CN101538605B - 一种以高效氯氟氰菊酯为底物的降解菌株的筛选方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物降解农药残留领域，具体的说是一种以高效氯氟氰菊酯为底物的降解菌株的筛选方法。所述筛选方法为将采集的菌样富集驯化、筛选、分离纯化、强化得到以高效氯氟氰菊酯为唯一碳源生长的降解菌的方法。本发明提供的方法能高效，便捷地筛选出目的活性降解菌。为制备相关降解菌剂、酶制剂提供了菌种资源。
Description
技术领域
本发明属于生物降解农药残留领域，具体的说是一种以高效氯氟氰菊酯为底物的降解菌株的筛选方法。
技术背景
高效氯氟氰菊酯商品名为功夫菊酯，属于拟除虫菊酯类杀虫剂中含氟的一种新型农药。由于可兼治螨类，并且用量远远低于有机磷类杀虫剂，深受农民的欢迎。
在大量推行该类农药使用的同时，也发现了其负面效应。根据我国农药毒性分级标准，功夫菊酯属中等毒性杀虫剂。对鸟类低毒，对蜜蜂、蚕、鱼类及水生生物剧毒。研究表明，功夫菊酯攻毒可以使鲤鱼红细胞的渗透脆性增加，降低红细胞膜的流动性，抑制红细胞ATP酶的活性，使红细胞形态发生改变，并使红细胞核的核膜发生溶解。对鱼类抗氧化系统损伤作用明显。虾体受其影响表现为无氧代谢加强，有氧代谢和酯类降解代谢减弱，正常的物质代谢平衡被破坏，机体所需能量减少，免疫力和抵抗外界环境的能力均明显降低；由于功夫菊酯影响，有可能诱发虾病的爆发或导致虾的大批量死亡。
一般认为功夫菊酯对哺乳类动物是安全的，但是这类化学农药的大量使用造成了环境的严重污染、生态平衡的严重破坏，从而危害了人类健康。尤其是谷物、水果、蔬菜等食品中残留的低浓度农药进入人体所造成的慢性和亚慢性毒性问题，更不可忽视。为此，相关标准也有了严格的规定。欧盟在进口茶叶农残新标准中，将功夫菊酯残留量定为1mg/kg。中华人民共和国国家标准GB18406.1-2001农产品安全质量无公害蔬菜安全要求指出，功夫菊酯在叶类菜农药中最高残留量为0.2mg/kg。
由于功夫菊酯的大范围使用，不仅使农田生态系统受损，而且对水生生物也造成了危害。因此，筛选出可以高效率降解功夫菊酯的微生物，降低作物农药残留量，减少对水生生物的影响，成为了迫切要求深入探讨与解决的问题。
从目前杀虫剂类微生物降解研究现状来看，国内外对降解菌株的分离筛选和代谢途径研究取得了一些进展，但在拟除虫菊酯类的微生物降解方面研究相对比较薄弱，分离获得能够降解拟除虫菊酯类的菌株很少。相关降解菌剂，酶制剂未见报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种以高效氯氟氰菊酯为底物的降解菌株的筛选方法。
为实现上述目的，本发明所采用的技术方案为：
筛选方法：
1)菌样的富集驯化：将5-10g菌样接种于含高效氯氟氰菊酯的80-100ml富集培养基中进行转接培养，每次转接培养条件为25-30℃、130-200r/min摇床培养5-10天，共转接4-7次，转接量按体积百分比计每次培养液5-10％接种于含高效氯氟氰菊酯逐渐增加的80-100ml富集培养基中，待用；其中高效氯氟氰菊酯首次加入量25mg/L，而后以25-50mg/L逐渐增加，菌样首次加入富集培养基中同时加入10-20粒玻璃珠；
2)筛选：按体积百分比5-20％的接种量将步骤1)中的富集培养菌液接种于含终浓度为50-150mg/L高效氯氟氰菊酯的60-100ml基础培养基中，进行转接培养，每次转接培养条件为25-30℃下以130-200r/min摇床培养5-10天，共转接4-7次，得到以高效氯氟氰菊酯为唯一碳源的混合菌液，待用；
3)分离纯化：将筛选所得的以高效氯氟氰菊酯为唯一碳源的混合菌液稀释105-109倍，涂布于普通培养基上，于25-30℃培养2-4天，分别挑取形态不同的菌落在普通培养基上划线纯化；
4)强化：将步骤3)中分离纯化好的单一菌株划线到含终浓度为50-150mg/L的高效氯氟氰菊酯的基础培养基平板上，在25-30℃下培养3-5天，得到以高效氯氟氰菊酯为底物的降解菌株。
所述富集培养基为蛋白胨8-10g，NaCl 0.8-1.0g，KH2PO4 0.8-1.0g，葡萄糖1.0-1.2g，H2O 1000ml，pH＝6.8-7.2；
所述基础培养基为NH4NO3 0.8-1.0g，MgSO4·7H2O 0.4-0.6g，(NH4)2SO40.4-0.6g，NaCl，0.4-0.6g，KH2PO4 0.4-0.6g，K2HPO4 1.2-1.8g，FeCl3 0.005-0.01g，H2O 1000ml，pH＝6.8-7.2；
所述普通培养基为牛肉膏4.0-6.0g，蛋白胨8-12g，NaCl 4.0-6.0g，琼脂15-20g，H2O 1000ml，pH＝7.0-7.2。
将得到以高效氯氟氰菊酯为底物的降解菌株在普通培养基中振荡培养至OD600＝1.0，而后按体积百分比计取5-15％的菌液，将菌液以12000-6000r/min，5-15min离心后接种到含高效氯氟氰菊酯终浓度为50-150mg/L的80-100ml基础培养基中，25-30℃，130-200r/min振荡培养3-5天，取菌液以12000-6000r/min，5-15min离心取上清液经石油醚萃取，萃取液采用278nm下紫外和/或气相色谱鉴定以高效氯氟氰菊酯为底物的降解菌株的降解能力。所述气相色谱条件为：色谱柱：HP-5，30×0.32mm毛细管柱；柱温程序升温：150℃，保持2min，而后以6-8℃/min速度升温至250-270℃；进样口温度：200-220℃；检测器温度：250-320℃；载气：氮气，纯度≥99.999％，流速为1-10mL/min；不分流进样。所述高效氯氟氰菊酯先经有机溶剂溶解，然后用0.22μm滤膜过滤，过滤后待有机溶剂挥发，加入相应培养基。所述有机溶剂为丙酮、甲醇、正己烷或石油醚。所述基础培养基配制时将含有磷酸根的试剂与不含磷酸根的试剂分开灭菌。
本发明具有的优点：
1.本发明筛选方法简易可行，经济实用，所得的菌株可用来制备降解高效氯氟氰菊酯的菌剂以及进一步制备酶制剂，在实践中有良好的使用前景。
2.本发明提供的紫外分光光度法与气相色谱相结合测定降解活性的方法，在筛选大规模菌株时可降低成本，精确高效，可行性高。
3.本发明提供的降解高效氯氟氰菊酯菌株的筛选方法可用于其它菊酯类降解菌株的筛选。
附图说明
图1为高效氯氟氰菊酯紫外测定标准曲线图。
图2为高效氯氟氰菊酯气相色谱标准曲线图。
具体实施方式
实施例1
粘质沙雷氏菌具有降解高效氯氟氰菊酯的作用。
高效氯氟氰菊酯降解菌的筛选：
1)菌样品采集：采自辽宁省沈阳市苏家屯区沙河镇农药厂内土壤。
2)富集驯化：将10g菌样接种于含高效氯氟氰菊酯的100ml富集培养基中进行转接培养，每次转接培养条件为30℃、180r/min摇床培养7天，共转接4次，转接量按体积百分比计每次培养液10％接种于含高效氯氟氰菊酯逐渐增加的100ml富集培养基中，待用；其中高效氯氟氰菊酯以25mg/L逐渐增加，4次转接过程中高效氯氟氰菊酯分别为25，50，75，100mg/L，菌样首次加入富集培养基中同时加入15粒玻璃珠；
所述富集培养基为：蛋白胨10g；NaCl 1.0g；KH2PO4 1.0g；葡萄糖1.0g；H2O 1000ml；pH＝7.0；高效氯氟氰菊酯为先经丙酮溶解，然后用孔径：0.22μm滤膜过滤，过滤后的高效氯氟氰菊酯待丙酮挥发后加入到灭菌后的培养基中。
2)筛选：按体积百分比20％的接种量将种步骤1)中的富集培养菌液接种于含终浓度为150mg/L高效氯氟氰菊酯的100ml基础培养基中，进行转接培养，每次转接培养条件为30℃下以180r/min摇床培养7天，共转接7次，每次转接时的基础培养基中高效氯氟氰菊酯量不变，得到以高效氯氟氰菊酯为唯一碳源的混合菌液，待用；
基础培养基为NH4NO3 1.0g，MgSO4·7H2O 0.5g，(NH4)2SO4 0.5g，NaCl0.5g；KH2PO4 0.5g；K2HPO4 1.5g；FeCl3 0.006g；H2O 1000ml；pH＝7.0；每次转接的基础培养基中含高效氯氟氰菊酯的浓度相同；基础培养基配制时将含磷酸根与不含有磷酸根试剂分开灭菌(灭菌条件为121℃，20min)。
3)分离纯化：将筛选所得的以高效氯氟氰菊酯为唯一碳源的混合菌液稀释105-109倍，涂布于普通培养基固体平板上，于30℃培养3天，分别挑取形态不同的菌落在普通培养基上划线纯化；普通培养基为牛肉膏5.0g，蛋白胨10g，NaCl 5.0g，琼脂20g，H2O 1000ml，pH 7.0-7.2。
4)强化：将步骤3)中分离纯化好的单一菌株划线到含终浓度为100mg/L的高效氯氟氰菊酯的基础培养基平板上，在30℃下培养3天，生长出的菌落即为得到以高效氯氟氰菊酯为底物的16株降解菌。
实施例2
菌株降解能力的鉴定
1.紫外分光光度法
1)标准曲线绘制：将高效氯氟氰菊酯标准品溶于正己烷中，配制成不同浓度(参见表1)标准溶液，在278nm下测定吸光度，绘制标准曲线为y＝0.0041x+0.0012 R2＝0.9999(参见图1)。
表1标准曲线测定值
| 浓度mg/l | 278nm吸光值 |
| 0.002202 | 0 |
| 0.110008 | 0.0066 |
| 0.05504 | 0.0023 |
| 0.2752 | 0.00325 |
| 1.376 | 0.0072 |
| 6.88 | 0.0265 |
| 34.4 | 0.1369 |
| 172 | 0.70115 |
2)鉴定降解活性：将筛选出的以高效氯氟氰菊酯为底物的16株降解菌在普通培养基中振荡培养至OD600＝1.0，而后按体积百分比计取10％的菌液，将菌液离心(6000r/min，10min)后接种到含高效氯氟氰菊酯终浓度为100mg/L的100ml基础培养基中，30℃，180r/min振荡培养3天，取菌液离心(6000r/min，10min)取2ml上清液，将上清液用石油醚以4ml，4ml，3ml分别萃取，待石油醚相挥发后用正己烷定容至10ml，经278nm下测定吸光度，通过标准曲线换算高效氯氟氰菊酯浓度(参见表2)，计算降解率(计算公式)。
16株菌株中降解率较高的菌株Xs降解率为68.58％。通过菌株形态观察、生理生化实验鉴定、16s rDNA序列测定和Neighbor-Joining方法构建系统发育树综合分析得出鉴定结果，Xs菌为粘质沙雷氏菌(Serratiamarcescens)。
表2紫外检测筛选菌株对高效氯氟氰菊酯的降解率
| 菌种 | 降解率 | 菌种 | 降解率 |
| Xs | 68.58％ | Ff1-1 | 35.64％ |
| Fh3-1 | 45.34％ | Ff1-2 | 31.44％ |
| Fw3 | 44.67％ | Fs3 | 23.60％ |
| Ff1-2-1 | 44.49％ | Ff1-2-2 | 23.33％ |
| Fs2 | 40.93％ | Fh1 | 17.61％ |
| Fs1 | 39.45％ | Fw1 | 17.15％ |
| Fh2 | 37.26％ | Fh3 | 11.20％ |
| Ff3 | 37.26％ | Ff4 | 8.33％ |
2.气相色谱检测：
1)标准曲线：将高效氯氟氰菊酯溶于色谱纯正己烷，配制成1，10，50，100mg/L标准溶液，绘制标准曲线为y＝379402x-262219 R2＝1(参见图2)。
2)样品处理：将筛选出的以高效氯氟氰菊酯为底物的16株降解菌在普通培养基中振荡培养至OD600＝1.0，而后按体积百分比计取10％的菌液，将菌液离心(6000r/min，10min)后接种到含高效氯氟氰菊酯终浓度为100mg/L的100ml基础培养基中，30℃，180r/min振荡培养3天，取菌液离心(6000r/min，10min)取2ml上清液，将上清液用石油醚以4ml，4ml，3ml分别萃取，氮气吹干后，经弗罗里矽柱处理，之后再经氮气吹干，用色谱纯正己烷定容至5ml而后经气相色谱测定(参见3)，计算降解率(按照上述公式计算)。16株菌株中降解率较高的菌株Xs降解率为82.74％。通过菌株形态观察、生理生化实验鉴定、16s rDNA序列测定和Neighbor-Joining方法构建系统发育树综合分析得出鉴定结果，Xs菌为粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)。
表3气相色谱检测筛选菌株对高效氯氟氰菊酯的降解率
| 菌种 | 降解率 | 菌种 | 降解率 |
| Xs | 82.74％ | Ff1-1 | 41.36％ |
| Fh3-1 | 62.59％ | Ff1-2 | 37.89％ |
| Fw3 | 60.48％ | Fs3 | 29.93％ |
| Ff1-2-1 | 59.73％ | Ff1-2-2 | 29.08％ |
| Fs2 | 54.31％ | Fh1 | 20.81％ |
| Fs1 | 49.79％ | Fw1 | 20.79％ |
| Fh2 | 45.12％ | Fh3 | 14.38％ |
| Ff3 | 44.92％ | Ff4 | 12.58％ |
所述气相色谱条件：色谱柱：HP-5，30×0.32mm毛细管柱；柱温程序升温：150℃(保持2min)以6℃/min速度升温至270℃(保持8min)；进样口温度：200℃；检测器温度：320℃；载气：氮气，纯度≥99.999％，流速为1mL/min；不分流进样。
上述菌株降解能力的鉴定可采用紫外分光光度法或气相色谱法，或同时采用紫外分光光度法和气相色谱法。
实施例3
与实施例1不同之处在于：
1)富集驯化：将5g菌样接种于含高效氯氟氰菊酯的80ml富集培养基中进行转接培养，每次转接培养条件为25℃、130r/min摇床培养5天，共转接7次，转接量按体积百分比计每次培养液5％接种于含高效氯氟氰菊酯逐渐增加的80ml富集培养基中，待用；其中高效氯氟氰菊酯以30mg/L逐渐增加，7次转接过程中高效氯氟氰菊酯分别为25，55，85，115、145、175、205mg/L，菌样首次加入富集培养基中同时加入10粒玻璃珠；所述富集培养基为：蛋白胨8g，NaCl 0.8g，KH2PO4 0.8g，葡萄糖1.0g，H2O 1000ml，pH＝6.8。
2)筛选：按体积百分比5％的接种量将种步骤1)中的富集培养菌液接种于含终浓度为50mg/L高效氯氟氰菊酯的60ml基础培养基中，进行转接培养，每次转接培养条件为25℃下以130r/min摇床培养5天，共转接5次，得到以高效氯氟氰菊酯为唯一碳源的混合菌液，待用；基础培养基为NH4NO30.8g，MgSO4·7H2O 0.4g，(NH4)2SO4 0.4g，NaCl 0.4g，KH2PO4 0.4g，K2HPO41.2g，FeCl3 0.005g，H2O 1000ml，pH＝6.8。
实施例4
与实施例1不同之处在于：
1)富集驯化：将7g菌样接种于含高效氯氟氰菊酯的90ml富集培养基中进行转接培养，每次转接培养条件为27℃、200r/min摇床培养10天，共转接5次，转接量按体积百分比计每次培养液5％接种于含高效氯氟氰菊酯逐渐增加的90ml富集培养基中，待用；其中高效氯氟氰菊酯以50mg/L逐渐增加，7次转接过程中高效氯氟氰菊酯分别为25，75，125，175、225mg/L，菌样首次加入富集培养基中同时加入20粒玻璃珠；所述富集培养基为：蛋白胨10g，NaCl 1.0g，KH2PO4 1.0g，葡萄糖1.2g，H2O 1000ml，pH＝7.2。
2)筛选：按体积百分比20％的接种量将种步骤1)中的富集培养菌液接种于含终浓度为150mg/L高效氯氟氰菊酯的80ml基础培养基中，进行转接培养，每次转接培养条件为27℃下以200r/min摇床培养10天，共转接7次，得到以高效氯氟氰菊酯为唯一碳源的混合菌液，待用；基础培养基为NH4NO31.0g，MgSO4.7H2O 0.6g，(NH4)2SO4 0.6g，NaCl 0.6g，KH2PO4 0.6g，K2HPO4 1.8g，FeCl3 0.01g，H2O 1000ml，pH＝7.2。
实施例5
与实施例2不同之处在于：将得到以高效氯氟氰菊酯为底物的降解菌株在普通培养基中振荡培养至OD600＝1.0，而后按体积百分比计取5％的菌液，将菌液以12000r/min，5min离心后接种到含高效氯氟氰菊酯终浓度为150mg/L的80ml基础培养基中，25℃，130r/min振荡培养5天，取菌液以12000r/min，5min离心取上清液经石油醚萃取，萃取液采用278nm下紫外和/或气相色谱鉴定以高效氯氟氰菊酯为底物的降解菌株的降解能力。
Claims (6)
1.一种以高效氯氟氰菊酯为底物的降解菌株的筛选方法，其特征在于：
1)菌样的富集驯化：将5-10g菌样接种于含高效氯氟氰菊酯的80-100ml富集培养基中进行转接培养，每次转接培养条件为25-30℃、130-200r/min摇床培养5-10天，共转接4-7次，转接培养按体积百分比计每次转接量为培养液的5-10％，将其接种于含逐渐增加的高效氯氟氰菊酯的80-100ml富集培养基中，待用；其中高效氯氟氰菊酯首次加入量25mg/L，而后以25-50mg/L的增加量逐渐增加，菌样首次加入富集培养基中时同时加入10-20粒玻璃珠；
2)筛选：按体积百分比5-20％的接种量将步骤1)中的富集培养菌液接种于含终浓度为50-150mg/L高效氯氟氰菊酯的60-100ml基础培养基中，进行转接培养，每次转接培养条件为25-30℃下以130-200r/min摇床培养5-10天，共转接4-7次，得到以高效氯氟氰菊酯为唯一碳源的混合菌液，待用；
3)分离纯化：将筛选所得的以高效氯氟氰菊酯为唯一碳源的混合菌液稀释105-109倍，涂布于普通培养基上，于25-30℃培养2-4天，分别挑取形态不同的菌落在普通培养基上划线纯化；
4)强化：将步骤3)中分离纯化好的单一菌株划线到含终浓度为50-150mg/L的高效氯氟氰菊酯的基础培养基平板上，在25-30℃下培养3-5天，得到以高效氯氟氰菊酯为底物的降解菌株；
所述富集培养基为蛋白胨8-10g，NaCl0.8-1.0g，KH2PO4 0.8-1.0g，葡萄糖1.0-1.2g，H2O 1000ml，pH＝6.8-7.2；
所述基础培养基为NH4NO3 0.8-1.0g，MgSO4·7H2O 0.4-0.6g，(NH4)2SO40.4-0.6g，NaCl0.4-0.6g，KH2PO40.4-0.6g，K2HPO41.2-1.8g，FeCl30.005-0.01g，H2O 1000ml，pH＝6.8-7.2；
所述普通培养基为牛肉膏4.0-6.0g，蛋白胨8-12g，NaCl4.0-6.0g，琼脂15-20g，H2O1000ml，pH＝7.0-7.2。
2.按权利要求1所述的以高效氯氟氰菊酯为底物的降解菌株的筛选方法，其特征在于：将得到的以高效氯氟氰菊酯为底物的降解菌株接种在普通培养基中振荡培养至OD600＝1.0，而后按体积百分比计取5-15％的菌液，将菌液以12000-6000r/min，5-15min离心后接种到含高效氯氟氰菊酯终浓度为50-150mg/L的80-100ml基础培养基中，25-30℃，130-200r/min振荡培养3-5天，取菌液以12000-6000r/min，5-15min离心取上清液经石油醚萃取，萃取液采用278nm下紫外和/或气相色谱鉴定，以鉴定高效氯氟氰菊酯为底物的降解菌株的降解能力。
3.按权利要求2所述的以高效氯氟氰菊酯为底物的降解菌株的筛选方法，其特征在于：所述气相色谱条件为：色谱柱：HP-5，30×0.32mm毛细管柱；柱温程序升温：150℃，保持2min，而后以6-8℃/min速度升温至250-270℃；进样口温度：200-220℃；检测器温度：250-320℃；载气：氮气，纯度≥99.999％，流速为1-10mL/min；不分流进样。
4.按权利要求1所述的以高效氯氟氰菊酯为底物的降解菌株的筛选方法，其特征在于：所述高效氯氟氰菊酯先经有机溶剂溶解，然后用0.22μm滤膜过滤，过滤后待有机溶剂挥发，加入相应培养基。
5.按权利要求4所述的以高效氯氟氰菊酯为底物的降解菌株的筛选方法，其特征在于：所述有机溶剂为丙酮、甲醇、正己烷或石油醚。
6.按权利要求1所述的以高效氯氟氰菊酯为底物的降解菌株的筛选方法，其特征在于：所述基础培养基配制时将含有磷酸根的试剂与不含磷酸根的试剂分开灭菌。
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2008
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