CN105238729B - 一种苍白杆菌及其生物制剂和制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种苍白杆菌及其生物制剂和制备方法与应用，苍白杆菌为中间型苍白杆菌；苍白杆菌为活性成分的生物制剂，是以中间型苍白杆菌经试管种培养、液体发酵培养后制成的生物制剂。苍白杆菌为活性成分的菌剂的制备方法，包括试管种培养、液体发酵培养步骤；应用为苍白杆菌为活性成分的生物制剂在修复甲基托布津残留污染土壤中的应用和降解去除农作物甲基托布津农药残留中的应用。所述菌株TP206发酵生产的甲基托布津农药降解菌剂可广泛用于土壤中甲基托布津残留污染的修复，还可以在农业生产中直接喷洒于土壤或作物表面，可以有效降解去除甲基托布津农药残留，使用方便，成本低廉。

Description

一种苍白杆菌及其生物制剂和制备方法与应用

技术领域

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种苍白杆菌及其生物制剂和制备方法与应用。

背景技术

农药现代农业生产中对病虫害的的防治是必不可少的，但同时随着农药的广泛大量地使用，也给环境造成人为的污染，农产品中导致农药残留的产生，直接威胁着人们的健康。我国已经提出了“农药零增长计划”，目的就是减少农药对环境、人的影响。在减少农残方面，除了筛选高效低残留的农药、科学施用方法、农药替代等技术外，生物降解也是有效的技术之一。美国科学家从上世纪60 年代开始，着手研究污染环境的异生物质包括化学农药等的微生物降解，旨在通过微生物技术清除环境污染物。国内外有许多报道将微生物作为接种剂直接接种到自然环境中，降解、清除环境中污染物成功的例子。利用微生物对农药污染物进行降解和转化有着巨大潜力，这与微生物所具备的几个方面的特点有关：微生物个体微小，比表面积大，代谢速度快；微生物种类繁多，分布广，代谢类型多样；微生物繁殖快、易变异、适应性强；在自然界的生态系统中微生物可产生降解酶将农药分解为无毒的小分子化合物甚至完全矿化为二氧化碳和水；另外微生物可通过共代谢作用，加快或促进农药残留的降解速度。国内外已分离筛选到许多降解或转化一种或几种农药的微生物类群。据不完全统计，已报道的农药降解细菌至少有28各属、真菌有14个属，放线菌有5个属。细菌主要有假单胞菌属（Pseudomonas）、棒状杆菌属（Corynebacterium）、芽孢杆菌属(Bacillus)、节杆菌属(Arthrobacter)、黄杆菌属(Flavobacterium)、黄担保杆菌属(Xanthomolzas)。真菌主要有曲霉属(Aspergillua)、青霉属(Penlcillium)、木霉属(Trichoderma)和镰刀菌属(Fuarium)。农药残留的微生物降解技术相比于物理化学修复技术，具有经济、高效和无二次污染等优点，是一个有潜力的、充满希望的农药污染修复方法。农药的微生物降解研究受到国内外的关注，在大农业农残的降解和环境修复中逐步得到应用。甲基托布津是一种高效杀菌剂农药，化学名为1 、2 一二( 3 -甲氧碳基-2-硫脲基)苯,通用名为甲基硫菌灵。由于其化学性质稳定, 在土壤中降解半衰期较长, 能持久地残留在使用部位, 易致累积效应，由于使用过量常会造成农产品的农药残留。然而，目前学术界对甲基托布津残留降解问题生物降解研究报道较少，市场上也没有可以大面积使用的甲基托布津降解剂产品。

发明内容

本发明第一目的在于提供一种苍白杆菌，第二目的在于提供一种以所述苍白杆菌作为活性成分的生物制剂，第三目的在于提供所述以苍白杆菌作为活性成分的生物制剂制备方法，第四目的在于提供所述苍白杆菌作为活性成分的生物制剂的应用。

本发明第一目的是这样实现的，所述的苍白杆菌为中间型苍白杆菌（Ochrobactrum intermedium）TP 206，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏日：2014年11月21日，保藏编号：CGMCC No.10035；所述苍白杆菌属于细菌界，变形菌门，α-变形菌纲，根瘤菌目，布鲁氏菌，苍白杆菌属。

中间型苍白杆菌（Ochrobactrum intermedium）TP 206的获得与鉴定：

菌株分离筛选方法：

分离培养基：Na₂HPO₄ 3g，KH₂PO₄ 1.5g，NH₄Cl 0.5g，蒸馏水500ml，琼脂7-8g，pH7.0（用NaOH调节），在倒平板的时候再加入0.5ml的CaCl₂和MgSO₄•7H₂O，终浓度为0.1％的甲基托布津。

量取45ml水放入小三角瓶内，在121℃、20min高压蒸汽灭菌→称取5g烟叶样品放入灭菌后的小三角瓶内，放入30℃,150r/min摇床，30min后取出静置片刻→用移液枪吸取200ul上层液于已经倒好的的分离培养基平板上，用涂布器涂布均匀→放于37℃恒温培养箱培养7d→待长出多个单菌落后，在操作台内挑选长出的单个菌落于已经装满1ml LB液体培养基的保存管内→再放于放入30℃，150r/min摇床培养3d→待菌长满保存管后→加入甘油终浓度达到40%，放于-80℃冰箱内保藏。

分离的菌株通过液体培养的方法鉴定其降解甲基托布津的能力。上述分离菌株在LB培养基中培养1天，加入终浓度为200ppm的甲基托布津农药，继续振荡培养3天，取样通过HPLC检测方法检测甲基托布津的残留量。

甲基托布津的HPLC检测方法：取1mL培养液，过0.22μm有机相滤膜，待测。色谱柱：ZORBAX Eclipse XDB- C18（4.6×250mm，5μm）；柱温：30.0℃；检测波长：275nm，流动相A：CH3OH，B：H2O，C：CH3CN；流速：0.7mL/min；进样量：10.0µL，洗脱采用梯度洗脱。

菌株分离筛选结果：

通过分离和筛选得到一株能够在3天培养后高效降解甲基托布津的菌株，降解率达到99.3％，该菌株分离自云南省玉溪市红塔区烟叶表面，标记为TP206。该菌株于2014年11月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏登记入册的编号CGMCC N0.10035。

菌株鉴定方法

降解菌株的培养特征及生理生化鉴定参照《常见细菌系统鉴定手册》。和《Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology》进行。菌体总DNA的提取采用高盐法，并以总DNA为模板，扩增降解菌株的16S rRNA基因序列。PCR扩增产物纯化回收，进行TA克隆后进行测序。测序结果使用原核生物鉴定数据库EzBilCloud (http://eztaxon- e.ezbiocloud.net/)进行在线比对分析。

鉴定结果

TP 206菌株系本发明人从大量烟草叶片上筛选出来的，具有显著降低甲基托布津含量的能力，经生理生化实验和16S rDNA序列进行鉴定，确定是中间型苍白杆菌（Ochrobactrum intermedium）TP 206菌株。

本发明Ochrobactrum intermedium TP 206菌株主要特征为：菌体细胞为短杆状，排列不整齐，没有芽孢，革兰氏染色阴性。在NA培养基表面菌体形成不透明的白色小菌落，表面光滑凸起，菌落干，边缘不整齐。严格好氧，伏-普试验(V .P .)、甲基红试验、吲哚试验呈阴性，不水解淀粉和明胶,接触酶、氧化酶反应、硝酸盐还原、硫化氢试验呈阳性，能够利用葡萄糖、麦芽糖等。最适生长温度为30 ℃和pH 为6.5。

本发明第二目的是这样实现的，是以所述中间型苍白杆菌（Ochrobactrum intermedium）TP 206经试管种培养、液体发酵培养后制成的生物制剂。

本发明的第三目的是这样实现的，包括试管种培养、液体发酵培养步骤，具体包括：

A、试管种培养：将中间型苍白杆菌（Ochrobactrum intermedium）TP 206接种到试管斜面培养基上，在温度28~31℃恒温培养0.5~1.5天，得试管种；

B、液体发酵培养：将试管种接种到液体培养基中，在温度28~31℃下摇床培养1~3天得到目标物苍白杆菌为活性成分的生物制剂。

本发明的第四目的是这样实现的，所述的苍白杆菌为活性成分的生物制剂在修复甲基托布津残留污染土壤中的应用。

所述的苍白杆菌为活性成分的生物制剂在降解去除农作物甲基托布津农药残留中的应用。

本发明人使用中间型苍白杆菌（Ochrobactrum intermedium）TP 206，经发酵生产过程，制备了甲基托布津农药残留降解菌剂，该菌剂对甲基托布津残留的降解率达到80以上，可广泛用于土壤甲基托布津污染或农作物甲基托布津的农药残留。

本发明使用所述菌株TP206发酵生产的甲基托布津农药降解菌剂可广泛用于土壤中甲基托布津残留污染的修复，还可以在农业生产中直接喷洒于土壤或作物表面，可以有效降解去除甲基托布津农药残留，使用方便，成本低廉。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但不以任何方式对本发明加以限制，基于本发明教导所作的任何变换或改进，均落入本发明的保护范围。

本发明所述的苍白杆菌为中间型苍白杆菌（Ochrobactrum intermedium）TP 206，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏日：2014年11月21日，保藏编号：CGMCC No.10035；所述苍白杆菌属于细菌界，变形菌门，α-变形菌纲，根瘤菌目，布鲁氏菌，苍白杆菌属。

本发明所述的苍白杆菌为活性成分的生物制剂，是以所述中间型苍白杆菌（Ochrobactrum intermedium）TP 206经试管种培养、液体发酵培养后制成的生物制剂。

所述的苍白杆菌为活性成分的生物制剂中菌浓度为：每ml活菌数≥10⁸。

本发明所述的苍白杆菌为活性成分的生物制剂的制备方法，包括试管种培养、液体发酵培养步骤，具体包括：

A、试管种培养：将中间型苍白杆菌（Ochrobactrum intermedium）TP 206接种到试管斜面培养基上，在温度28~31℃恒温培养0.5~1.5天，得试管种；

B、液体发酵培养：将试管种接种到液体培养基中，在温度28~31℃下摇床培养1~3天得到目标物苍白杆菌为活性成分的生物制剂。

A步骤中所述的试管斜面培养基的成分为：葡萄糖1~3g，牛肉浸膏0.5~1.5 g，氯化钠0.4~0.7 g，MgSO₄·7H₂O 0.1-0.3 g，琼脂1.5~2 g，其余为水，pH值为5.5~8.0。

B步骤中所述的液体培养基的成分为：葡萄糖1~2 g，牛肉膏0.1~0.3 g，豆饼粉0.8~1.2g，氯化钠0.3~0.5 g，MgSO₄·7H₂O 0.2~0.4 g，其余为水，pH值为5.5~8.0。

B步骤中所述摇床的转速为180~200rpm。

本发明所述的苍白杆菌为活性成分的生物制剂的应用为所述的苍白杆菌为活性成分的生物制剂在修复甲基托布津残留污染土壤中的应用。

本发明所述的苍白杆菌为活性成分的生物制剂的应用为所述的苍白杆菌为活性成分的生物制剂在降解去除农作物甲基托布津农药残留中的应用。

本发明生物制剂的制备具体操作如下：

1、试管种培养

将保存甲基托布津降解菌TP 206在试管斜面上28~31℃活化培养1天，获得试管种。试管斜面培养基配方为：葡萄糖1~3g，牛肉浸膏0.5~1.5g，氯化钠0.4~0.7g，MgSO₄•7H₂O0.1~0.3g,琼脂1.5~2g，其余为水，pH 5.5~8；

2、液体发酵培养

将培养好的试管种接种到500ml三角瓶液体培养基中，每瓶装200ml， 30℃发酵2天，转速为180~200 rpm，培养后用稀释平板计数法测定菌悬液浓度，菌浓度要求每ml活菌数≥10⁸个。

液体发酵培养基配方：葡萄糖1~2g、牛肉膏0.1~0.3g、豆饼粉1g、NaCl 0.3~0.5g、MgSO₄•7H₂O 0.2~0.4g，其余为水，pH值5.5~8.0；

生物制剂的制备结果

通过2天的液体发酵，发酵液中每ml活菌数25×10⁸ cfu/g，分装形成降解菌剂。

生物制剂的应用

1、制备生物制剂：按前述TP 206菌株的培养方法制备试验用制剂；以未接种TP206菌剂的作为对照。

2、生物制剂应用

（1）作物叶面喷施

在烟草的旺长期喷施甲基托布津农药，每亩用70%甲基托布津100克兑水50kg喷雾施用。农药喷施2天后喷施TP206生物制剂（浓度为2％），以喷施等量清水为对照。14天后取烟叶样品，于烘箱50℃烘干粉碎，测定烟叶甲基托布津残留量。

（2）污染土壤喷

取农田土壤，充分混合均匀，进行灭菌处理。灭菌的土壤按100mg•kg-1干土的量加入甲基托布津，搅拌均匀，过夜。花盆消毒后，每盆装入1000g。菌剂处理按108个细胞•g-1干土的量加入降解菌剂，对照添加等量的清水，保持土壤的含水量在40%左右，温室放置20天，取土层同等深度的样品，进行甲基托布津残留量测定。

生物制剂的应用效果

两种处理方法均能有效降解甲基托布津在烟叶上的残留量和土壤中甲基托布津的残留量，降解率大于90.4％。

下面通过实施例加以说明：

实施例1

将中间型苍白杆菌(Ochrobactrum intermedium) TP206菌株接种到试管琼脂斜面上，培养基配方为：葡萄糖1g，牛肉浸膏1.0g，氯化钠0.5g，MgSO₄•7H₂O 0.2g，琼脂1.5g，蒸馏水100ml，pH 6.5；30℃恒温培养1天，获得试管种。

将培养好的试管种接种到500ml三角瓶液体培养基中，每瓶装200ml， 30℃发酵2天，转速为180~200 rpm。培养基配方为：葡萄糖1g、牛肉膏0.2g、豆饼粉1g、NaCl 0.3g、MgSO₄•7H₂O 0.2g，蒸馏水100ml，pH值6.5。

培养时间2天，菌体浓度为达到每ml活菌数≥25×10⁸ cfu/mL，得具有降低甲基托布津功能的生物制剂。

实施例2

同实施例1，不同之处在于液体培养基配方，其配方为：葡萄糖2g、牛肉膏0.25g、豆饼粉1.2g、NaCl 0.4g、MgSO4•7H₂O 0.2g，蒸馏水100ml，pH值7。菌体浓度为达到每ml活菌数≥34×10⁸ cfu/mL。

实施例3

同实施例1，不同之处在于斜面培养基配方为：葡萄糖1.0g，牛肉浸膏0.5g，氯化钠0.4g，MgSO₄•7H₂O 0.1g，琼脂1.5g，蒸馏水100ml，pH 5.5；葡萄糖1g、牛肉膏0.1g、豆饼粉0.8g、NaCl 0.3g、MgSO₄•7H₂O 0.2g，蒸馏水100ml，pH值5.5。菌体浓度为达到每ml活菌数≥32×10⁸。

实施例4

同实施例1，不同之处在于斜面培养基配方为：葡萄糖3g，牛肉浸膏1.5g，氯化钠0.7g，MgSO₄•7H₂O 0.3g，琼脂2g，蒸馏水100ml，pH 8.0；葡萄糖2g、牛肉膏0.3g、豆饼粉1.2g、NaCl 0.5g、MgSO₄•7H₂O 0.4g，蒸馏水100ml，pH值8.0。菌体浓度为达到每ml活菌数≥36×10⁸。

实施例5

同实施例1，不同之处在于斜面培养基配方为：葡萄糖1g，牛肉浸膏1.5g，氯化钠0.6g，MgSO₄•7H₂O 0.3g，琼脂1.8g，蒸馏水100ml，pH 7.0；葡萄糖1.5g、牛肉膏0.2g、豆饼粉1.1g、NaCl 0.5g、MgSO₄•7H₂O 0.2g，蒸馏水100ml，pH值7.5。菌体浓度为达到每ml活菌数≥29×10⁸。

实施例6

同实施例1，不同之处在于斜面培养基配方为：葡萄糖3g，牛肉浸膏0.5g，氯化钠0.4g，MgSO₄•7H₂O 0.3g，琼脂1.7g，蒸馏水100ml，pH 6.0；葡萄糖1.5g、牛肉膏0.1g、豆饼粉0.9g、NaCl 0.4g、MgSO₄•7H₂O 0.3g，蒸馏水100ml，pH值7.0菌体浓度为达到每ml活菌数≥33×10⁸。

实施例7

实施例1制备得到的生物制剂在烟草生长期施用，验证降解甲基托布津残留量的效果。在烟草的旺长期喷施甲基托布津农药，每亩用70%甲基托布津100克兑水50kg喷雾施用。农药喷施2天后喷施实施例1制备得到的TP206生物制剂（浓度为2％），以喷施等量清水为对照。14天后取烟叶样品测定甲基托布津残留数量。

结果为喷施实施例1制备得到的TP206生物制剂的烟叶中甲基托布津残留量为0.58 mg/kg，清水对照甲基托布津残留量为6.04 mg/kg，甲基托布津的降解率为90.4％。

实施例8

取农田土壤，充分混合均匀，进行灭菌处理。灭菌的土壤按100mg•kg-1干土的量加入甲基托布津，搅拌均匀，过夜。花盆消毒后，每盆装入1000g。菌剂处理按10⁸个细胞•g^-1干土的量加入降解菌剂，对照添加等量的清水，保持土壤的含水量在40%左右，温室放置20天，取土层同等深度的样品，进行甲基托布津残留量测定。每个处理五个重复。降解率=（对照甲基托布津残留量—菌剂处理甲基托布津残留量）/对照甲基托布津残留量×100%。

结果为喷施实施例1制备得到的TP206生物制剂的土壤中甲基托布津残留量为1.26 mg/kg，清水对照甲基托布津残留量为16.8mg/kg，甲基托布津的降解率为92.5％。

实施例9

分别以实施例2、3、4、5、6制备得到的生物制剂验证试验功效，方法同实施例7和实施例8，结果均显示本发明制备得到的生物制剂能够降解甲基托布津残留量。

Claims (8)

1.一种苍白杆菌，其特征在于所述的苍白杆菌为中间型苍白杆菌（Ochrobactrum intermedium）TP 206，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏日：2014年11月21日，保藏编号：CGMCC No.10035，属于细菌界、变形菌门、α-变形菌纲、根瘤菌目、布鲁氏菌、苍白杆菌属，菌株特征为：菌体细胞为短杆状，排列不整齐，没有芽孢，革兰氏染色阴性；在NA培养基表面菌体形成不透明的白色小菌落，表面光滑凸起，菌落干，边缘不整齐；严格好氧，V .P .、甲基红试验、吲哚试验呈阴性，不水解淀粉和明胶，接触酶、氧化酶反应、硝酸盐还原、硫化氢试验呈阳性，能利用葡萄糖、麦芽糖，最适生长温度30℃、pH6.5。

2.一种以权利要求1所述苍白杆菌为活性成分的生物制剂，其特征在于是以所述中间型苍白杆菌（Ochrobactrum intermedium）TP 206经试管种培养、液体发酵培养后制成的生物制剂，生物制剂中菌浓度为：每ml活菌数≥10⁸。

3.一种权利要求2所述生物制剂的制备方法，其特征在于包括试管种培养、液体发酵培养步骤，具体包括：

A、试管种培养：将中间型苍白杆菌（Ochrobactrum intermedium）TP 206接种到试管斜面培养基上，在温度28~31℃恒温培养0.5~1.5天，得试管种；

B、液体发酵培养：将试管种接种到液体培养基中，在温度28~31℃下摇床培养1~3天得到目标物苍白杆菌为活性成分的生物制剂。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于A步骤中所述的试管斜面培养基的成分为：葡萄糖1~3g，牛肉浸膏0.5~1.5g，氯化钠0.4~0.7g，MgSO₄·7H₂O 0.1-0.3g，琼脂1.5~2g，其余为水，pH值为5.5~8.0。

5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于B步骤中所述的液体培养基的成分为：葡萄糖1~2g，牛肉膏0.1~0.3g，豆饼粉0.8~1.2g，氯化钠0.3~0.5g，MgSO₄·7H₂O 0.2~0.4g，其余为水，pH值为5.5~8.0。

6.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于B步骤中所述摇床的转速为180~200rpm。

7.一种权利要求2所述生物制剂在修复甲基托布津残留污染土壤中的应用。

8.一种权利要求2所述生物制剂在降解去除农作物甲基托布津农药残留中的应用。