CN111592998B - 一种苯氧乙酸类除草剂二甲四氯的降解菌株及其生产的菌剂 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种苯氧乙酸类除草剂二甲四氯的降解菌株及其生产的菌剂，所用菌株为革兰氏染色反应阴性菌株DCP‑6d，经鉴定为Pigmentiphaga sp.。2019年12月23日寄存于中国典型培养物保藏中心,菌种保藏号为CCTCC M 20191085。本发明所述的苯氧乙酸类除草剂MCPA的降解菌株DCP‑6d可应用于降解MCPA和2,4‑二氯苯氧乙酸(2,4‑D)，优先应用于降解土壤中的MCPA。降解菌剂产品直接施用可使土壤中MCPA的残留量降低90％以上，解决了土壤中MCPA的污染问题。

Description

一种苯氧乙酸类除草剂二甲四氯的降解菌株及其生产的菌剂

技术领域

本发明属于生物高技术领域，涉及一种苯氧乙酸类除草剂二甲四氯的降解菌株及其生产的菌剂，其主要是利用微生物高效去除环境中苯氧乙酸类除草剂MCPA和2,4-二氯苯氧乙酸 (2,4-D)的污染，适用于土壤、水体污染的微生物强化修复。

技术背景

化学农药的使用大大地促进了现代农业的发展，为农业生产挽回了大量因病虫草害等原因造成的损失，并极大地提高了农业生产的劳动效率和机械化程度，在农业生产的现代化进程中起了不可估量的作用。但同时农药都是一些有毒有害化学物质，它们进入生态环境后，不仅杀死了对人类有害的生物，同时也对生态系统造成了严重的危害。有机氯农药是一类典型的化学农药，同时还是20世纪80年代前应用的最主要和最有效的化学农药品种之一。由于其具有价格低廉，高效广谱等特点，在世界范围内得到了广泛应用。而苯氧乙酸类有机氯农药更是以其成本低，速度快等优势被大规模生产和使用。

二甲四氯(Dimethyltetrachloro,MCPA)为苯氧乙酸类选择性内吸传导激素型除草剂，对植物有强烈的生理活性，在低浓度时对作物生长有刺激作用，能够防治落花、落果，形成无籽果实，促进果实成熟，促进插枝生根，高浓度时为抑制生长作用，且高浓度使用对果树、棉花、大豆、瓜菜威胁极大，会造成植物畸形式，甚至死亡。MCPA在环境中降解缓慢，水溶性较大，且吸附性强，所以极易在环境中残留。因此，其生态毒性问题受到了广泛关注。此外，由于除草剂MCPA的大量使用，其残留导致的下茬作物药害问题也日益突出。

微生物是环境中残留农药降解的主力军，大量研究表明利用微生物来降解消除土壤中的除草剂残留，从而解除对下茬作物药害，保障粮食安全，保护生态环境是可行的。同时，微生物的降解作用是一种经济的、安全的、有效的和无二次污染的方法，具有广阔的应用前景。

发明内容

本发明针对环境修复的实际问题与重要需求，提供一株高效降解苯氧乙酸类除草剂的菌株。

本发明的另一个目的是开发研制出一种新型的苯氧乙酸类除草剂MCPA污染修复菌剂，使用本菌剂可以使土壤和水体中MCPA和2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)的残留量降低90％以上，且生产成本较低。

下面为本发明的主要内容：

本发明提供一株高效降解苯氧乙酸类除草剂MCPA的菌株。该菌株为革兰氏染色反应阴性菌株DCP-6d，2019年12月23日保藏于中国典型培养物保藏中心，菌种保藏号为CCTCCNO：M20191085,经鉴定为Pigmentiphaga sp.(图2)。菌株DCP-6d的形态学特征为：LB 平板上生长时菌落呈黄白色，圆形，小而凸起，表面湿润，边缘整齐，不透明；透射电子显微镜下菌株DCP-6d呈杆状(1.0μm×2.3μm)，无鞭毛(图1)。菌株DCP-6d的生理生化特征为：需氧，不运动，革兰氏染色呈阴性；吲哚反应为阴性，不能水解淀粉，能氧化葡萄糖产酸，过氧化氢酶和氧化酶阳性，使石蕊牛乳凝固；对链霉素有耐受性。菌株DCP-6d能以 MCPA为唯一碳源和能源生长，在实验室摇瓶培养条件下降解率达99％以上。该菌株可以用发酵工业通用发酵设备进行生产。

本发明所述的降解菌株DCP-6d在降解苯氧乙酸类除草剂中的应用；所述的苯氧乙酸类除草剂选自MCPA和2,4-D中的任意一种或多种；优选在降解MCPA中的应用。

本发明所述的降解菌株DCP-6d在制备苯氧乙酸类除草剂降解菌剂中的应用；所述的苯氧乙酸类除草剂选自MCPA和2,4-D中的任意一种或多种；优选在制备降解MCPA的菌剂中的应用。

一种用所述的苯氧乙酸类除草剂降解菌株生产的苯氧乙酸类除草剂降解菌剂。

使用上述MCPA降解菌株生产菌剂的工艺为：斜面种－摇瓶种－种子罐－生产罐－产品 (包装剂型为液体菌剂或固体吸附菌剂)。

本发明的详细实施步骤为：

1)将MCPA降解菌株DCP-6d的试管种接种于LB培养基摇瓶中，振荡培养至对数期；

2)将上述培养好的菌液按10％的接种量接种入种子罐，培养至对数生长期，种子罐所用的培养基配方为：葡萄糖8g L^-1，酵母膏5g L^-1，K₂HPO₄ 1g L^-1，NaCl 5g L^-1，CaCO₃ 2gL^-1，MgSO₄ 0.2g L^-1，大豆油0.1％(v/v)，pH值7.2-7.5；

3)将种子液按10％的接种量接入生产罐培养，生产罐所用培养基与种子罐培养基相同；

4)在种子罐和生产罐的培养过程中无菌空气的通气量为1:0.6-1.2，搅拌速度为180-240 rpm，培养温度为30℃，全流程培养时间为96-108小时,发酵结束后菌体数量达到10亿个/mL以上,发酵液出罐直接用塑料包装桶或包装瓶分装成液体剂型或采用泥炭吸附用包装袋分装成固体菌剂剂型。

本发明所述的菌剂在降解苯氧乙酸类除草剂中的应用所述的苯氧乙酸类除草剂选自 MCPA和2,4-D中的任意一种或多种，优选MCPA，进一步优选在降解土壤中MCPA的应用。

有益效果

本发明提供一株能够高效、快速降解MCPA的细菌DCP-6d。降解菌株DCP-6d具有较广的降解谱，可降解苯氧乙酸类除草剂MCPA和2,4-D。降解菌株DCP-6d具有较高的降解效率，可在72h内完全降解30mg L^-1的MCPA和2,4-D。具有广泛的应用潜力和价值。使用该细菌生产的降解菌剂具有生产使用成本低，使用方便，修复效果好的优点，适合在全国受苯氧乙酸类除草剂污染的化工园区、农业生产区、粮油蔬菜生产出口基地或有绿色食品商标标志的地方大面积推广使用。本发明对于治理苯氧乙酸类除草剂污染，保护生态环境，防治地下水污染，保护人民的身体健康等方面具有重要的意义。

本发明成功地解决了工农业生产活动中造成的苯氧乙酸类除草剂MCPA和2,4-D的污染问题，从而保护生态环境，维护人类健康。

附图说明

图1菌株DCP-6d在LB平板上的菌落形态和电镜照片

图2菌株DCP-6d的16S rRNA基因系统发育分析

图3菌株DCP-6d对MCPA的生长和降解曲线

图4温度对菌株DCP-6d降解MCPA的影响

图5 pH对菌株DCP-6d降解MCPA的影响

图6接种量对菌株DCP-6d降解MCPA的影响

图7菌株DCP-6d的底物谱

生物材料保藏信息

DCP-6d，分类命名为Pigmentiphaga sp.DCP-6d，保藏于中国典型培养物保藏中心，菌种保藏号为CCTCC NO：M20191085，保藏日期为2019年12月23日，保藏地址为湖北省武汉市，洪山区八一路，武汉大学中国典型培养物保藏中心。

具体实施方式

实施例1菌株的分离与鉴定

本发明提供一种能高效降解MCPA的菌株及其生产的菌剂，所用菌株为革兰氏染色阴性菌DCP-6d，分离自江苏南京某农药厂厂区的土壤中。菌株具体的分离筛选方法为：

取10.0g污染土样加入到100mL含有30mg L^-1MCPA的无机盐(以下简称MM)培养基，30℃、150rpm摇床培养7d，以15％接种量(v/v)转接至新鲜的经同样处理的培养基中，连续富集培养四次。紫外分光光度计检测第五代富集液的降解情况。将有效果的第五代富集液在含有30mg L^-1MCPA的MM固体培养基上稀释涂布，30℃培养5d。挑取平板上的单菌落于3mL液体LB试管培养基中，然后保存并转接至20mL含有30mg L^-1MCPA的MM培养基中，30℃培养5d。用等体积的二氯甲烷萃取，紫外分光光度计检测效果，从而获得MCPA 降解菌株。

2019年12月23日寄存于中国典型培养物保藏中心，菌种保藏号为CCTCC NO：M20191085，经鉴定属于Pigmentiphaga sp.。菌株DCP-6d的形态学特征为：LB平板上生长时菌落呈黄白色，圆形，小而凸起，表面湿润，边缘整齐，不透明；透射电子显微镜下菌株 DCP-6d呈杆状(1.0μm×2.3μm)，无鞭毛(图1)。菌株DCP-6d的生理生化特征为：需氧，不运动，革兰氏染色呈阴性；吲哚反应为阴性，不能水解淀粉，能氧化葡萄糖产酸，过氧化氢酶和氧化酶阳性，使石蕊牛乳凝固；对链霉素有耐受性。将菌株DCP-6d的16S rRNA基因序列(SEQ IDNO.1)在数据库EzBioCloud中比对分析，结果显示菌株DCP-6d与Pigmentiphaga 属亲缘关系最近，其中与Pigmentiphaga kullae K24^T相似性达99.72％，与Pigmentiphagadaeguensis K110^T相似性达99.66％。结合菌落形态特征、生理生化特性以及16S rRNA基因系统发育分析，菌株DCP-6d初步鉴定为Pigmentiphaga属(图2)。

实施例2实验室降解实验

2.1菌株DCP-6d对MCPA的生长利用和降解

高效液相色谱法检测DCP-6d：取3mL样品，12,000rpm离心5min，小心吸取上清，加入25％的盐酸，将pH调至3.0左右。然后，用等体积的二氯甲烷萃取，无水硫酸钠除水后取2mL二氯甲烷相吹干，然后0.5mL甲醇复溶，用孔径为0.22μm有机相滤膜过滤后用HPLC 检测。检测条件：高效液相色谱仪为岛津RID-10A；色谱柱为C18反相柱，规格250mm×4.6 mm；柱温40℃；流动相为甲醇:水:乙酸(80:20:0.5,V:V:V)，流速为1.0mL min L^-1；检测波长为220nm和235nm。

将菌株DCP-6d按终浓度0.2(OD₆₀₀值)的接种量接至含有30mg L^-1MCPA的100mL MM中，30℃、150rpm摇床培养，每隔6h取样4mL，取至72h。其中1mL用于检测菌体的浓度(OD₆₀₀值)，绘制菌株生长曲线；另外3mL用于HPLC检测MCPA的浓度，绘制其降解曲线。结果如图3所示，菌株DCP-6d可在72h内完全降解30mg L^-1的MCPA，并能以其为唯一碳源生长，菌体浓度(OD₆₀₀值)由初的0.2增至0.35。

2.2种子液制备

挑取菌株DCP-6d单菌落至100mL添加有30mg L^-1MCPA的LB液体培养基中，30℃，150rpm摇床培养至菌体生长对数期，6,000rpm离心5min收集菌体，用灭菌的MM培养基洗涤菌体2次，再用10mL灭菌的MM培养基重悬，此即为菌体种子液。

2.3环境因素对菌株DCP-6d降解MCPA的影响

2.3.1温度对菌株DCP-6d降解MCPA的影响

在装有20mL MM液体培养基的50mL锥形瓶中添加30mg L^-1的MCPA作为唯一碳源，接种种子液至初始菌体浓度为OD₆₀₀＝0.2，混合均匀后立即取3mL菌液，12,000rpm，离心5 min取上清，作为对照。然后分别置于不同温度(4℃、16℃、25℃、30℃、35℃、37℃和 45℃)的摇床中，150rpm培养48h后取样3mL离心，取上清，与对照上清液分别加入25％的盐酸，将pH调至3.0左右。然后，用等体积的二氯甲烷萃取，无水硫酸钠除水后取2mL 二氯甲烷相吹干，然后0.5mL甲醇复溶，用孔径为0.22μm有机相滤膜过滤后用HPLC检测，计算MCPA的降解率。每种处理设三个重复。结果如图4所示，菌株DCP-6d对MCPA的最适降解温度为30℃。

2.3.2 pH对菌株DCP-6d降解MCPA的影响

在装有20mL不同pH(4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0和10.0)的MM液体培养基50mL 锥形瓶中添加30mg L^-1的MCPA为唯一碳源，接种种子液至初始菌体浓度为OD₆₀₀＝0.2，混合均匀后立即取3mL菌液，12,000rpm，离心5min取上清，作为对照。30℃、150rpm摇床培养48h后取样3mL离心，取上清，与对照上清液分别加入25％的盐酸，将pH调至3.0 左右。然后，用等体积的二氯甲烷萃取，无水硫酸钠除水后取2mL二氯甲烷相吹干，然后 0.5mL甲醇复溶，用孔径为0.22μm有机相滤膜过滤后用HPLC检测，计算MCPA的降解率。每种处理设三个重复。结果如图5所示，菌株DCP-6d在pH 7.0时对MCPA的降解效果最好。

2.3.3接种量对菌株DCP-6d降解MCPA的影响

按1％、3％、5％、8％、10％与12％的接种量将种子液分别接入含30mg L^-1MCPA的20mL MM培养基中，混合均匀后立即取3mL菌液，12,000rpm，离心5min取上清，作为对照。30℃、150rpm摇床培养48h后取样3mL离心，取上清，与对照上清液分别加入25％的盐酸，将pH调至3.0左右。然后，用等体积的二氯甲烷萃取，无水硫酸钠除水后取2mL 二氯甲烷相吹干，然后0.5mL甲醇复溶，用孔径为0.22μm有机相滤膜过滤后用HPLC检测，计算MCPA的降解率。由图6所示，接种量的大小对MCPA的降解效率有直接的关系，接种量越大，MCPA的降解效率就越高。

2.4菌株DCP-6d的降解底物谱

菌株DCP-6d的种子液分别接种到30mg L^-1不同苯氧羧酸类除草剂(MCPA、2,4-D、2,4- 滴丙酸、2-甲基-4-氯苯氧丙酸、2,4-滴丁酯和2,4,5-三氯苯氧乙酸)的20mL MM液体培养基中，30℃、150rpm摇床振荡培养72h后取培养液，加入25％的盐酸，将pH调至3.0左右。然后，用等体积的二氯甲烷萃取，无水硫酸钠除水后利用紫外分光光度计检测不同化合物的降解情况。结果显示菌株DCP-6d可以降解MCPA和2,4-D(图7)，但不能降解2,4-滴丙酸、 2-甲基-4-氯苯氧丙酸、2,4-滴丁酯和2,4,5-三氯苯氧乙酸。

实施例3菌剂制备

将本发明的卤代苯酚降解菌株DCP-6d的原种在培养皿上活化，并接种于试管斜面上备用。试管种接种于含200mLLB培养基(LB培养基配方：蛋白胨10g L^-1，酵母粉5g L^-1，氯化钠5g L^-1，pH 7.4)的1,000mL摇瓶中，恒温振荡培养至对数期，准备接种一级种子罐。一级种子罐50L，投料量40L，培养基配方为：葡萄糖8g L^-1，酵母膏5g L^-1，K₂HPO₄ 1g L^-1，NaCl 5gL^-1，CaCO₃ 2g L^-1，MgSO₄ 0.2g L^-1，大豆油0.1％(v/v)，pH值7.5；投料完毕后高压蒸汽灭菌，冷却至30℃后，将上述培养好的摇瓶菌种按10％的接种量接种入50 L一级种子罐，培养至对数生长期，搅拌速度为220rpm，无菌空气通入量为1:1.0。将到达对数期的种子液按10％的接种量接入二级种子罐。二级种子罐500L，投料量400L，培养基配方和培养条件与一级种子罐一致。将到达对数期的种子液按10％的接种量接入生产罐培养，生产罐所用培养基成分与种子罐培养基相同。生产罐容量5吨，投料量4.5吨。投料后的生产罐高压蒸汽灭菌，灭菌后冷却至30℃，通无菌空气保持无菌状态备用。接种后的生产罐温度控制在30℃，生产罐的培养过程中无菌空气的通气量为1:1.0，搅拌速度为220 rpm，整个工艺流程培养时间为96小时。发酵结束后菌体数量达到10亿个/mL以上。

发酵完成后培养液出罐直接用塑料包装桶或包装瓶分装成液体剂型或采用泥炭吸附用包装袋分装成固体菌剂剂型。

实施例4土壤降解实验

采取菜园土作为供试土样。将土样过2mm筛，取一定量的MCPA和2,4-D粉剂溶于100mL甲醇中，然后浸泡硅藻土，使除草剂被完全吸附。浸泡后的硅藻土置于通风橱中吹干，将其分别拌入土壤中，使土壤中MCPA和2,4-D的浓度均约为50mg kg^-1。取土样500g，按10％的接种量接入DCP-6d种子液，于30℃恒温培养箱中培养，以接入等量无菌MM液体的土样作为对照，土壤的持水量保持在60％。7d后取样检测，每种处理每次取3个样品，每个样重 20g。样品用等体积的甲醇震荡萃取2次，合并两次的甲醇，氮气吹干后，使用1mL甲醇重溶样品，然后HPLC检MCPA和2,4-D的残留量。测定结果如表1所示，7d后检测发现，菌株DCP-6d对MCPA和2,4-D的降解率分别达到93.4％和91.6％。以上结果说明，菌株DCP-6d 在施入土壤中后，没有出现不降解或降解效率急剧下降的现象，其降解性能稳定，这就为菌株DCP-6d对MCPA和2,4-D污染土壤的修复提供了科学依据。

表1菌株DCP-6d在土壤中对两种除草剂的降解

序列表

<110> 南京农业大学

<120> 一种苯氧乙酸类除草剂二甲四氯的降解菌株及其生产的菌剂

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1492

<212> DNA

<213> Pigmentiphaga 属(Pigmentiphaga sp.)

<400> 1

agagtttgat cctggctcag attgaacgct agcggcatgc cttacacatg caagtcgaac 60

ggcagcgcgg acttcggtct ggcggcgagt ggcgaacggg tgagtaatgc atcggaacgt 120

gcccagtagc gggggataac tacgcgaaag cgtggctaat accgcatacg ccctacgggg 180

gaaagggggg gatcgcaaga cctctcacta ttggagcggc cgatgtcgga ttagctagtt 240

ggtggggtaa aggcctacca aggcgacgat ccgtagctgg tttgagagga cgaccagcca 300

cactgggact gagacacggc ccagactcct acgggaggca gcagtgggga attttggaca 360

atgggggcaa ccctgatcca gccatgccgc gtgtgcgaag aaggccttcg ggttgtaaag 420

cacttttggc aggaaagaaa cggcgccgga taatacctgg cgtaactgac ggtacctgca 480

gaataagcac cggctaacta cgtgccagca gccgcggtaa tacgtagggt gcaagcgtta 540

atcggaatta ctgggcgtaa agcgtgcgca ggcggttcgg aaagaaagat gtgaaatccc 600

agggctcaac cttggaactg catttttaac tcccgaacta gagtgtgtca gaggggggtg 660

gaattccacg tgtagcagtg aaatgcgtag atatgtggag gaacaccgat ggcgaaggca 720

gccccctggg ataacactga cgctcatgca cgaaagcgtg gggagcaaac aggattagat 780

accctggtag tccacgccct aaacgatgtc aactagctgt tgggttcttc ggagcttggt 840

agcgcagcta acgcgtgaag ttgaccgcct ggggagtacg gtcgcaagat taaaactcaa 900

aggaattgac ggggacccgc acaagcggtg gatgatgtgg attaattcga tgcaacgcga 960

aaaaccttac ctacccttga catgtctgga atcctgaaga gatttaggag tgctcgaaag 1020

agaaccggaa cacaggtgct gcatggccgt cgtcagctcg tgtcgtgaga tgttgggtta 1080

agtcccgcaa cgagcgcaac ccttgtcatt agttgctacg aaagggcact ctaatgagac 1140

tgccggtgac aaaccggagg aaggtgggga tgacgtcagg tcctcatggc ccttatgggt 1200

agggcttcac acgtcataca atggtcggga cagagggcag ccaacccgcg agggggagcc 1260

aatcccagaa acccgatcgt agtccggatt gcagtctgca actcgactgc atgaagtcgg 1320

aatcgctagt aatcgcggat cagcatgtcg cggtgaatac gttcccgggt cttgtacaca 1380

ccgcccgtca caccatggga gtgggttcta ccagaagtag gtagcctaac cgtaaggagg 1440

gcgcttacca cggtagggtt catgactggg gtgaagtcgt aacaaggtaa cc 1492

Claims (10)

1.一株苯氧乙酸类除草剂二甲四氯MCPA降解菌株DCP-6d，其特征在于分类命名为Pigmentiphaga sp.，2019年12月23日保存于中国典型培养物保藏中心，菌种保藏号为CCTCC NO：M20191085。

2.权利要求1所述的降解菌株DCP-6d在降解苯氧乙酸类除草剂中的应用，所述的苯氧乙酸类除草剂选自MCPA和2,4-D中的任意一种或两种。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于权利要求1所述的降解菌株DCP-6d在降解MCPA中的应用。

4.权利要求1所述的降解菌株DCP-6d在制备苯氧乙酸类除草剂降解菌剂中的应用，所述的苯氧乙酸类除草剂选自MCPA和2,4-D中的任意一种或两种。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于权利要求1所述的降解菌株DCP-6d在制备降解MCPA的菌剂中的应用。

6.一种用权利要求1所述的苯氧乙酸类除草剂二甲四氯MCPA降解菌株DCP-6d生产的苯氧乙酸类除草剂降解菌剂。

7.权利要求6所述的苯氧乙酸类除草剂降解菌剂的制备方法，其特征在于包含以下步骤：

1) 将试管种接种于LB培养基摇瓶中，振荡培养至对数期；

2) 将上述培养好的菌种按10％的接种量接种入种子罐，培养至对数生长期，种子罐所用的培养基配方为：葡萄糖 8 g· L^-1，酵母膏5 g· L^-1，K₂HPO₄1 g·L^-1，NaCl 5 g·L^-1，CaCO₃ 2 g·L^-1，MgSO₄ 0.2 g·L^-1，大豆油0.1% v/v，pH值7.2-7.5；

3) 将种子液按10％的接种量接入生产罐培养，生产罐所用培养基与种子罐培养基相同；

4) 在种子罐和生产罐的培养过程中无菌空气的通气量为1：0.6-1.2，搅拌速度为180-240 rpm，培养温度为30℃，全流程培养时间为96-108小时, 发酵结束后菌体数量达到10亿个/mL以上, 发酵完成后培养液出罐直接用塑料包装桶或包装瓶分装成液体剂型或采用泥炭吸附用包装袋分装成固体菌剂剂型。

8.权利要求6所述的菌剂在降解苯氧乙酸类除草剂中的应用，所述的苯氧乙酸类除草剂选自MCPA和2,4-D中的任意一种或两种。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于所述的苯氧乙酸类除草剂为MCPA。

10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于权利要求6所述的菌剂在降解土壤中MCPA的应用。

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