CN101401991A - 产气肠杆菌在降解拟除虫菊酯类农药残留中的应用及制剂 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一株可同时降解多种拟除虫菊酯类农药的微生物菌种——产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)在降解拟除虫菊酯类农药残留中的应用，以及利用该菌株制备的拟除虫菊酯类农药残留降解制剂。本发明筛选得到一株能同时降解联苯菊酯、甲氰菊酯、氯氰菊酯三种拟除虫菊酯类农药残留的高效降解菌株，并对其进行了分析鉴定和降解特性研究，以期揭示该菌株对农药降解的基本规律，为控制拟除虫菊酯类农药残留提供了科学依据。

Description

产气肠杆菌在降解拟除虫菊酯类农药残留中的应用及制剂

(一)技术领域

本发明涉及产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)在降解拟除虫菊酯类农药残留中的应用，以及利用该菌株制备的拟除虫菊酯类农药残留降解制剂。

(二)背景技术

拟除虫菊酯类农药是模拟天然的除虫菊酯而合成，含有多个苯环结构的一类杀虫剂，具有广谱高效、低毒、耐光、热等特点，其品种数和使用量仅次于有机磷农药，占杀虫剂市场的第二位，在茶叶、蔬菜等经济作物害虫防治中得到广泛应用，常用的有联苯菊酯、甲氰菊酯、氯氰菊酯等。但是这类农药普遍具有对环境稳定、降解速度慢、降解率低，残留过高，带来了食品安全问题。特别是我国加入WTO后，“关税壁垒”随之拆除，国外针对我国入关而颁布的农产品中农药的最大残留量(MRL)标准带有明显的“技术壁垒”倾向，农药检测范围大幅度扩大，拟除虫菊酯类农药MRL标准明显降低，使我国茶叶等农产品出口面临着更为严峻的挑战。

农药残留是吸附、降解和迁移等综合作用的结果，其中降解是制约其残留量的关键过程，控制农药残留有多种途径，包括禁用农药、化学处理方法和微生物降解等。大量研究表明微生物对土壤和水环境中的农药降解起着关键作用，已分离到大批能降解或转化农药的微生物类群，如细菌、放线菌、真菌和藻类，在对拟除虫菊酯类农药降解研究中发现假单胞菌属(Pseudomonas.sp)、肠杆菌属(Ehterobacte.sp)、产碱杆菌属(Alcaligenes.sp)^[12]和蜡状芽孢杆菌属(Bacilluscereus.sp)等对拟除虫菊酯类农药具有降解作用。但大多数微生物降解针对某一或少数几个农药，而同时能降解多种拟除虫菊酯类农药的微生物报道较少。

(三)发明内容

本发明目的是提供可同时降解多种拟除虫菊酯类农药的微生物菌种——产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)在降解拟除虫菊酯类农药残留中的应用，以及利用该菌株制备的拟除虫菊酯类农药残留降解制剂。

本发明采用的技术方案是：

产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)在降解拟除虫菊酯类农药残留中的应用。具体的，所述产气肠杆菌用于同时降解联苯菊酯(CAS：83322-02-5)、甲氰菊酯(CAS：39515-41-8)和氯氰菊酯(CAS：52315-07-8)三种拟除虫菊酯类农药残留。

本发明通过筛选，获得一株对联苯菊酯、甲氰菊酯和氯氰菊酯三种拟除虫菊酯类农药残留均有高效作用的菌株M6R9，根据Sherlock MIS软件系统对菌株M6R9定性和定量的分析生成的脂肪酸图谱，对比Library数据库，初步鉴定菌M6R9为产气肠杆菌属(Enterobacter.sp)中的产气肠杆菌(Enterobacteraerogenes)，相似指数SI(similarity index)为0.931。

该降解菌M6R9具有如下特性：

(1)该菌为杆菌，好氧型，大小约为长(0.8～1.9)μm、宽(0.5～1.0)μm，革兰氏阴性，能够以联苯菊酯、甲氰菊酯、氯氰菊酯3种拟除虫菊酯类农药为碳源生长。

(2)在通气、pH7.0、温度(25～30)℃、OD_415nm0.2、各农药浓度100mg·L^-1、转速180r·min^-1的环境条件下降解效果最好。在该条件下，在含有3种拟除虫菊酯类农药的混合培养基，培养3天，3种农药的降解率分别为55.74％、55.11％、56.96％。

(3)降解过程满足一级动力学方程模型，降解半衰期(t_1/2)为65.4、70.7、68.6h。

(4)3种农药降解率与接菌量(OD_415nm)、通气量、振荡速率呈正相关。

(5)经Sherlock MIS系统鉴定为产气肠杆菌属(Enterobacter.sp)中的产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)。

具体的，所述降解在通空气或氧气、pH7.0～8.0、25～30℃、OD_415nm0.15～0.2、农药浓度(单一农药的浓度)50～100mg·L^-1的条件下进行。

优选的，所述降解在通空气或氧气、pH7.0、25～30℃、OD_415nm0.2、农药浓度100mg·L^-1的条件下进行。

经大量实验筛选验证，获得菌株M6R9对三种拟除虫菊酯类农药的最佳降解条件如下：

(1)OD值的影响

含联苯菊酯、甲氰菊酯、氯氰菊酯各100mg·L^-1的混合培养基分别接种初始菌液OD_415nm值为0.05，0.1，0.15，0.2，0.3的量，培养3天后，3种农药均有不同程度的降解。菌株M6R9对3种农药的降解率随接种量的增加而增加，农药的降解率与菌液接种量OD值呈正相关。接种量以OD_415nm值0.15或0.2为宜。

(2)农药浓度的影响

在甲氰菊酯，联苯菊酯，氯氰菊酯浓度各为25，50，100，150，200，250mg·L^-1梯度的混合培养基，接种量OD_415nm0.2，培养3d。3种农药浓度分别为50，100mg·L^-1时的混合培养基中，菌株M6R9对3种农药的降解率分别为50％以上。

(3)培养温度的影响

含有联苯菊酯、甲氰菊酯、氯氰菊酯各100mg·L^-1的混合培养基接种OD_415nm0.2菌种，于不同梯度的温度下培养3天。在10～45℃之间菌株M6R9对3种农药的降解率随培养温度变化存在较大差异，最适宜降解温度在25～30℃，降解率较高。以培养温度30℃为例，3种农药的降解率分别为54.74％、55.56％、56.39％。

(4)酸度的影响

含有联苯菊酯、甲氰菊酯、氯氰菊酯各100mg·L^-1的混合培养基接种OD_415nm0.2菌种，于不同pH下培养3天。菌株M6R9在pH7.0时对3种农药降解效果最好，分别达到56.64％，56.32％，57.42％。

(5)振荡速率的影响

含有联苯菊酯、甲氰菊酯、氯氰菊酯各100mg·L^-1的混合培养基接种OD_415nm0.2菌种，于不同摇床转速下培养3天。3种农药降解率与振荡速率呈正相关。

(6)装液量的影响

含有联苯菊酯、甲氰菊酯、氯氰菊酯各100mg·L^-1的混合培养基接种OD_415nm0.2菌种，于250mL三角瓶中不同装液量培养3天。菌株M6R9对3种农药的降解率与装液量呈负相关，与通气量呈正相关。

(7)菌株M6R9生长量(OD_415nm)与三种农药降解的关系

在菌株生长的对数期(12～48h)和稳定期(48～72h)内，农药降解率增长率迅速，与菌株生长近乎成正相关，随着菌株生长进入衰亡期(72h以后)，农药降解率增长趋势也趋向减缓，证明产该菌株确实能够降解农药，并以农药为唯一碳源进行生长。

(8)菌株M6R9对三种拟除虫菊酯类农药的降解动力学

菌株M6R9对3种菊酯农药的降解行为，可以用一级动力学方程来描述。通过计算得出产气肠杆菌对联苯菊酯、甲氰菊酯、甲氰菊酯的降解动力学方程分别为y＝8.3763e^-0.0106t，y＝8.4866e^-0.0098t，y＝8.3159e^-0.0101t，速率常数k分别为0.0106，0.0098，0.0101h^-1，降解半衰期t_1/2为65.4，70.7，68.6h。

本发明还涉及一种拟除虫菊酯类农药残留降解制剂，含有所述的产气肠杆菌。优选的，所述拟虫菊酯类农药残留降解制剂为产气肠杆菌菌粉。

本发明的有益效果主要体现在：筛选得到一株能同时降解联苯菊酯、甲氰菊酯、氯氰菊酯三种拟除虫菊酯类农药残留的高效降解菌株，为控制农产品中拟除虫菊酯类农药残留提供了研究基础，具有一定应用潜力。

(四)附图说明

图1为产气肠杆菌M6R9的电镜照片(放大50000倍)；

图2为产气肠杆菌M6R9生长(OD_415nm)与降解联苯菊酯、甲氰菊酯、氯氰菊酯的关系曲线；

图3为不同条件对产气肠杆菌M6R9降解联苯菊酯、甲氰菊酯、氯氰菊酯的影响(A：OD值；B：农药浓；C：温度；D：度pH；E：振荡速率；F：装液量)。

(五)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1：降解菌株的筛选与鉴定

1材料与方法

1.1培养基和试剂

富集培养基：蛋白胨10g，NaCl 1.0g，KH₂PO₄ 1.0g，H₂O 1000mL，葡萄糖1.0g，pH 7.0；

基础培养基：NH₄NO₃1.00g，MgSO₄.7H₂O 0.5g，(NH₄)₂SO₄ 0.5g，KH₂PO₄0.5g，NaCl0.5g，K₂HPO₄ 1.5g，H₂O1000mL，pH7.0；

基础培养基加入1.5％(w/v)琼脂和100mg.L^-1的联苯菊酯、甲氰菊酯和氯氰菊酯即配成相应的含农药固体培养基；

50mg·L^-1的联苯菊酯、甲氰菊酯和氯氰菊酯乳液。

1.2菌株对联苯菊酯、甲氰菊酯和氯氰菊酯降解效能的测定

将纯化后的单个菌株以菌量OD_415nm＝0.2接种到100mL含联苯菊酯、甲氰菊酯、氯氰菊酯各100mg·L^-1的无菌液体富集培养基的250mL三角瓶中，以不接菌的培养液作对照，在30℃，180r·min^-1的恒温摇床上振荡培养3天。培养结束后，吸取2mL培养液，加入4、4、3mL的石油醚萃取3次，加入无水硫酸钠吸水，并定容至10mL，用气相色谱检测。

气相色谱检测条件：Agilent 6890GC(G1530N/G3172A)气相色谱仪，HP-5(30mm×0.25mm×0.25μm)色谱柱，ECD检测器，检测温度280℃，柱温260℃，进样口温度280℃，柱流：1.0mL·min^-1，分流比为1∶10，载气为N₂(99.999％)，进样量为1μL。

降解率(％)＝(对照样品残留量-处理样品残留量)×100/对照样品残留量

1.3优势降解菌株选育

1.3.1菌株来源

采集杭州农药厂拟除虫菊酯类农药生产车间下水道处驯化过的污泥。

1.3.2降解菌株的分离、纯化和筛选

从每份污泥土样中取10g，在无菌的条件下，分别加到含联苯菊酯、甲氰菊酯、氯氰菊酯各100mg·L^-1的100mL无菌液体富集培养基的250mL三角瓶中.在30℃下180r·min^-1摇床上培养7天后，按10％接种量转移到下一批富集培养基上(三种农药梯度依次为100、150、200、250mg·L^-1)，同条件驯化培养7天。然后再按10％接种量转接到含250mg·L^-1的联苯菊酯、甲氰菊酯、氯氰菊酯无菌液体的基础培养基中，继续培养7天，连续转接2次后从农药浓度为250mg·L^-1基础培养基中，取0.1mL基础培养基发酵液反复进行平板划线分离、纯化，直到筛选得到单个菌落，将纯菌落接种到斜面上，于4℃冰箱内保存。

1.3.3菌株鉴定

菌株鉴定采用美国MIDI公司的Sherlock microbial identity system(MIS)软件系统，该系统将在基础培养基上纯化培养的菌株按照MIDI公司的操作规范要求进行脂肪酸的提取和分析，定性(种类)和定量(含量)地分析微生物的脂肪酸成份并生成一个脂肪酸图谱，利用该图谱和数据库(Library)进行比对，鉴定未知的菌种。

1.3.4菌株形态特征观察及生理生化特性测定

将菌株接种在固体培养基中，48h后电镜观察菌株形态特征；取纯化的菌株生长的对数期进行革兰氏、结晶紫简单荚膜等染色；生理生化特性测定参照《常见细菌系统鉴定手册》(东秀珠，蔡妙英)。

2.结果

2.1菌株的分离与筛选

经分离、纯化、筛选获得1株能同以联苯菊酯、甲氰菊酯、氯氰菊酯为碳源并保持较高和较稳定降解率的细菌，命名为M6R9，其它菌株降解力都不同程度地衰退，培养3天，发现它对3种农药的降解率分别为55.74％、55.11％、56.96％。

2.2菌株的鉴定

2.2.1菌株M6R9基本形态及生理生化特征

该菌为杆菌，不产胞子且具有小的荚膜，革兰氏阴性，菌体大小约为长(0.8～1.9)μm、宽(0.5～1.0)μm(如图1)，在固体培养基上，菌落圆形，表面凸起、光滑，边缘完整，呈灰白色，不透明。乙酰甲基甲醇生成试验(v-p)反应阳性，吲哚实验阴性，不能液化明胶，其他生理生化特性见表1。

表1：产气肠杆菌的生理生化特性

测试项目	结果	生理生化测试	结果
				革兰氏染色	-	V-P实验	+
甲基红	-	吲哚实验	-
				脂酶	-	硫化氢	-
赖氨酸脱羧酸	+	苯丙氨酸脱氨酶	-
				鸟酸氨脱羧酶	+	氧化酶	-
柠檬酸盐	+	脲酶水解	-
				木糖	+	精氨酸双水解酶	-
葡萄糖产气	+	蔗糖产酸	+
				丙二酸	+	麦芽糖产酸	+
乳糖	+	卫矛醇产酸	-

注：+阳性反应；-阴性反应

2.2.2菌株M6R9鉴定

根据Sherlock MIS软件系统对菌株M6R9定性和定量的分析生成的脂肪酸图谱，对比Library数据库，初步鉴定菌M6R9为产气肠杆菌属(Enterobacter.sp)中的产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)，相似指数SI(similarity index)为0.931。

3结论

1)从拟除虫菊酯类农药生产车间下水道驯化过的污泥中分离得到1株能同时降解联苯菊酯、甲氰菊酯、氯氰菊酯的高效菌M6R9，经Sherlock MIS系统鉴定为产气肠杆菌属(Enterobacter.sp)中的产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)。

实施例2：降解条件的优化

1材料与方法

1.1培养基和试剂

富集培养基：蛋白胨10g，NaCl 1.0g，KH₂PO₄ 1.0g，H₂O 1000mL，葡萄糖1.0g，pH 7.0；

基础培养基：NH₄NO₃1.00g，MgSO₄.7H₂O 0.5g，(NH₄)₂SO₄ 0.5g，KH₂PO₄0.5g，NaCl0.5g，K₂HPO₄ 1.5g，H₂O1000mL，pH7.0；

基础培养基加入1.5％(w/v)琼脂和100mg·L^-1的联苯菊酯、甲氰菊酯和氯氰菊酯即配成相应的含农药固体培养基；

50mg·L^-1的联苯菊酯、甲氰菊酯和氯氰菊酯乳液。

1.2菌株对联苯菊酯、甲氰菊酯和氯氰菊酯降解效能的测定

将纯化后的产气肠杆菌M6R9菌株以菌量OD_415nm＝0.2接种到100mL含联苯菊酯、甲氰菊酯、氯氰菊酯各100mg·L^-1的无菌液体富集培养基的250mL三角瓶中，以不接菌的培养液作对照，在30℃，180r·min^-1的恒温摇床上振荡培养3天。培养结束后，吸取2mL培养液，加入4、4、3mL的石油醚萃取3次，加入无水硫酸钠吸水，并定容至10mL，用气相色谱检测。

气相色谱检测条件：Agilent 6890GC(G1530N/G3172A)气相色谱仪，HP-5(30mm×0.25mm×0.25μm)色谱柱，ECD检测器，检测温度280℃，柱温260℃，进样口温度280℃，柱流：1.0mL·min^-1，分流比为1∶10，载气为N₂(99.999％)，进样量为1μL。

降解率(％)＝(对照样品残留量-处理样品残留量)×100/对照样品残留量

1.3菌株对联苯菊酯、甲氰菊酯、氯氰菊酯降解的最佳条件

在装有100mL基础培养基的三角瓶中，混合加入100mg·L^-1联苯菊酯、甲氰菊酯、氯氰菊酯作为唯一碳源，在基本条件为接种量OD_415nm＝0.2、30℃、pH7.0、振荡速率180r·min^-1、装液量100mL(250mL三角瓶)，分别改变以上条件中的接种量(OD_415nm为0.05、0.1、0.15、0.2、0.4)、农药浓度(50、100、150、200、250mg·L^-1)、温度(15、25、30、35、45℃)、pH值(3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0)、振荡速率(0、60、120、180、220r·min^-1)和装液量(25、50、100、150、200mL)，保持其他条件不变，培养3天，进行单因素条件试验，各单因素设计以不接种为对照，每个处理设3个重复，测定菌株M6R9对3种菊酯农药的降解率。

1.4菌株M6R9生长量(OD_415nm)和降解联苯菊酯、甲氰菊酯、氯氰菊酯关系曲线的测定

将菌株M6R9等量置于含100mg·L^-1的联苯菊酯、甲氰菊酯、氯氰菊酯100mL的混合基础培养基，于30℃、180r·min^-1摇床上培养，分别在12，24，36，48，60，72，84，96，108h测定菌株对三种菊酯农药的降解率，并取样过的发酵离心液取等量菌体适当稀释测OD_415nmz(培养基培养的菌液需先离心8000r·min^-1，5min，再用无菌水重悬后测定)，测定菌株生长量与降解率的曲线关系。

2.结果

2.1菌株M6R9对联苯菊酯、甲氰菊酯、氯氰菊酯降解的最佳条件

2.1.1 OD值对菌株M6R9降解联苯菊酯、甲氰菊酯、氯氰菊酯的影响

含联苯菊酯、甲氰菊酯、氯氰菊酯各100mg·L^-1的混合培养基分别接种初始菌液OD_415nm值为0.05、0.10、0.15、0.20、0.30，培养3天后，3种菊酯农药的降解率见图3(A)。由图3(A)可以看出，菌株M6R9对100mg·L的3种农药的降解率随接种量的增加而增加。3种农药的降解率与菌液接种量OD值呈正相关，相关系数(R²)分别为0.92、0.9129、0.9238。但接种量OD_415nm大于0.2时，降解率增加幅度降低，这可能是由于随着接种量的增加，微生物生长所需的碳源相对不足，微生物间相互竞争导致有效菌源相差不多^[21]，因此从降解效果及降解率与菌量比值的降解率看，接种量以OD_415nm值0.15或0.2为宜。

2.1.2浓度对菌株M6R9降解联苯菊酯、甲氰菊酯、氯氰菊酯的影响

在甲氰菊酯，联苯菊酯，氯氰菊酯浓度各为25、50、100、150、200、250mg·L梯度的混合培养基，接种量OD_415nm0.2，培养3d。图3(B)表明，3种菊酯农药浓度分别为50、100mg·L^-1时的混合培养基中，菌株M6R9对3种农药的降解率相对较高，降解率分别为50％以上，之后随着农药浓度的增加，菌株M6R9对农药的降解率下降。可见较高或较低浓度导致降解效率降低，这可能在低浓度时碳源不足导致菌株生长受限制及高浓度又会对菌体产生毒害作用之故^[8]。

2.1.3温度对菌株M6R9降解联苯菊酯、甲氰菊酯、氯氰菊酯的影响

含有联苯菊酯、甲氰菊酯、氯氰菊酯各100mg·L的混合培养基接种OD_415nm0.2菌种后，于不同梯度的温度下培养3天。结果如图3(C)所示，在10～45℃之间菌株M6R9对3种农药的降解率随培养温度变化存在较大差异，最适宜降解温度在25～30℃之间，降解率最大，以培养温度30℃为例，联苯菊酯、甲氰菊酯、氯氰菊酯的降解率分别为54.74％、55.56％、56.39％。培养温度在15、35、45℃时，3种农药降解效率相对较低，且培养温度低于25℃时，菌株M6R9对3种农药的降解率随温度下降而下降，并且培养温度超过30℃时，菌株对3种农药的降解率随温度升高而下降，表明该菌株属中温型生活环境的细菌。

2.1.4 pH值对菌株M6R9降解联苯菊酯、甲氰菊酯、氯氰菊酯的影响

含有联苯菊酯、甲氰菊酯、氯氰菊酯各100mg·L的混合培养基接种OD_415nm0.2菌种后于不同梯度的pH下培养3天。由图3(D)可知，菌株M6R9在pH7.0时对3种农药的降解效果最好，分别达到56.64％、56.32％、57.42％。pH值低于或高于7.0时，菌株M6R9对3种农药降解效果受到抑制，降解率下降，但pH8.0的降解效果高于pH6.0，表明该菌株为中碱性菌，在此条件下可能有助于降解酶的合成与表达，降解效率最高。

2.1.5振荡速率对菌株M6R9降解联苯菊酯、甲氰菊酯、氯氰菊酯的影响

含有联苯菊酯、甲氰菊酯、氯氰菊酯各100mg·L^-1的混合培养基接种OD_415nm0.2菌种，于不同摇床转速下培养3天。从图3(E)可知，随着振荡速率加快，瓶内溶解氧也增加，菌株M6R9对3种农药降解能力相应增强，3种农药降解率与振荡速率呈正相关，相关系数(R²)分别为0.9856、0.9464、0.9551，这表明该菌株为好氧型菌，振荡速率加快，瓶内溶解氧增加有利于菊酯农药的降解。

2.1.6装液量对菌株M6R9降解联苯菊酯、甲氰菊酯、氯氰菊酯的影响

含有联苯菊酯、甲氰菊酯、氯氰菊酯各100mg·L^-1的混合培养基接种OD_415nm0.2菌种，于250mL三角瓶中不同装液量培养3天。3种农药的降解率见图3(F)。菌株M6R9对3种农药的降解率与装液量呈负相关，与通气量呈正相关，相关系数分别为0.9273、0.9681、0.9397。这也表明该菌株为好氧型菌，瓶中装液量的增加导致通气体积的减少不利于菌株M6R9对3种农药的降解。

2.2菌株M6R9生长(OD_415nm)与降解联苯菊酯、甲氰菊酯、氯氰菊酯的关系曲线

菌株M6R9生长量(OD_415nm)和农药降解率的关系曲线(图2)表明，在菌株生长的对数期(12～48h)和稳定期(48～72h)内，农药降解率增长率迅速，与菌株生长近乎成正相关，随着菌株生长进入衰亡期(72h以后)，农药降解率增长趋势也趋向减缓，揭示产气肠杆菌确实能够降解这三种农药，并以农药为唯一碳源进行生长。

2.3菌株M6R9对联苯菊酯、甲氰菊酯、氯氰菊酯降解的动力学分析

为了解菌株M6R9对3种菊农药的降解行为，研究中采用一级动力学模型对农药残留量(C)和时间(t)进行拟合，降解动力学方程为Ct＝C₀×e^-kt(其中C，为t时间阿维菌素的残留量，C₀为样品的初始浓度，k为降解速率常数)，半衰期T_1/2＝ln2/k^{[8，23，24]}，结果如表2发现发现实验数据的拟合结果较好，故可认为用一级动力学方程来描述联苯菊酯、甲氰菊酯、甲氰菊酯在基础培养基中的降解过程是合理的。

表2：产气肠杆菌对联苯菊酯、甲氰菊酯、氯氰菊酯降解的动力学参数

药剂名称	动力学方程	速率常数(k)	相关系数(R2)	半衰期(h)
					联苯菊酯	y＝8.4866e-0.0098t	0.0106	R2＝0.9511	65.4
甲氰菊酯	y＝8.3763e-0.0106t	0.0098	R2＝0.9506	70.7
					氯氰菊酯	y＝8.3159e-0.0101t	0.0101	R2＝0.9414	68.6

3讨论

通过微生物的降解或生物转化，把有害污染物转变或降解为无毒无害的物质，是有机污染物污染环境修复的核心，而分离得到农药高效降解菌是开展农药污染生物修复工作的重要前提。影响微生物降解农药的因素既有微生物自身和农药结构，但环境条件(pH、温度、底物浓度等)对微生物降解农药的影响具有直接和间接的效应。丁海涛等从活性污泥的富集培养物中分离得到能明显地去除氰戊菊酯、氯氰菊酯、溴氰菊酯等拟除虫菊酯类农药的菌株qw5，其最佳降解环境条件是在通气、pH 7～8、温度30℃左右，降解率分别为53.8％、41.2％和61.7％。本发明筛选的产气肠杆菌菌株M6R9对联苯菊酯、甲氰菊酯、氯氰菊酯降解的影响因素研究结果也证明了这一点，其受到通气、pH、温度、接种量、农药浓度、转速等环境条件的影响。在确定的最佳环境条件下，培养3天后，菌株M6R9对联苯菊酯、甲氰菊酯、氯氰菊酯的降解率分别为55.74％、55.11％、56.96％、且能够以3种拟除虫菊酯农药为唯一碳源生长。结果表明菌株M6R9对联苯菊酯、甲氰菊酯、氯氰菊酯待降解率与通气量、振荡速率、接种量呈正相关，说明该菌株为好氧型菌株。

农药除被微生物降解外，还可能有光解、化学分解等因素，因此只有当菌株的生长和农药的降解出现同步关系时，才能确定农药被微生物降解了。本发明结果表明，在产气肠杆菌生长的对数期和稳定期内，农药降解率和菌株生长近乎呈正相关，随着菌株生长进入衰亡期，受周围不利因素(代谢物积累等)影响，仍存活的细胞，降解力受到抑制，农药降解率增长趋势也趋向减缓，菌株的生长和农药的降解呈现出良好的同步关系。同时也发现菌株M6R9对联苯菊酯、甲氰菊酯、氯氰菊酯的降解过程满足一级动力学方程模型，半衰期(t_1/2)为65.4、70.7、68.6h，与Grant等^[28，29]从使用过拟除虫菊酯的菜园和农田土壤的混和土样中分离出荧光假单胞菌和普城沙雷菌两株优势菌，于25℃、80r.min^-1条件下培养14天，对250mg.L^-1的氯氰菊酯去除率约为66.7％的结果相比，表明本研究分离、筛选的产气肠杆菌菌株M6R9是一株可同时对联苯菊酯、甲氰菊酯、氯氰菊酯降解的高效菌株，对控制农产品中拟除虫菊酯类农药残留具有一定的应用潜力。

4结论

1)菌株M6R9在通气量、pH7.0、温度(25～30)℃、OD_415nm0.2、农药浓度100mg·L^-1、转速180r·min^-1环境条件下降解效果最好，菌株降解效果与接菌量(OD_415nm)，通气量、振荡速率呈正相关，且能够以3种农药为唯一碳源生长。

2)在最佳降解环境条件下，培养3天，菌株M6R9对联苯菊酯、甲氰菊酯、氯氰菊酯的降解率分别为55.74％、55.11％、56.96％，且降解过程满足一级动力学方程模型，速率常数(k)分别为0.0106、0.0098、0.0101d^-1，半衰期(t_1/2)分别为65.4、70.7、68.6h。

Claims (6)

1.产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)在降解拟除虫菊酯类农药残留中的应用。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于所述产气肠杆菌用于同时降解联苯菊酯、甲氰菊酯和氯氰菊酯三种拟除虫菊酯类农药残留。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述降解在通空气或氧气、pH7.0～8.0、25～30℃、OD_415nm0.15～0.2、各农药浓度50～100mg·L^-1的条件下进行。

4.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述降解在通空气或氧气、pH7.0、25～30℃、OD_415nm0.2、各农药浓度100mg·L^-1的条件下进行。

5.一种拟除虫菊酯类农药残留降解制剂，含有如权利要求1所述的产气肠杆菌。

6.如权利要求5所述的拟除虫菊酯类农药残留降解制剂，其特征在于所述拟除虫菊酯类农药残留降解制剂为产气肠杆菌菌粉。

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