CN114990019B

CN114990019B - 一株有机污染降解菌株a7及其生产的菌剂和应用

Info

Publication number: CN114990019B
Application number: CN202210683433.6A
Authority: CN
Inventors: 孙丽娜; 高新华; 陈伟; 黄开华; 邱文
Original assignee: Shanghai Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Shanghai Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2022-06-16
Filing date: 2022-06-16
Publication date: 2023-07-18
Anticipated expiration: 2042-06-16
Also published as: CN114990019A

Abstract

本发明公开了一株有机污染降解菌株A7及其生产的菌剂和应用，该有机污染广谱降解菌株A7经鉴定为假单胞菌(Pseudomonas sp.)，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏时间为2020年12月18日，保藏编号为CCTCC NO:M 2020914。本发明经分离筛选获得降解菌株A7可以快速有效地降解高浓度的灭草灵、联苯醇及苯系物等多种有机污染；能将无机盐培养基中的灭草灵、联苯醇及苯系物残留都降解90％以上，同时该菌株制备的降解菌剂能在短时间内降解土壤或水体中高浓度的灭草灵、联苯醇及苯系物残留达88％以上，解决了有机污染残留对土壤水体环境、农作物和人体健康的危害问题。

Description

一株有机污染降解菌株A7及其生产的菌剂和应用

技术领域

本发明涉及微生物的有机污染处理，具体涉及一株有机污染广谱降解菌株A7及其生产的菌剂和应用。

背景技术

随着人类社会生产和经济活动规模的不断扩张，有机污染普遍存在于土壤、水体等生态系统中，不仅会造成环境污染，而且会通过食物链富集，最终进入人体，严重危害了人类的健康，近年来越来越多的有机污染事件发生，造成了极其严重的不良后果。因此，需要进一步研究有机物污染修复问题。

灭草灵的化学名称为N-3，4-二氯苯基氨基甲酸甲酯，是一种氨基甲酸酯类选择性除草剂，兼具内吸及触杀作用，主要用于水稻、玉米、小麦和大豆等作物田，防除一年生禾本科杂草及某些阔叶杂草，如稗草、马唐和看麦娘等。灭草灵在使用的过程中，对环境造成污染，且不容易被环境所分解。

联苯菊酯又名天王星、虫螨灵，联苯菊酯是一种新型的拟除虫菊酯类杀虫剂，对自然界中的害虫有一定的触杀和胃毒作用。联苯醇是联苯菊酯的中间代谢产物，同样具有杀死多种害虫的功效。自从拟除虫菊酯进入市场以来，其作用效果非常明显，在生活中广泛应用，受到人们依赖。但是在这类农药试剂的生产和使用过程中，造成了环境中的农药残留污染，在一定程度上危害着人类的健康和发展。联苯菊酯是第三代合成拟除虫菊酯，已被美国环境保护署列为二级中等毒性。其对水生生物鱼、虾、蟹、贝等为剧毒，对哺乳动物具有神经毒性、心血管毒性和遗传毒性。由于联苯菊酯农药的大量使用，在农产品和环境中检出率较高。

苯系物中三苯，是指工业上的苯、甲苯、二甲苯，可作为化工原料或溶剂，主要应用于染料工业、农药生产、香料制作、造漆、喷漆、制药、制鞋、家具制造等行业。在经济高速发展的今天，人们对大自然资源的索取量急剧增加，同时对环境造成的污染也越来越来严重。如何防治和减少对自然环境的污染已经成为国家和社会各界广泛关注的问题。

生物修复是利用生物特别是微生物的生命代谢活动将有机污染物转为无公害的无机物(二氧化碳和水)或其他无害的代谢产物。它被公认为具有安全、有效、低耗和环保等显著优点，已经成为研究环境修复的热点。生物修复过程中的微生物主要有3种类型：土著微生物、基因工程菌和外来微生物。已报道的能降解有机物的微生物包括细菌、放线菌、真菌、藻类等。细菌由于容易诱变和适应性强等特性而在生物修复中占据主导地位。

目前关于假单胞菌(Pseudomonas sp.)降解菌株已有一些报道到，但是这些降解菌株都是效果单一，一般能降解一种类型的有机物，缺乏广谱性。如苯系物降解菌Pseudomonas putida SW-3能降解苯、甲苯和苯乙烯，但不能降解灭草灵和联苯醇。目前有关灭草灵的降解菌，还没有报道。

发明内容

发明目的：针对现有技术存在的问题，针对现有技术存在的问题，本发明提供一株有机污染广谱降解菌株A7，该菌株对于灭草灵、联苯醇、苯、甲苯、二甲苯残留都可以进行有效地降解。

本发明的另一目的是提供灭草灵、联苯醇及苯系物降解菌株生产的降解菌剂及其应用；该菌株制备的降解菌剂可在短时间内降解土壤或水体环境中残留的灭草灵、联苯醇、苯、甲苯、二甲苯。本发明的降解菌剂可以用发酵工业通用发酵设备进行生产，具有生产成本低，使用方便，去除效果好的优点。

技术方案：为了实现上述目的，本发明所述的一株灭草灵、联苯醇及苯系物降解菌株A7，经鉴定为假单胞菌(Pseudomonas sp.)，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏时间为2020年12月18日，保藏编号为CCTCC NO:M 2020914。

该菌株是发明人从河北邯郸郊区某农药厂废水生化处理池的活性污泥中分离得到。降解菌株A7主要生物学特性为：在LB固体平板上菌落形态为整体圆形，表面隆起、边缘整齐，革兰氏染色阴性，无鞭毛，短杆状(0.3–0.5μm×1.2–1.5μm)。

本发明所述的菌株A7在降解灭草灵、联苯醇及苯系物残留中的应用。

进一步地，所述菌株A7可以降解土壤或水体环境中灭草灵、联苯醇及苯系物残留。

本发明所述的菌株A7生产的降解菌剂。

本发明所述的降解菌剂的制备方法，包括如下步骤：

(1)将降解菌株A7培养到对数期的试管液按发酵培养基体积的0.5-1％接种于发酵培养基中，振荡培养至对数期，制得发酵菌种；

(2)将上述制得发酵菌种按种子罐的培养基体积的1-10％接种于种子罐的培养基中，培养至对数生长期，制得种子液；

(3)将种子液按生产罐的培养基体积的1-10％接种于生产罐的培养基中培养发酵，发酵完成后的培养液即为即为降解菌剂。

其中，步骤(2)和步骤(3)所述培养过程中每分钟无菌空气的通气量为1:(1-0.8)vvm，搅拌速度为160-200rpm，培养温度为28-32℃。

其中，步骤(3)所述培养发酵时间为36-48小时。

其中，发酵培养基、种子罐的培养基、生产罐的培养基配方相同，均为葡萄糖0.1wt％、NaCl1.0wt％、蛋白胨0.5wt％、酵母膏0.25wt％，溶剂为蒸馏水，pH7.2-7.5。

本发明所述的降解菌剂在降解灭草灵、联苯醇及苯系物残留中的应用。

进一步地，所述降解菌剂可以降解土壤或水体环境中灭草灵、联苯醇及苯系物残留。

有益效果：本发明具有如下优点：

本发明经分离筛选获得降解菌株A7可以有效地降解灭草灵、联苯醇及苯系物残留；能快速将无机盐培养基中的高浓度的灭草灵、联苯醇及苯系物降解90％以上，同时该菌株制备的降解菌剂能在短时间内降解土壤或水体中高浓度的灭草灵、联苯醇及苯系物残留达88％以上，解决残留灭草灵、联苯醇及苯系物对土壤水体环境、农作物和人体健康的危害问题。

利用该菌株制备的降解菌剂可以用发酵工业通用发酵设备进行生产，具有生产成本低，使用方便，去除效果好的优点，适用于灭草灵、联苯醇及苯系物残留污染的土壤与水体修复；本发明对于保护生态环境，降低农药残留对农作物药害，保护人体的身体健康具有重要的意义。

附图说明

图1为本发明的菌株A7的菌落照片；

图2为本发明的菌株A7的电镜图；

图3为本发明的菌株A7降解灭草灵的HPLC分析图谱(A：CK；B：12h处理)；

图4为本发明的菌株A7降解联苯醇的HPLC分析图谱(A：CK；B：12h处理)；

图5为本发明的菌株A7降解二甲苯的HPLC分析图谱(A：CK；B：12h处理)。

具体实施方式

以下结合附图和实施例对本发明作进一步说明。

本发明中的原料和试剂如无特殊说明，均为商业化市售。

实施例1

菌株A7的分离和鉴定：

用来富集降解菌株的富集基质取自河北邯郸郊区某农药厂废水生化处理池的活性污泥，取15g污泥样品置于100mL添加含有100mg/L灭草灵、100mg/L联苯醇和100mg/L二甲苯的无机盐液体培养基(NH₄NO₃ 1.0g，K₂HPO₄ 1.5g，KH₂PO₄ 0.5g，MgSO₄ 0.2g，NaCl 1.0g，水1000mL，pH 7.0)中，30℃、150r/min培养7天，以体积比5％的接种量转接到相同的添加50mg/L灭草灵、联苯醇和二甲苯的无机盐液体培养基，连续转接4次。通过紫外分光光度计和液相色谱法测定富集液灭草灵、联苯醇及二甲苯降解效果，获得有降解效果的富集液。取0.5mL有效果的富集液，10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6梯度稀释，每个梯度的稀释富集液取100μL涂布在含有100mg/L灭草灵的无机盐固体培养基平板上，30℃培养7d。挑取平板上长出的单菌落接种于液体LB培养基(蛋白胨10g，酵母膏5g，NaCl 5g，水1000mL，pH 7.0)试管中，30℃、180r/min培养2天，取1mL LB培养液，5000rpm离心5min，无菌水洗去LB培养基后，取1mL无菌水重悬菌体，分别接种至加有含有100mg/L灭草灵、联苯醇和二甲苯的无机盐液体培养基中，30℃、180r/min培养3d，通过紫外分光光度计和高效液相色谱分别检测三种有机物降解效果。对三种有机物均有降解效果的菌株即为降解菌株。

紫外分光光度计降解效果的验证方法：采用UV-1700微量紫外分光光度计分别测定灭草灵、联苯醇和二甲苯的质量浓度。往待测降解菌液中加入等量体积的二氯甲烷，剧烈振荡5-10min，然后静置直到水相和有机相完全分层，吸取下层水相，保留有机相，下层水相再一次用等体积的二氯甲烷萃取，两次得到的有机相经无水硫酸钠去除残留的水分后，于紫外-可见分光光度计上在波长200-350nm范围内进行扫描。通过灭草灵、联苯醇和二甲苯在200nm-350nm处的特征吸收峰峰值的高低来分别判断降解液中物质的高低。

高效液相色谱降解效果的验证方法：在培养液中加入等体积的二氯甲烷进行全量提取，剧烈振荡后静置分层，然后取1mL下层二氯甲烷挥发完全后，加入1mL乙腈溶解(色谱纯)，用滤膜(孔径0.22μm)过滤。采用紫外和高效液相色谱分别测定提取液中灭草灵、联苯醇、二甲苯的含量，液相色谱条件：流动相乙腈：水(60：40，V/V)，Zorbax C218 ODS Spherex反相柱(5μm，4.6mm×250mm，Agilent，USA)，柱温为40℃，PDA检测器，测定波长240nm，进样量5μL，流速为1.0mL·min^-1。外标法按峰面积定量。

从富集液中，通过验证得到1株高效广谱降解菌株，可以降解灭草灵、联苯醇及苯系物，命名为A7。该菌株12h对200mg/L的灭草灵、联苯醇和苯系物降解率都能达到90％以上。如图1所示，菌落A7在LB固体平板上菌落形态为整体圆形，表面隆起、边缘整齐，革兰氏染色阴性。菌株A7电镜图如图2所示，无鞭毛，短杆状(0.3–0.5μm×1.2–1.5μm)。

以菌株A7的基因组DNA为模板，用细菌16S rRNA基因序列通用引物进行PCR扩增，得到长度为1448bp的16S rDNA基因序列，如SEQ ID No：1所示。在EzTaxon数据库(www.ezbiocloud.net)中进行Blast，结果表明菌株A7与假单胞菌(Pseudomonas sp.)菌株的同源性最近，与菌株Pseudomonas nitroreducens CW7和Pseudomonas aeruginosa FQE2同源性都达到98％以上，结合形态和生理生化特征，将菌株A7初步鉴定为假单胞菌(Pseudomonas sp.)，命名为假单胞菌A7(Pseudomonas sp.A7)。将该菌株A7送交位于中国武汉，中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)保藏，保藏时间为2020年12月18日，保藏编号为CCTCC NO:M 2020914。

实施例2

在无机盐培养基中菌株A7对灭草灵残留的降解效果：

在无机盐液体培养基中降解菌株A7对灭草灵特性测定：挑取A7单菌落于50ml LB液体培养基中，30℃、180r/min振荡培养24h，获得新鲜菌液。将3ml培养好的新鲜菌液经6000r/min离心5min，弃去上清液，加入10ml无菌水重悬，为离心悬浮后的种子液。

在无机盐培养基中加入终浓度为200mg/L的灭草灵，按1％体积比的接种量接入菌株A7的种子液；同时在无机盐培养基中加入终浓度为200mg/L的灭草灵，按1％体积比的接种量接入灭活的菌株A7种子液作为对照，30℃恒温摇床中150rpm培养12h，采用实施例1中降解效果的验证方法通过高效液相色谱法检测菌株A7对灭草灵的降解情况，并计算降解率，如图3所示。菌株A7在12h内对灭草灵降解率可以达到90％以上。

实施例3

在无机盐培养基中菌株A7对联苯醇残留的降解效果：

在无机盐液体培养基中降解菌株A7对联苯醇特性测定：挑取A7单菌落于50ml LB液体培养基中，30℃、180r/min振荡培养24h，获得新鲜菌液。将3ml培养好的新鲜菌液经6000r/min离心5min，弃去上清液，加入10ml无菌水重悬，为离心悬浮后的种子液。

在无机盐培养基中加入终浓度为200mg/L的联苯醇，按1％体积比的接种量接入菌株A7的种子液；同时在无机盐培养基中加入终浓度为200mg/L的联苯醇，按1％体积比的接种量接入灭活的菌株A7种子液作为对照，30℃恒温摇床中150rpm培养12h，采用实施例1中降解效果的验证方法通过高效液相色谱法检测菌株A7对联苯醇的降解情况，并计算降解率，如图4所示。菌株A7在12h内对联苯醇降解率可以达到90％以上。

实施例4

在无机盐培养基中菌株A7对二甲苯残留的降解效果：

在无机盐液体培养基中降解菌株A7对二甲苯特性测定：挑取A7单菌落于50ml LB液体培养基中，30℃、180r/min振荡培养24h，获得新鲜菌液。将3ml培养好的新鲜菌液经6000r/min离心5min，弃去上清液，加入10ml无菌水重悬，为离心悬浮后的种子液。

在无机盐培养基中加入终浓度为200mg/L的二甲苯，按1％体积比的接种量接入菌株A7的种子液；同时在无机盐培养基中加入终浓度为200mg/L的二甲苯，按1％体积比的接种量接入灭活的菌株A7种子液作为对照，30℃恒温摇床中培养12h，采用实施例1中降解效果的验证方法通过高效液相色谱法检测菌株A7对二甲苯的降解情况，并计算降解率，如图5所示。菌株A7在12h内对二甲苯降解率可以达到90％以上。

实施例5

菌株A7的降解菌剂的制备

1)将实施例1分离筛选的降解菌株A7接种到含3mL的LB(蛋白胨10g，酵母膏5g，NaCl 5g，水1000mL，pH 7.0)试管中培养到对数期，将试管液按0.5％体积比的接种量接种于100mL发酵培养基中，28℃，180rpm振荡培养至对数期，制得发酵菌种；

2)将上述制得发酵菌种按5％(v/v，以培养基体积为基准)的接种量接种于装液量为70％(以发酵罐体积为基准，下同)的500升种子罐的培养基中培养(培养基已经121℃高压湿热灭菌，冷却)，培养至对数生长期，培养过程中每分钟无菌空气的通气量为1:0.8vvm(培养基与无菌空气体积比)，搅拌速度为180rpm，培养温度为28℃；制得种子液；

3)将种子液按5％(v/v，以培养基体积为基准)的接种量接入装液量为70％的5000升生产罐的培养基中培养发酵(生产罐培养基已经在1.1kg/cm²的压力下，121℃高压湿热灭菌，冷却)，培养发酵过程中每分钟无菌空气的通气量为1:1vvm(培养基与无菌空气体积比)，搅拌速度为180rpm，培养温度为28℃，培养时间为48小时，发酵完成后培养液出罐直接用塑料包装桶或包装瓶分装成液体剂型即为降解菌剂。

其中，发酵培养基、种子罐的培养基、生产罐的培养基配方相同，均为葡萄糖0.1wt％、NaCl1.0wt％、蛋白胨0.5wt％、酵母膏0.25wt％，溶剂为蒸馏水，pH7.2。

实施例6

菌株A7的降解菌剂的制备

1)将实施例1分离筛选的降解菌株A7接种到含3mL的LB(蛋白胨10g，酵母膏5g，NaCl 5g，水1000mL，pH 7.0)试管中培养到对数期，将试管液按1％体积比的接种量接种于100mL发酵培养基中，32℃，160rpm振荡培养至对数期，制得发酵菌种；

2)将上述制得发酵菌种按1％(v/v，以培养基体积为基准)的接种量接种于装液量为70％(以发酵罐体积为基准，下同)的500升种子罐的培养基中培养(培养基已经121℃高压湿热灭菌，冷却)，培养至对数生长期，培养过程中每分钟无菌空气的通气量为1:1vvm(培养基与无菌空气体积比)，搅拌速度为160rpm，培养温度为32℃；制得种子液；

3)将种子液按1％(v/v，以培养基体积为基准)的接种量接入装液量为70％的5000升生产罐的培养基中培养发酵(生产罐培养基已经在1.1kg/cm²的压力下，121℃高压湿热灭菌，冷却)，培养发酵过程中每分钟无菌空气的通气量为1:1vvm(培养基与无菌空气体积比)，搅拌速度为160rpm，培养温度为32℃，培养时间为36小时，发酵完成后培养液出罐直接用塑料包装桶或包装瓶分装成液体剂型即为降解菌剂。

实施例7

菌株A7降解菌剂对土壤中灭草灵、联苯醇及二甲苯的降解效果测定：

称取多份1000g菜园土作为供试土壤，风干过筛，每份分别加入灭草灵、联苯醇及二甲苯，使土壤中灭草灵、联苯醇及二甲苯浓度为200mg/kg，按重量比1％的接种量将实施例5制备的A7降解菌剂分别接入到上述土壤中混匀作为处理组1，设相应不加A7降解菌剂以及加入相同体积灭活A7降解菌剂的含相同浓度农药土壤为对照1组和2组，置于30℃培养箱中黑暗条件下恒温培养，期间土壤的持水量保持在60％，第3天取样分别测定灭草灵、联苯醇及二甲苯在土壤中的残留量，每组做平行实验3次，利用高效液相色谱测定残留量，计算多次平均降解率，结果见表1。

表1菌株A7降解菌剂对土壤中对灭草灵、联苯醇及二甲苯的降解效果

由表1可见，使用实施例5制备的菌株A7降解菌剂，土壤中灭草灵、联苯醇及二甲苯浓度为200mg/kg时，降解菌A7对其的降解率分别达到90.2％、88.4％和89.1％，并且对照中的灭草灵、联苯醇及二甲苯没有被降解。结果表明，A7降解菌剂可有效降解土壤中的灭草灵、联苯醇及二甲苯污染。同时采用相同方法检测土壤中其他类型的苯系物的降解情况，结果与本实施例类似。

实施例8

菌株A7降解菌剂对水体中灭草灵、联苯醇及二甲苯的降解效果测定：

取多份500mL养殖池塘废水，过滤后，每份分别加入灭草灵、联苯醇及二甲苯，调整浓度后使水体中灭草灵、联苯醇及二甲苯浓度分别达到为200mg/L，按重量比1％的接种量将实施例5制备的A7降解菌剂分别接入到上述水体中混匀作为处理组2，设相应不加A7降解菌剂以及加入相同体积灭活A7降解菌剂的水体为对照3组和4组，置于30℃培养箱中黑暗条件下恒温培养，第3天取样测定灭草灵、联苯醇及二甲苯在水体中的残留量，每组做平行实验3次，利用高效液相色谱测定残留量，计算多次平均降解率，结果见表2。

表2菌株A7降解菌剂对水体中对农药残留的降解效果

由表2可见，使用实施例5制备的菌株A7降解菌剂，水体中灭草灵、联苯醇及二甲苯浓度为200mg/kg时降解菌A7对其的降解率分别达到91.1％、88.9％和90.5％，并且对照中的灭草灵、联苯醇及二甲苯均没有被降解。结果表明，A7降解菌剂可有效降解水体中的灭草灵、联苯醇及二甲苯残留。同时采用相同方法检测水体中其他类型的苯系物的降解情况，结果与本实施例类似。

序列表

<110> 上海市农业科学院

<120> 一株有机污染降解菌株A7及其生产的菌剂和应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1448

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

aaacggatcg tctgatacta cgtggtaccg tcctccttgc ggttagacta gctacttctg 60

gagaacccac tcccatggtg tgacgggcgg tgtgtacaag gcccgggaac gtattcaccg 120

cgacatgctg attcgcgatt actagcgatt ccgacttcac gcagtcgagt tgcagactgc 180

gatccggact acgatcggtt ttatgggatt agctccacct cgcgggttgg cgaccctctg 240

taccgaccat tgtatgacgt gtgtagccct ggccgtaagg gccatgatga cttgacgtca 300

tccccacctt cctccggttt gtcaccggca gtctccttag agtgccctcc cgaggtgctg 360

gaagctaagg acaggggttg cgctcgttac tggacttacc tctccatctc acaactcaag 420

atgaccacgg ccatgctgcg cctgtgttct cattcccgaa cggaccctcc tctctctgct 480

tggttacgga catggggagg gcagggaagg ttcttctcgt tgcttctaat tcacctactt 540

gctcgaccgc gtgtgcgggc ccccgttcct tcgtttgagt ttcatgcttg cggacgcact 600

ccgcaggcgg cctacttatc gcgctgcctg cgccacgacc atctcaagga tcccctcggc 660

tacttcacat cgggtacgga gtggactgcc atggtatcta gtcctgtctg ctccccactc 720

tgtctgacct cagtgtcagt atcagcccag gaggtcgcct tcgccattgg tgttccttcc 780

tatatctacg catttcaccg ctacacagga aattccacct ccctctgccg cactctagtc 840

aggcagttaa ggatgcagtt cccaagttga gctcggggat ttcacatcca tctttccgaa 900

ccacctgcgc gcgctttacg cccagtaatt ccgattaacg cttgcaccct tcgtattacc 960

gcggctgctg gcacgaagtt agccggtgct tattctgcag gtaacgtcaa aacagcaagg 1020

tattaactcg ctgcccttcc tcccaaccaa aagtgcttta caatccgaag accttcttca 1080

cacacgcggc atggctggat caggctttcc cccattgtcc aatattcccc actgctgcct 1140

cccgtaggag tctggaccgt gtctcagttc cagtgtgact gatcatcctc tcagaccagt 1200

tacggatcgt cgccttggta ggccgttacc ccaccaacta gctaatccga cataggctca 1260

tccgatagcg caaggcccga agatcccctg ctttctcccg taggacgtat gcggtattag 1320

cgttcctttc gaaaagttgt cccccactac caggcagatt cctaggcatt actcacccgt 1380

ccgccgctga accccggagc aagctcccat catccgctcg actgcatgtg tagcatgccg 1440

cattgccc 1448

Claims

1.一株有机污染降解菌株A7，经鉴定为假单胞菌（Pseudomonas sp.），已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏时间为2020年12月18日，保藏编号为CCTCC NO:M 2020914。

2.如权利要求1所述的有机污染降解菌株A7在降解灭草灵、联苯醇及苯系物残留中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述苯系物包括苯、甲苯、二甲苯中的任意一种或者几种。

4.一种利用权利要求1所述的有机污染降解菌株A7生产的降解菌剂。

5.一种权利要求4所述的降解菌剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）将降解菌株A7培养到对数期的试管液按发酵培养基体积的0.5-1%接种于发酵培养基中，振荡培养至对数期，制得发酵菌种；

（2）将上述制得发酵菌种按种子罐的培养基体积的1-10%接种于种子罐的培养基中，培养至对数生长期，制得种子液；

（3）将种子液按生产罐的培养基体积的1-10%接种于生产罐的培养基中培养发酵，发酵完成后的培养液即为降解菌剂。

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）和步骤（3）所述培养过程中每分钟无菌空气的通气量为1:（1-0.8）vvm，搅拌速度为160-200rpm，培养温度为28-32℃。

7.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤（3）所述培养发酵时间为36-48小时。

8.如权利要求4所述的降解菌剂在降解灭草灵、联苯醇及苯系物残留中的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述降解菌剂在降解土壤或水体环境中灭草灵、联苯醇及苯系物残留中的应用。