CN104531589B - 降解氯氰菊酯的鞘氨醇单胞菌及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种对氯氰菊酯农药残留具有高效降解作用的鞘氨醇单胞菌WHSC‑8T及其应用，该菌株于2014年11月18日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号：CCTCC NO：M2014575。本发明的鞘氨醇单胞菌对氯氰菊酯、辛硫磷、毒死蜱、异丙威、克百威等农药残留均有显著降解效果，其中对氯氰菊酯的降解率达到91.3％以上。本发明提供的农药残留降解菌剂具有生产使用成本低，使用方便，去除效果好的优点，适合在全国粮油蔬菜生产出口基地或绿色食品商标标志的地区大面积推广使用。

Description

降解氯氰菊酯的鞘氨醇单胞菌及其应用
技术领域
本发明属于农药污染的生物技术处理领域，具体涉及一种对氯氰菊酯农药残留具有高效降解作用的鞘氨醇单胞菌WHSC-8T及其应用。
背景技术
拟除虫菊酯类农药是模拟天然的除虫菊酯而合成的一类杀虫剂，具有广谱高效、低毒等优点，在农业害虫和卫生害虫防治中得到广泛应用。然而，拟除虫菊酯类杀虫剂在茶叶、蔬菜等经济作物上的过高残留，带来了食品安全问题。欧盟、日本作为中国农产品出口的两个主要市场，不断对农药残留限量作出更严格的规定，使得中国农产品出口面临巨大压力。同时，拟除虫菊酯类杀虫剂对多种水生生物具有高毒性。氯氰菊酯是拟除虫菊酯类农药的一种，广泛用于防治果树、蔬菜、禾谷类、烟草等作物的鳞翅目、鞘翅目、双翅目害虫。研究表明，氯氰菊酯在水中的半衰期长达31d，对多种水生生物毒性较大，对大鼠生殖系统也有危害。
鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas sp.)可降解的农药类型较多，包括有机磷、有机氯等杀虫剂，2,4-D、甲磺隆等除草剂。假单胞菌属(Pseudomonas sp.)同样能够降解多种农药，如甲基对硫磷、甲安磷、乐果等。目前，国内报道的氯氰菊酯降解菌株主要属于产碱菌属(Alcaligenes sp.)、红球菌属(Rhodococcus sp.)和芽孢杆菌属(Bacillius sp.)。国外曾报道过氯氰菊酯的降解菌株Pseudomonas spp.和Serratia spp.，20天的降解率只有50％，国内也曾报道过鞘氨醇单胞菌Sphingomonas sp菌株XJ对氯氰菊酯的降解率为81.8％，而我们分离的菌株WHSC-8T降解率达到91.3％以上，菌株WHSC-8T经生物学特性及基因比对为新菌株。WHSC-8T在应用于土壤农药污染的原位修复时，易于定殖，并发挥其对氯氰菊酯、联苯菊酯的降解功能，这是很多其他菌株无法比拟的。
鞘氨醇单胞菌降解芳香化合物的能力与其大质粒有关,质粒上的开放阅读框编码大量运输和降解芳香化合物的酶类。也有实验表明,与降解有关的基因不仅位于细菌质粒上,还位于细菌的染色体上,不同地层的鞘氨醇单胞菌其降解芳香化合物的基因位于不同的地方,地表菌株基因定位于染色体上,而地下菌株在质粒上。鞘氨醇单胞菌对芳香化合物的降解机制是依次在芳环上加氧,形成醛、酮或醇类中间体,而后开环分裂,如Sphingomonas sp.RW1降解氧芴(二苯环化合物),首先是对邻近醚键的目标位进行加氧,形成二氢二醇(不稳定的半缩醛中间体),再生成2,2,3-三羟联苯,被间位裂解,再生成水杨酸(单苯化合物),由儿茶酚间位分裂途径或龙胆酸盐途径进一步降解。另一种降解机制是其它能源存在下,通过共代谢作用进行降解。
鞘氨醇单胞菌是清理土壤中有毒物质最有效的微生物类群之一,由于其大质粒上携带了许多能降解苯系及杂环物质的酶系基因,在受有毒物质污染的土壤中,鞘氨醇单胞菌随毒物的空间分布而分布。如农田氯氰菊酯残留于土壤中,并随地表和地下水向土壤深层迁移。
本发明以生物修复(Bioremediation)为理论基础的农药残留降解菌技术为降低农产品和农业生产环境中的农药残留物提供了希望，该技术具有高效、无毒、无二次污染的特点，而且经济实用，操作简便，目前已成为去除农药残留污染的一种重要方法。分离鉴定能降解氯氰菊酯农药的细菌，对其降解特性和应用潜力进行了研究。该研究为降解菊酯类农药残留及其降解机理、克隆降解酶基因打下了基础。
发明内容
本发明的目的是提供一种对氯氰菊酯农药残留具有高效降解作用的鞘氨醇单胞菌WHSC-8T及其应用途径，该菌株于2014年11月18日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国.武汉.武汉大学，邮编：430072，保藏编号：CCTCC NO：M 2014575分类命名：Sphingomonas hengshuiensis WHSC-8T。
鞘氨醇单胞菌WHSC-8T的生长条件：温度范围20–35℃,最佳生长温度28℃，耐盐范围0–1％(w/v)，耐酸碱度范围pH 5-10，最佳为pH 7。菌落特征：28℃在NA平板上培养2天，形成淡黄色圆形菌落，直径1mm；DNA(G+C)％含量为68.72％，主要脂肪酸为C18:1ω7c(64.6％)和C16:0(12.5％)。扫描电镜结果显示菌体为短棒状，有鞭毛。
鞘氨醇单胞菌WHSC-8T为革兰氏阴性菌，生理生化实验结果见表1。
表1WHSC-8T生理生化实验结果
项目 项目
山梨醇 - 果糖 -
核糖 - 鼠李糖 +
麦芽糖 - 阿拉伯糖 +
棉籽糖 + 纤维二糖 +
甘露糖 - 硝酸盐还原 +
蜜二糖 + 淀粉 -
乳糖 - 苯丙氨酸 +
半乳糖 + 过氧化氢酶 +
甘露醇 - 氧化酶 +
硫化氢 - 亚硝酸盐产气 +
蔗糖 + 硝酸盐产气 +
注：“+”表示反应结果呈阳性，“-”表示反应结果呈阴性或不反应
鞘氨醇单胞菌WHSC-8T可在以氯氰菊酯为唯一碳源的无机盐培养基中生长。
鞘氨醇单胞菌WHSC-8T可制作成菌液、冻干菌粉、游离菌剂、固定化菌株等形式应用于对氯氰菊酯的降解，也可以将鞘氨醇单胞菌WHSC-8T菌液与其他成分混合使用，应用于降解废水、土壤等自然环境中的氯氰菊酯。
鞘氨醇单胞菌WHSC-8T对氯氰菊酯、辛硫磷、毒死蜱、异丙威、克百威等农药残留具有高效降解作用，其中对氯氰菊酯的降解率达到91.3％以上。
本发明的另一目的是提供鞘氨醇单胞菌WHSC-8T冻干菌粉的制备方法：
1、离心管准备
选取50mL及1.5mL离心管若干，经自来水冲洗多次，用蒸馏水涮洗2～3次，烘干；121℃下高压灭菌20min，备用；
2、菌种准备及收集
菌种经NA(营养琼脂)液体培养基培养，培养条件为28℃，150rpm，培养2d，用50mL离心管离心收集菌体，并用灭菌蒸馏水洗涤菌体后再次收集；
3、预冻
-80℃冰箱预冻1-2h；
4、冷冻干燥
将预冻后的样品离心管去掉盖子，顶部捆上无菌封口膜，封口膜上打几个小孔，以利于冻干过程中水分排出，将处理好的样品置于已预冷30min的FD-1-50真空冷冻干燥机的干燥盘内，再将有机玻璃罩盖上，开始冷冻干燥，直至离心管内冻干物呈酥块状或松散片状，时间一般为8-20h；
5、收集分装
将50mL离心管内冷冻干燥好的菌体无菌条件下分装至1.5mL离心管内，无菌封口膜封口并标记好菌种名、时间等信息。分装好的冻干菌体-20℃保藏。
有益效果：
本发明提供的农药残留降解菌剂具有生产使用成本低，使用方便，去除效果好的优点，适合在全国粮油蔬菜生产出口基地或绿色食品商标标志的地区大面积推广使用。本发明对于保护生态环境，保护人民的身体健康，提高农产品的附加值具有重要的意义。本发明的鞘氨醇单胞菌对氯氰菊酯、辛硫磷、毒死蜱、异丙威、克百威等农药残留均有显著降解效果，其中对氯氰菊酯的降解率达到91.3％以上。使用该降解菌剂可以在农作物的正常生长过程中正常使用化学农药进行虫害防治而保证农产品中农药残留含量复合绿色食品要求。
附图说明
图1：WHSC-8T透视电镜结果；
图2：WHSC-8T扫描电镜结果；
图3：WHSC-8T DNA(G+C)含量的测定结果。
具体实施方式
实施例1：鞘氨醇单胞菌WHSC-8T的获得
样品采集：2010年7月于衡水市衡水湖采集泥土为样品。
菌株的分离及纯化：称取5.0g样品置于盛有100mL富集培养基的250mL的锥形瓶中，添加100mg/L的氯氰菊酯于30℃，150r/min恒温摇床培养，每周移种一次，以10％的接种量接入新鲜培养基中，每次移种均增加氯氰菊酯的浓度，以100mg/L的梯度递增，直到浓度增加500mg/L，然后用基础培养基代替富集培养基，每周移种一次，氯氰菊酯的浓度始终保持在500mg/L。待长出菌丝后，用平板涂布法在普通培养基上进行菌株分离。
分离平板的制作：将琼脂加入到盛有基础培养基的三角瓶中，水浴加热至90℃，并不断搅拌，待琼脂全部溶解后，分装于培养皿中，并于120℃高温灭菌10分钟，待凝固后置于恒温培养箱中37℃下培养48h，检查无菌落及皿盖无冷凝水方可使用。将培养皿从恒温培养箱中拿出，用接种环小心挑取单菌落另接于干净的平板上，37℃培养24h，用光学显微镜观察是否为单一微生物。若发现有杂菌，则需再一次进行分离、纯化，直到获得较纯的菌株。将得到的纯菌株转入普通培养基斜面上。随后逐渐增大氯氰菊酯浓度至1000mg/L，选取生长最旺盛的菌株WHSC-8T进行以下实验。
实施例2：WHSC-8T菌株生物学特性
(1)16S rDNA序列相似性试验(见表2)
表2标准菌株信息
标准菌株购于德国微生物菌种保藏中心DSMZ(Deutsche Sammlung vonMikroorganismen und Zellkulturen)
16S rDNA序列相似性：WHSC-8T与菌株S1、S2、S3的序列相似性分别为97.472％、96.647％、96.624％。WHSC-8T与S1的DNA-DNA杂交结果为4.43％。
(2)极性脂、呼吸醌、GC含量、聚胺实验结果(见表3)
极性脂、呼吸醌测定机构：云南大学云南省微生物研究所；
DNA(G+C)含量测定机构：广东微生物分析检测中心。
表3极性脂、呼吸醌、GC含量、聚胺实验结果
(3)聚胺种类测定
测定机构：北京市理化分析测试中心永丰分部；
实验结果：亚精胺含量：323mg/g。
(4)脂肪酸种类及含量测定
测定机构：上海市公共卫生临床中心；
实验结果：WHSC-8T主要脂肪酸为C18:1ω7c(64.6％)和C16:0(12.5％)。
表4WHSC-8T、S1、S2、S3脂肪酸测定结果(数字代表百分含量)
实施例3：菌株WHSC-8T对农药的降解作用
(1)WHSC-8T菌液制备
将WHSC-8T试管菌接种于基础培养基(g/L)：NH4NO31.0，MgSO4·7H2O 0.5，(NH4)2SO40.5，KH2PO40.5，NaCl 0.5，K2HPO41.5，酵母提取物0.05，pH 7。摇瓶中，振荡培养至对数生长期，菌液OD600值为1，加入1ml的WHSC-8T培养液进行3000转5分钟离心，弃上清，再加入超纯水漂洗菌体2次，菌体备农药降解用。
(2)菌株降解能力的测定
将上面菌体按5％的比例分别接入盛有无机盐培养基的三角瓶(g/L)：K2HPO40.2，KH2PO40.5，MgSO4·7H2O 0.4，FeSO4·7H2O 0.002，(NH4)2SO40.2，CaSO40.08，分别加入氯氰菊酯(ω＝98％)、辛硫磷(ω＝92.3％)、毒死蜱(ω＝95％)，异丙威(ω＝98％)、克百威(ω＝98％)，并控制其浓度均为100mg/L，同时以纯培养基代替菌液做对照。通风条件下，30℃、150r/min摇床培养。分别在0h、6h、12h、18h、24h、48h、72h后取样测定农药的残留浓度。
(3)培养液中农药的提取
吸取样品5mL于锥形瓶中，氯氰菊酯(98％)、辛硫磷(92.3％)、毒死蜱(95％)分别用丙酮、石油醚、乙酸乙酯25mL预处理，用玻棒搅拌5min后，静置30mim，用布氏漏斗抽滤，然后将滤液稀释20倍，置于4℃待检测。
(4)气相色谱-质谱连用法检测
将之前提取到的物质进行气相色谱-质谱联用检测。该方法的检测条件为：色谱柱：30m×0.25mm×0.25μm的RTX-1弹性石英毛细管柱；进样口温度250℃；压力控制：178kPa保留5min再以80kPa/min上升到280kPa保持3min，共10.27min；检测器温度280℃，柱温：160℃恒温1min，以40℃/min上升到20℃保持4min，再以30℃/min上升到260℃保持3min，共运行10.8min；载气：N2，流速为1.87mL/min；尾吹气：N2，流速为30mL/min，H2流速为3.5mL/min,空气流速为150mL/min，分流比为5：1：10；进样体积：1μL。
(5)农药定量方法
农药定量采用外标法，按峰面积定量。根据所测峰面积，计算培养基中各农药的残留量R(mg/L)。
R＝S2CV1V/(S1V2G)，
式中，C为标准溶液质量浓度(mg/L)，S1为注入标准溶液的峰面积，S2为注入样品溶液的峰面积，V为样品溶液最终定容体积(mL)，V1为标准溶液进样体积(mL)，V2为样品溶液进样体积(mL)，G为取样体积(mL)。
各目标农药添加回收率检测方法：
在培养基中分别加入供试农药标准溶液，之后进行提取、上机检测，按下式计算上述农药的添加回收率。
添加回收率＝农药的回收质量浓度/农药的添加质量浓度×100％。(结果见表5。)
表5各目标农药的添加回收率
(6)各目标农药降解率结果
采用外标法测定样品中有机磷农药的含量求出其降解率。
农药降解率(％)＝[1/(实测残量/对照样实测残量)]×100％。(结果见表6。)
表6各目标农药降解率测定结果

Claims (3)

1.一种鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas hengshuiensis)，能够降解氯氰菊酯，保藏编号为CCTCC NO：M 2014575。
2.权利要求1所述的鞘氨醇单胞菌在降解农药残留领域的应用。
3.权利要求1所述的鞘氨醇单胞菌的冻干菌粉的制备方法，包括如下步骤：
1)离心管准备：选取50mL及1.5mL离心管若干，经自来水冲洗多次，用蒸馏水涮洗2～3次，烘干；121℃下高压灭菌20min，备用；
2)菌种准备及收集：菌种经营养琼脂液体培养基培养，培养条件为28℃，150rpm，培养2d，用50mL离心管离心收集菌体，并用灭菌蒸馏水洗涤菌体后再次收集；
3)预冻：-80℃冰箱预冻1-2h；
4)冷冻干燥：将预冻后的样品离心管去掉盖子，顶部捆上无菌封口膜，封口膜上打几个小孔，以利于冻干过程中水分排出，将处理好的样品置于已预冷30min的FD-1-50真空冷冻干燥机的干燥盘内，再将有机玻璃罩盖上，开始冷冻干燥，直至离心管内冻干物呈酥块状或松散片状，时间为8-20h；
5)收集分装：将50mL离心管内冷冻干燥好的菌体无菌条件下分装至1.5mL离心管内，无菌封口膜封口并标记好菌种名、时间，分装好的冻干菌体-20℃保藏。
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