CN101434923A - 缺陷假单胞菌在降解拟除虫菊酯类农药残留的应用及制剂 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一株可同时降解多种拟除虫菊酯类农药的微生物菌种——缺陷假单胞菌(pseudomonas diminuta)在降解拟除虫菊酯类农药残留中的应用，以及利用该菌株制备的拟除虫菊酯类农药残留降解制剂。本发明筛选得到一株能同时降解联苯菊酯、甲氰菊酯、氯氰菊酯三种拟除虫菊酯类农药残留的高效降解菌株，并对其进行了分析鉴定和降解特性研究，以期揭示该菌株对农药降解的基本规律，为控制拟除虫菊酯类农药残留提供了科学依据。

Description

缺陷假单胞菌在降解拟除虫菊酯类农药残留的应用及制剂

(一)技术领域

本发明涉及缺陷假单胞菌(pseudomonas diminuta)在降解拟除虫菊酯类农药残留中的应用，以及利用该菌株制备的拟除虫菊酯类农药残留的降解制剂。

(二)背景技术

拟除虫菊酯类农药是模拟天然的除虫菊酯而合成，含有多个苯环结构的一类杀虫剂，具有广谱高效、低毒、耐光、热等特点，其品种数和使用量仅次于有机磷农药，占杀虫剂市场的第二位，在茶叶、蔬菜等经济作物害虫防治中得到广泛应用，常用的有联苯菊酯、甲氰菊酯、氯氰菊酯等。但是这类农药普遍具有对环境稳定、降解速度慢、降解率低，残留过高，带来了食品安全问题，特别是我国加入WTO后，“关税壁垒”随之拆除，国外针对我国入关而颁布的农产品中农药的最大残留量(MRL)标准带有明显的“技术壁垒”倾向，特别是针对茶叶，农药检测范围大幅度扩大，拟除虫菊酯类农药MRL标准明显降低，使我国茶叶等农产品出口面临着更为严峻的挑战。

农药残留是吸附、降解和迁移等综合作用后结果，其中降解是制约其残留量的关键过程，控制农药残留有多种途径，包括禁用农药、化学处理方法和微生物降解等。大量研究表明微生物对土壤和水环境中的农药降解起着关键作用，研究发现了大批能降解或转化农药的微生物类群，如细菌、放线菌、真菌和藻类，在对拟除虫菊酯类农药降解研究中发现假单胞菌属(Pseudomonas.sp)、肠杆菌属(Ehterobacte.sp)、产碱杆菌属(Alcaligenes.sp)和芽孢杆菌属(Bacillus.sp)等对拟除虫菊酯类农药具有降解作用。但大多数微生物降解针对某一或少数几个农药，而同时能降解多种拟除虫菊酯类农药的微生物报道较少。

(三)发明内容

本发明目的是提供可同时降解多种拟除虫菊酯类农药的微生物菌种——缺陷假单胞菌(pseudomonas diminuta)在降解拟除虫菊酯类农药残留中的应用，以及利用该菌株制备的拟除虫菊酯类农药残留降解制剂。

本发明采用的技术方案是：

缺陷假单胞菌(pseudomonas diminuta)在降解拟除虫菊酯类农药残留中的应用。具体的，所述缺陷假单胞菌用于同时降解联苯菊酯(CAS：83322-02-5)、甲氰菊酯(CAS：39515-41-8)和氯氰菊酯(CAS：52315-07-8)三种拟除虫菊酯类农药残留。

发明人进行了长期的研究，从拟除虫菊酯类农药生产车间下水道驯化过的污泥中分离得到1株能同时降解联苯菊酯、甲氰菊酯、氯氰菊酯的高效菌M5R14，经Sherlock MIS系统鉴定为假单胞菌菌属(pseudomonas.sp)中的缺陷假单胞菌(pseudomonas dimin uta)。

该降解菌M5R14具有如下特性：

(1)该菌为球菌，好氧型，大小0.5×1.2~1.7μm，革兰氏阴性，能够以3种拟除虫菊酯类农药为唯一碳源生长。

(2)根据Sherlock MIS软件系统对菌M5R14脂肪酸定性和定量的分析生成的脂肪酸图谱，对比Library数据库，初步鉴定菌株M5R14为假单胞菌菌属(pseudomonas.sp)中的缺陷假单胞菌(pseudomonas diminuta)，相似指数SI为0.926。

(3)在通气、pH6.0~7.0、30℃、OD_415nm0.2、农药浓度100mg·L^-1、转速180r·min^-1条件下，对含有联苯菊酯、甲氰菊酯、氯氰菊酯的混合培养基，培养3天，3种农药的降解率分别为43.78％，43.91％，43.75％。

(1)降解过程符合一级动力学方程模型，三种农药的降解半衰期t_1/2为97.6，106.6，101.9h。降解率与接菌量(OD_415nm)、通气量、振荡速率呈正相关。

具体的，所述降解在通空气或氧气、pH6.0~7.0、25~30℃、OD_415nm0.1~0.2、各农药浓度(指单一农药的浓度)50~100mg·L^-1的条件下进行。

优选的，所述降解在通空气或氧气、pH7.0、30℃、OD_415nm0.2、各农药浓度100mg·L^-1的条件下进行。

经大量实验筛选验证，获得菌株M5R14对三种拟除虫菊酯类农药的最佳降解条件如下：

(1)接种量的影响

联苯菊酯、甲氰菊酯、氯氰菊酯的浓度均为100mg·L^-1的混合培养基，分别接种不同初始OD_415nm值的菌液培养3天，发现3种农药的降解率与菌液接种量OD_415nm值呈正相关；接种量以OD_415nm值0.15或0.2为宜。

(2)农药浓度的影响

联苯菊酯、甲氰菊酯、氯氰菊酯的各自浓度分别为25，50，100，150，200，250mg·L^-1的混合培养基，接种量OD_415nm0.2，培养3天，发现各农药浓度为50、100mg·L^-1的混合培养基中，菌株M5R14对3种农药的降解率相对较高，降解率>40％；农药浓度增加，农药的降解率下降。

(3)温度的影响

联苯菊酯、甲氰菊酯、氯氰菊酯的浓度为100mg·L^-1的混合培养基，接种OD_415nm0.2菌种，于不同温度培养3天，发现30℃时菌株M5R14对3种农药的降解效果最好，降解率分别达到43.78％，43.91％，43.75％。

(4)酸度的影响

联苯菊酯、甲氰菊酯、氯氰菊酯的浓度为100mg·L^-1的混合培养基，接种OD_415nm0.2菌种，于不同pH培养3天，发现pH6.0~7.0，菌株M5R14对3种农药的降解率最高。pH7.0时菌株M5R14对3种农药的降解率分别为43.78％，43.91％，43.75％。

(5)振荡速率的影响

联苯菊酯、甲氰菊酯、氯氰菊酯的浓度为100mg·L^-1的混合培养基，接种OD_415nm0.2菌种，于不同摇床转速培养3天，发现3种农药降解率与振荡速率呈正相关。

(6)装液量的影响

联苯菊酯、甲氰菊酯、氯氰菊酯的浓度为100mg·L^-1的混合培养基，接种OD_415nm0.2菌种，不同装液量培养3天，发现菌株M5R14对3种菊酯农药的降解率与装液量呈负相关，与通气量呈正相关。

(7)菌株M5R14生长(OD_415nm)与降解3种农药的关系曲线

在菌株生长的对数期(12~48h)和稳定期内(48~84h)，农药降解率迅速，与菌株生长表现出正相关。随着菌株生长进入衰亡期(84h以后)，3种农药降解率增长趋势也趋向减缓。揭示菌株M5R14确实能够降解3种拟除虫菊酯类农药，并以其为唯一碳源进行生长。

(8)菌株M5R14对三种农药的降解动力学分析

用一级动力学方程对三种拟除虫菊酯农药的降解进行拟合，相关系数R2分别为0.9511，0.9506，0.9414。菌株M5R14对3种农药的降解动力学方程分别为y＝9.1798e^-0.0071t，y＝7.8731e^-0.0065t，y＝8.9173e^-0.0068t，降解速率常数k分别为0.0071，0.0065，0.068h^-1，半衰期分别为97.6，106.6，101.9h。

本发明还涉及一种拟除虫菊酯类农药残留降解制剂，含有所述的缺陷假单胞菌，所述降解制剂可按照本领域常规方法获得。优选的，所述拟虫菊酯类农药残留降解制剂为缺陷假单胞菌菌粉。

本发明的有益效果主要体现在：筛选得到一株能同时降解联苯菊酯、甲氰菊酯、氯氰菊酯三种拟除虫菊酯类农药残留的高效降解菌株，为控制农产品中拟除虫菊酯类农药残留提供了研究基础，具有一定应用潜力。

(四)附图说明

图1为缺陷假单胞菌M5R14的电镜照片(放大50000倍)；

图2为不同条件对缺陷假单胞菌M5R14同时降解联苯菊酯、甲氰菊酯、氯氰菊酯的影响(A：OD值；B：农药浓度；C：温度；D：pH；E：振荡速率；F：装液量)；

图3为缺陷假单胞菌M5R14生长量(OD_415nm)与降解联苯菊酯、甲氰菊酯、氯氰菊酯的关系曲线。

(五)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1：降解菌株的筛选与鉴定

1.1培养基和试剂

富集培养基：蛋白胨10g，NaCl 1.0g，KH₂PO₄ 1.0g，H₂O 1000mL，葡萄糖1.0g，pH7.0；

基础培养基：NH₄NO₃ 1.00g，MgSO₄.7H₂O 0.5g，(NH₄)₂SO₄ 0.5g，KH₂PO₄ 0.5g，NaCl 0.5g，K₂HPO₄ 1.5g，H₂O 1000mL，pH7.0；

基础培养基加入1.5％琼脂和100mg·L^-1的联苯菊酯、甲氰菊酯和氯氰菊酯即配成相应的含农药固体培养基；

50mg·L^-1的联苯菊酯、甲氰菊酯和氯氰菊酯乳液。

1.2菌株对联苯菊酯、甲氰菊酯和氯氰菊酯降解效能的测定

将纯化后的单个菌株以菌量OD_415nm＝0.2接种到100mL含联苯菊酯、甲氰菊酯、氯氰菊酯各100mg·L^-1的无菌液体基础培养基的250mL三角瓶中，以不接菌的培养液作对照，在30℃，180r·min^-1的恒温摇床上振荡培养3天。培养结束后，吸取2mL培养液，加入4，4，3mL的石油醚萃取3次，加入无水硫酸钠吸水，并定容至10mL，用气相色谱检测。

气相色谱检测条件：Agilent 6890GC(G1530N/G3172A)气相色谱仪，HP-5(30mm×0.25mm×0.25μm)色谱柱，ECD检测器，检测温度280℃，柱温260℃，进样口温度280℃，柱流：1.0mL·min^-1，分流比为1:10，载气为N₂(99.999％)，进样量为1μL。

降解率(％)＝(对照样品残留量-处理样品残留量)×100/对照样品残留量

1.3 优势降解菌株选育

1.3.1 菌株来源

采集杭州农药厂拟除虫菊酯类农药生产车间下水道处驯化过的污泥。

1.3.2 降解菌株的分离、纯化和筛选

从每份污泥土样中取10g，在无菌的条件下，分别加到含联苯菊酯、甲氰菊酯、氯氰菊酯各100mg·L^-1的100mL无菌液体富集培养基的250mL三角瓶中.在30℃下180r·min^-1摇床上培养7天后，按10％接种量转移到下一批富集培养基上(三种农药梯度依次为100，150，200，250mg·L^-1)，同条件驯化培养7天。然后再按10％接种量转接到含联苯菊酯、甲氰菊酯、氯氰菊酯各250mg·L^-1的无菌液体基础培养基中，继续培养7天，连续转接2次后从农药浓度为250mg·L^-1基础培养基中，取0.1mL基础培养基发酵液反复进行平板划线分离、纯化，直到筛选得到单个菌落，将纯菌落接种到斜面上，于4℃冰箱内保存。

1.3.3 菌株鉴定

菌株鉴定采用美国MIDI公司的Sherlock microbial identity system(MIS)软件系统，该系统将在基础培养基上纯化培养的菌株按照MIDI公司的操作规范要求进行脂肪酸甲酯的提取和分析，定性(种类)和定量(含量)地分析微生物的脂肪酸甲酯成份并生成一个脂肪酸图谱，利用该图谱和数据库(Library)进行比对，鉴定未知的菌种。

1.3.4 菌株形态特征观察及生理生化特性测定

将菌株接种在固体培养基中，48h后电镜观察菌株形态特征；取纯化的菌株生长的对数期进行革兰氏、鞭毛、结晶紫简单荚膜等染色；生理生化特性测定参照《常见细菌系统鉴定手册》(东秀珠，2001)。

2.结果

2.1 菌株的分离与筛选

经分离、纯化、筛选获得1株能同以联苯菊酯、甲氰菊酯、氯氰菊酯为碳源并保持较高和较稳定降解率的细菌，命名为M5R14，其它菌株降解力都不同程度地衰退，培养3天，对三种农药的降解率分别为43.78％，43.91％，43.75％。

2.2 菌株的鉴定

2.2.1 菌株M5R14基本形态及生理生化特征

该菌为球菌，无芽孢、无鞭毛，大小0.5×1.2~1.7μm(图1)，在固体培养基上，菌落圆形、隆起，表面光滑、湿润，边缘完整，呈灰黄色，半透明，革兰氏染阴性，乙酰甲基甲醇生成试验(v-p)反应阳性，氧化酶和过氧化氢酶阳性，不能水解淀粉，能液化明胶，其他生理生化特性见表1。

表1：菌株M5R14的生理生化特性

注：+阳性反应；-阴性反应

2.2.2 菌株M5R14鉴定

根据Sherlock MIS软件系统对菌M5R14脂肪酸定性和定量的分析生成的脂肪酸图谱，对比Library数据库，初步鉴定菌株M5R14为假单胞菌菌属(pseudomonas.sp)中的缺陷假单胞菌(pseudomonas diminuta)，相似指数SI(similarity index)为0.926。

3 结论

从拟除虫菊酯类农药生产车间下水道驯化污泥中分离得到1株能同时降解联苯菊酯、甲氰菊酯、氯氰菊酯的高效菌M5R14，经Sherlock MIS系统鉴定为假单胞菌属(pseudomonas.sp)的缺陷假单胞菌(pseudomonas diminuta)。

实施例2：降解条件的优化

1 材料与方法

1.1 培养基和试剂

富集培养基：蛋白胨10g，NaCl 1.0g，KH₂PO₄ 1.0g，H₂O 1000mL，葡萄糖1.0g，pH7.0；

基础培养基：NH₄NO₃ 1.00g，MgSO_4·7H₂O 0.5g，(NH₄)₂SO₄ 0.5g，KH₂PO₄ 0.5g，NaCl 0.5g，K₂HPO₄ 1.5g，H₂O 1000mL，pH7.0；

基础培养基加入1.5％琼脂和100mg·L^-1的联苯菊酯、甲氰菊酯和氯氰菊酯即配成相应的含农药固体培养基；

50mg·L^-1的联苯菊酯、甲氰菊酯和氯氰菊酯乳液。

1.2 菌株对联苯菊酯、甲氰菊酯、氯氰菊酯降解的最佳条件

在装有100mL基础培养基的三角瓶中，混合加入联苯菊酯、甲氰菊酯、氯氰菊酯各100mg·L^-1作为碳源，接种量OD₄15nm＝0.2、30℃、pH7.0、振荡速率180r·min^-1、装液量100mL(250mL三角瓶)。最佳条件降解试验通过分别改变基本条件中的接种量(OD_415nm为0.05，0.1，0.15，0.2，0.4)、农药浓度(50，100，150，200，250mg·L^-1)、温度(15，25，30，35，45℃)、pH值(3.0，4.0，5.0，6.0，7.0，8.0，9.0，0.0)、振荡速率(0，60，120，180，220r·min^-1)或装液量(25，50，100，150，200mL)，保持其他条件不变，培养3天，进行单因素条件试验，各单因素设计以不接种为对照，每个处理设3个重复，按照实施例1方法测定菌株同时对3种菊酯农药的降解率。

1.2.1 接种量的影响

联苯菊酯、甲氰菊酯、氯氰菊酯的浓度均为100mg·L^-1的混合培养基，分别接种初始菌液OD_415nm值为0.05，0.1，0.15，0.2，0.3的量，培养3天。

1.2.2 农药浓度的影响

联苯菊酯、甲氰菊酯、氯氰菊酯的浓度分别为25，50，100，150，200，250mg·L^-1的混合培养基，接种量OD_415nm0.2，培养3天。

1.2.3 温度的影响

联苯菊酯、甲氰菊酯、氯氰菊酯的浓度为100mg·L^-1的混合培养基，接种OD_415nm0.2菌种，于不同温度培养3天。

1.2.4 酸度的影响

联苯菊酯、甲氰菊酯、氯氰菊酯的浓度为100mg·L^-1的混合培养基，接种OD_415nm0.2菌种，于不同pH培养3天。

1.2.5 振荡速率的影响

联苯菊酯、甲氰菊酯、氯氰菊酯的浓度为100mg·L^-1的混合培养基，接种OD_415nm0.2菌种，于不同摇床转速培养3天。

1.2.6 装液量的影响

联苯菊酯、甲氰菊酯、氯氰菊酯的浓度为100mg·L^-1的混合培养基，接种OD_415nm0.2菌种，不同装液量培养3天。

1.3菌株生长量(OD415nm)和降解联苯菊酯、甲氰菊酯、氯氰菊酯关系曲线的测定

将菌株等量置于含100mg·L^-1的联苯菊酯、甲氰菊酯、氯氰菊酯100mL的混合基础培养基，于30℃、180r·min^-1摇床上培养，分别在12，24，36，48，60，72，84，96，108h测定菌株对三种农药的降解率，并取样过的发酵离心液取等量菌体适当稀释测OD_415nmz(培养基培养的菌液需先离心8000r·min^-1，5min，再用无菌水重悬后测定)，测定菌株生长量与降解率的关系。

2.结果

2.1 菌株M5R14对联苯菊酯、甲氰菊酯、氯氰菊酯降解的最佳条件

2.1.1 接种量对菌株M5R14同时降解联苯菊酯、甲氰菊酯、氯氰菊酯的影响

含联苯菊酯、甲氰菊酯、氯氰菊酯各100mg·L^-1的混合培养基分别接种不同初始菌液量，培养3天后，3种菊酯农药的降解率见图2(A)。由图2(A)可以看出，菌株M5R14对100mg·L^-1的联苯菊酯、甲氰菊酯、氯氰菊酯的降解率随接种量的增加而增加，3种菊酯农药的降解率与菌液接种量OD_415nm值呈正相关，相关系数分别为0.92，0.9129，0.9238，但接种量OD_415nm大于0.2时，降解率增加幅度降低，这可能是由于随着接种量的增加，微生物生长所需的碳源相对不足，微生物间相互竞争导致有效菌源相差不多，因此从降解效果及降解率与菌量比值的降解率看，接种量以OD_415nm值0.15或0.2为宜。

2.1.2 农药浓度对产菌株M5R14同时降解联苯菊酯、甲氰菊酯、氯氰菊酯的影响：

在甲氰菊酯，联苯菊酯，氯氰菊酯不同浓度梯度的混合培养基中，接种量OD_415nm0.2，培养3d后，3种农药的降解率见图2(B)。结果表明，3种菊酯农药浓度分别为50，100mg·L^-1时的混合培养基中，菌株M5R14对3种菊酯农药的同时降解率相对较高，降解率在43％以上，之后随着3种菊酯农药浓度的增加，菌株M5R14对3种菊酯农药的降解率下降。可见较高或较低农药浓度降可导致解菌株M5R14效率降低，这可能在低浓度时碳源不足导致菌株生长受限制及高浓度又会对菌体产生毒害作用之故。

2.1.3 温度对菌株M5R14同时降解联苯菊酯、甲氰菊酯、氯氰菊酯的影响

含有联苯菊酯、甲氰菊酯、氯氰菊酯各100mg·L^-1的混合培养基接种OD_415nm0.2菌种后，不同温度梯度下培养3天，3种农药的降解率如图2(C)所示。结果表明，菌株M5R14在温度30℃时对对联苯菊酯、甲氰菊酯、氯氰菊酯同时降解效果最好，分别达到43.78％，43.91％，43.75％，温度高于或低于30℃时，菌株M5R14对3种菊酯同时降解效果受到抑制，降解率下降，这可能因为低温延长菌株进入对数增长期，高温不利于菌株存活，表明该菌株为中温型生活环境的细菌。

2.1.4 pH值对菌株M5R14同时降解联苯菊酯、甲氰菊酯、氯氰菊酯的影响

不同pH梯度下，含有联苯菊酯、甲氰菊酯、氯氰菊酯各100mg·L^-1的混合培养基接种OD_415nm0.2菌量，培养3天后，3种农药的降解率见图2(D)。结果表明：在pH3.0~10.0之间菌株M5R14对3种农药的同时降解率随培养温度变化存在较大差异，最适宜降解温度在pH6.0~7.0，此时菌株M5R14对3种农药同时降解效率最大。以培养pH7.0为例，菌株M5R14对联苯菊酯、甲氰菊酯、氯氰菊酯降解率分别43.78％，43.91％，43.75％，pH值低于或高于6.0~7.0时，菌株M5R14对3种农药降解效果受到抑制，降解率下降，表明该菌株为中性菌，在此条件下可能有助于降解酶的合成与表达，降解效率最高。

2.1.5 振荡速率对菌株M5R14同时降解联苯菊酯、甲氰菊酯、氯氰菊酯的影响

不同摇床转速下，对含有联苯菊酯、甲氰菊酯、氯氰菊酯各100mg·L^-1的混合培养基接种OD_415nm0.2菌种，培养3天。3种农药的降解率见图2(E)。结果表明，随着振荡速率加快，瓶内溶解氧也增加，菌株M5R14对联苯菊酯、甲氰菊酯、氯氰菊酯同时降解能力相应增强，3种农药降解率与振荡速率呈正相关，相关系数分别为0.9856，0.9464，0.9551，表明该菌株为好氧型菌，振荡速率加快，瓶内溶解氧增加有利于菊酯农药的降解。

2.1.6 装液量对菌株M5R14同时降解联苯菊酯、甲氰菊酯、氯氰菊酯的影响

于250mL三角瓶中，装不同量含有联苯菊酯、甲氰菊酯、氯氰菊酯各100mg·L^-1且接种OD_415nm0.2菌量的混合培养基，培养3天。3种农药的降解率见图2(F)。由图2(F)可知，菌株M5R14对联苯菊酯、甲氰菊酯、氯氰菊酯的降解率与装液量呈负相关，与通气量呈正相关，相关系数分别为0.9273，0.9681，0.9397，这也表明该菌株为好氧型，瓶中装液量的增加导致通气体积的减少不利于菌株M5R14对3种农药的降解。

2.2 菌株M5R14生长(OD_415nm)与同时降解联苯菊酯、甲氰菊酯、氯氰菊酯的关系

菌株生长和农药降解率的关系曲线(图3)表明，菌株生长的对数期12~48h；稳定期在48~84h之间，在菌株生长的对数期和稳定期内，农药降解率增长率迅速，与菌株生长近乎成正相关，随着菌株生长进入衰亡期(84h以后)，农药降解率增长趋势也趋向减缓，揭示菌株M5R14能够有效同时降解联苯菊酯、甲氰菊酯、氯氰菊酯农药，并以该农药为唯一碳源进行生长。

2.3 菌株M5R14对联苯菊酯、甲氰菊酯、氯氰菊酯降解的动力学分析

为了解菌株M5R14对3种菊酯农药的降解行为，研究中采用一级动力学模型，对农药残留量(C)和时间(t)进行拟合，降解动力学方程为C_t＝C₀×e^-kt(其中C_t为t时间3种农药的残留量，C₀为初始浓度，k为降解速率常数)，半衰期T_1/2＝ln2/k(Chang et al.，2005；Yuan et al.，2004)，拟合结果如表2。由表2可知，菌株M5R14对联苯菊酯、甲氰菊酯、甲氰菊酯的同时降解符合一级动力学方程，相关系数(R²)分别为0.9511、0.9506、0.9414。通过计算得出菌株M5R14对联苯菊酯、甲氰菊酯、甲氰菊酯的降解速率常数(k)分别为0.0071，0.0065，0.068h^-1，半衰期(t_1/2)为97.6，106.6，101.9h。

表2：菌株M5R14对联苯菊酯、甲氰菊酯、氯氰菊酯降解的动力学参数

 

药剂名称	动力学方程	速率常数(h-1)	相关系数(R2)	半衰期(h)
					联苯菊酯	y＝9.1798e-0.0071x	0.0071	0.9795	97.6
甲氰菊酯	y＝7.8731e-0.0065x	0.0065	0.9367	106.6
					氯氰菊酯	y＝8.9173e-0.0068x	0.0068	0.9232	101.9

3、讨论

微生物降解或生物转化有机污染物是有机污染物污染环境修复的核心，获得高效降解菌是开展生物修复工作的前提。虽然微生物降解有机污染物的受到有微生物自身、农药结构，以及环境条件(pH、温度、底物浓度等)对的影响，但微生物降解或生物转化仍是有机物污染环境修复的首选手段。丁海涛等(2003)从活性污泥的富集培养物中分离得到能明显地去除氰戊菊酯、氯氰菊酯、溴氰菊酯农药的菌株qw5，其最佳降解环境条件是在通气、pH7~8、温度30℃左右，培养5天，分别含氰戊菊酯、氯氰菊酯、溴氰菊酯的培养基中对应农药降解率分别为53.8％、41.2％和61.7％。本发明筛选的缺陷假单胞菌菌株M5R14对联苯菊酯、甲氰菊酯、氯氰菊酯同时降解结果证明其具有降解菊酯类农药的高效和广谱性，研究结果同样也证明其降解效率受到通气、pH、温度、接种量、农药浓度、转速等环境条件的影响。在确定的最佳环境条件下，培养3天后，菌株M5R14对100mg·L^-1联苯菊酯、甲氰菊酯、氯氰菊酯的同时降解率分别为43.78％、43.91％和43.75％，且能够以3种菊酯为唯一碳源生长。研究结果表明菌株M5R14对联苯菊酯、甲氰菊酯、氯氰菊酯待降解率与通气量、振荡速率、接种量呈正相关，表明该菌株为好氧型菌株。

农药除被微生物降解外，还能光解、化学分解，因此只有当菌株的生长和农药的降解出现同步关系时，才能确定农药被微生物降解了(王兆守，2003)。本研究结果表明(图2)，在缺陷假单胞菌菌株M5R14生长的对数期和稳定期内，农药降解率和菌株生长近乎呈正相关，随着菌株生长进入衰亡期，受周围不利因素(代谢物积累等)影响，仍存活的细胞，降解力受到抑制，农药降解率增长趋势也趋向减缓，菌株的生长和农药的降解呈现出良好的同步关系。同时发现菌株M5R14对联苯菊酯、甲氰菊酯、氯氰菊酯的降解过程满足一级动力学方程模型，半衰期(t_1/2)为97.6，106.6，101.9h，与Grant et al.(2002；2003)从使用过拟除虫菊酯的菜园和农田土壤的混和土样中分离出荧光假单胞菌和普城沙雷菌两株优势菌，于25℃、80r·min^-1条件下培养14天，对250mg·L^-1的氯氰菊酯去除率约为66.7％的结果相比，表明本研究分离筛选的缺陷假单胞菌菌株M5R14是一株可同时对联苯菊酯、甲氰菊酯、氯氰菊酯降解的高效菌株，降解半衰期短，表明其在控制农产品中拟除虫菊酯类农药残留方面具有一定的应用潜力。

4、结论

1)菌株M5R14在通气量、pH6.0~7.0、温度30℃、OD_415nm0.2、农药浓度100mg·L^-1、转速180r·min^-1环境条件下降解效果最好，菌株降解效果与菌量(OD_415nm)，通气量、振荡速率呈正相关，且能够以3种为唯一碳源生长。

2)在最佳降解环境条件下，菌株M5R14对联苯菊酯、甲氰菊酯、氯氰菊酯的降解过程满足一级动力学方程模型，降解速率常数k分别为0.0071，0.0065，0.068h^-1，半衰期(t_1/2)为97.6，106.6，101.9h。

以上的所述乃是本发明的具体实施例及所运用的技术原理，若依本发明的构想所作的改变，其所产生的功能作用仍未超出说明书及附图所涵盖的精神时，仍应属本发明的保护范围。

Claims (6)

1.缺陷假单胞菌(pseudomonas diminuta)在降解拟除虫菊酯类农药残留中的应用。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于所述缺陷假单胞菌用于同时降解联苯菊酯、甲氰菊酯和氯氰菊酯三种拟除虫菊酯类农药残留。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述降解在通空气或氧气、pH6.0～7.0、25～30℃、OD_415nm0.1～0.2、各农药浓度50～100mg·L^-1的条件下进行。

4.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述降解在通空气或氧气、pH7.0、30℃、OD_415nm0.2、各农药浓度100mg·L^-1的条件下进行。

5.一种拟除虫菊酯类农药残留降解制剂，含有如权利要求1所述的缺陷假单胞菌。

6.如权利要求5所述的拟除虫菊酯类农药残留降解制剂，其特征在于所述拟除虫菊酯类农药残留降解制剂为缺陷假单胞菌菌粉。

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