方式
实施例1
本发明提供一种能高效降解(矿化)2,4-D的菌株及其生产的菌剂，所用菌株为革兰氏染色阴性菌LZ35，分离自江苏昆山绿利来农药厂厂区的土壤中。菌株具体的分离筛选方法为：取土样5.0g加入到100ml添加0.1％酵母粉的无机盐液体培养基中,加2,4-D终浓度为50ppm，在30℃条件下进行富集培养，摇床转速为150rpm，每隔7d以10％的接种量接种至新鲜的无机盐液体培养基中，连续传代培养3次。然后以1％的接种量接种至加有2,4-D终浓度为50ppm的新鲜的20ml无机盐液体培养基中，培养5d。用紫外扫描仪和液相色谱同时检测2,4-D含量，发现富集液中2,4-D被完全降解。将获得的有效果的富集液进行梯度稀释，涂布于含有100mg·l-1 2,4-D的固体无机盐平板培养基，30℃倒置培养5d，挑取单菌落于3ml液体LB试管培养基中，然后保存并验证单菌的2,4-D降解功能，从而获得2,4-D降解菌株LZ35。2015年04月15日保藏于中国典型培养物保藏中心，菌种保藏号为CCTCC NO：M 2015235。经鉴定LZ35属无色杆菌属(Achromobacter sp.)主要生物学特性为G-，菌体为杆状，大小约0.4–0.7μm宽,1.4–2.8μm长，好氧；过氧化氢酶、氧化酶和V.P.反应为阳性；吲哚反应阴性；不能水解淀粉，能氧化葡萄糖产酸，使石蕊牛乳酸凝固，能抗氨苄青霉素、卡那霉素、庆大霉素、链霉素、氯霉素、四环素、壮观霉素和红霉素，该菌株16S rRNA基因的GenBank登陆号为KP996670。
菌株LZ35在以2,4-D，二甲四氯为唯一碳源的无机盐培养基中对目标除草剂的降解：将本发明的2,4-D除草剂降解菌株LZ35的原种在培养皿上活化，并测定降解性能，接种于试管斜面上，挑取菌株LZ35单菌，接种于100ml液体LB培养基中，30℃摇床150rpm培养过夜。然后离心收集菌体，用无菌水洗涤菌体两次后，再用无菌水重悬菌体。然后将菌体分别转接于加有终浓度为100ppm的2,4-D和二甲四氯的液体无机盐培养基中，并同时设置空白对照。30℃摇床150rpm培养两天后直接吸取培养基离心后用高效液相色谱检测无机盐培养基中2,4-D及二甲四氯的含量。通过计算峰面积，得出了菌株LZ35在以2,4-D和二甲四氯为唯一碳源的无机盐培养基中对目标除草剂的降解率均高达99％。即菌株能完全矿化2,4-D和二甲四氯。
菌株LZ35降解效果检测方法：
紫外扫描法：
由于2,4-D具有很高的水溶性，所以将经过降解处理的无机盐液体培养液，以新鲜配制的无机盐培养液扫描基线，直接在UV-2450PC型分光光度计上于200～350nm段进行紫外扫描。液相色谱法：
由于2,4-D具有很高的水溶性，所以直接取1ml经过降解处理的无机盐液体培养液，12,000×g离心10min，收集上清液。然后用0.22微米的水相滤膜过滤。液相色谱条件：岛津RID-10A；C18反相柱；流动相：甲醇：水：乙酸(体积比80/19.5/0.5)，流速：1ml·min-1，紫外检测器，波长225nm和235nm；进样量：20μl。
菌株LZ35在实验室条件下降解2,4-D效果的紫外和HPLC检测图(图7,8)。
实施例2
将本发明的2,4-D除草剂降解菌株LZ35的原种在培养皿上活化，并测定降解性能，接种于试管斜面上备用。试管种接种于含200ml肉汤培养基(牛肉膏3克，蛋白胨10克，NaCl5克，水1000毫升，pH 7.0-7.2)的1000ml摇瓶中，恒温振荡培养至对数期,准备接种种子罐。种子罐500升，投料量400升，培养基配方为：葡萄糖0.8％，(NH4)2SO4 1％，K2HPO4 0.2％，MgSO4 0.05％，NaCl 0.01％，CaCO3 0.3％，酵母膏0.02％，pH值7.2-7.5。投料完毕后121℃高压湿热灭菌，冷却至33℃后，将上述培养好的摇瓶菌种按10％的接种量接种入500升种子罐，培养至对数生长期，搅拌速度为220转/分，无菌空气通入量为1：0.8。将到达对数期的种子液按10％的接种量接入生产罐培养，生产罐所用培养基成分与种子罐培养基相同。生产罐容量5吨，投料量4.5吨。投料后的生产罐1.1kg/cm2的压力下，121℃高压湿热灭菌，灭菌后冷却至35℃以下，通无菌空气保持无菌状态备用。接种后的生产罐温度控制在30－35℃，生产罐的培养过程中无菌空气的通气量为1：0.6－1.2，搅拌速度为240转/分，整个工艺流程培养时间为36－48小时。发酵结束后菌体数量达到10亿个/ml以上。发酵完成后培养液出罐直接用塑料包装桶或包装瓶分装成液体剂型或采用泥炭吸附用包装袋分装成固体菌剂剂型。
实施例3
将本发明的2,4-D除草剂降解菌株LZ35的原种在培养皿上活化，并测定降解性能，接种于试管斜面上备用。试管种接种于含500ml肉汤培养基(牛肉膏3克，蛋白胨10克，NaCl5克，水1000毫升，pH 7.0-7.2)的1000ml摇瓶中，恒温振荡培养至对数期。离心收集菌体，无菌水重悬菌体。然后取新鲜供试土壤，加入2,4-D水溶液，充分拌匀，使土壤中2,4-D的浓度分别为50mg·kg-1和100mg·kg-1干土。同时，处理组接种新鲜的LZ35菌株菌悬液于土壤中，空白对照组加入无菌水，同样搅拌均匀。将拌好的土壤分装入的一次性塑料杯中，用清水调节土壤含水量约为20％。将塑料杯放置在模拟自然环境的20℃恒温光照培养箱内，白天保持光照度40，白天时间为12h·d-1。挑选催芽后大小一致、发育良好的玉米种子，种入约1cm深的土层中，每杯种5粒，每组设置三个重复，每天采用称重法补水以保持土壤含水量。十天左右后，从恒温光照培养箱中取出，观察比较玉米植株的生长情况，并测量玉米植株的根长，茎长和植株净重等指标，结果见表1及图1～6。
表1：菌株LZ35对玉米2，4-D残留药害的解除作用比较

Claims (6)

1.菌株LZ35在降解除草剂2，4-D中的应用；所述的菌株LZ35于2015年4月15日保藏于中国典型培养物保藏中心，菌种保藏号为CCTCC NO：M 2015235。
2.菌株LZ35在制备降解除草剂2，4-D的菌剂中的应用；所述的菌株LZ35于2015年4月15日保藏于中国典型培养物保藏中心，菌种保藏号为CCTCC NO：M 2015235。
3.一种用菌株LZ35生产的降解菌剂；所述的菌株LZ35于2015年4月15日保藏于中国典型培养物保藏中心，菌种保藏号为CCTCC NO：M 2015235。
4.根据权利要求3所述的降解菌剂，其特征在于所述的降解菌剂是通过以下方法生产而成：
1)将所述的菌株LZ35试管种接种于肉汤培养基摇瓶中，振荡培养至对数期；
2)将上述培养好的菌种按10％的接种量接种入种子罐，培养至对数生长期，种子罐所用的培养基配方为：葡萄糖0.8％，(NH4)2SO4 1％，K2HPO4 0.2％，MgSO4 0.05％，NaCl0.01％，CaCO3 0.3％，酵母膏0.02％，pH值7.2-7.5；
3)将种子液按10％的接种量接入生产罐培养，生产罐所用培养基与种子罐培养基相同；
4)发酵完成后培养液出罐直接用塑料包装桶或包装瓶分装成液体制剂或采用泥炭吸附用包装袋分装成固体菌剂制剂；
其中，在种子罐和生产罐的培养过程中无菌空气的通气量为1∶0.6-1.2，搅拌速度为180-240转/分，培养温度为30-35℃，全流程培养时间为36-48小时，发酵结束后菌体数量达到10亿个/ml以上。
5.权利要求4所述的菌剂在降解除草剂2，4-D中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于权利要求4所述的菌剂在降解土壤中残留的除草剂2，4-D中的应用。
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Genetic and Phenotypic Diversity of 2,4-Dichlorophenoxyacetic Acid (2,4-D)-Degrading Bacteria Isolated from 2,4-D-Treated Field Soils;J. 0. KAt et al;《APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY》;19941231;第60卷(第4期);全文 *
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The Completely Sequenced Plasmid pEST4011 Contains a Novel IncP1 Backbone and a Catabolic Transposon Harboring tfd Genes for 2,4-Dichlorophenoxyacetic Acid Degradation;Eve Vedler et al.;《JOURNAL OF BACTERIOLOGY》;20041231;摘要 *

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