CN101139559A - 一株高效降解菊酯类及有机磷农药的新菌株及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明属于化学农药生物降解技术领域,涉及一株对菊酯类、有机磷、阿维菌素农药高效降解的菌株及其用途。该菌株为不动杆菌(Acinetobacter sp.)JCX22D菌株,菌株生物学特性为革兰氏阴性,无鞭毛,短杆状,有酯酶、脂肪酶活性,无氧化酶活性,能利用葡萄糖、果糖。菌株对氨卞青霉素、低浓度的壮观霉素和氯霉素有抗性,对利富平无抗性。菌株对高效氯氰菊酯、三氟氯氰菊酯、溴氰菊酯、联苯菊酯农药的降解效率大于72%,对二嗪磷、甲基对硫磷、辛硫磷、毒死蜱的降解效率大于70%,对阿维菌素的降解率为90%。该菌株可用于上述农药的生物降解,以及农药污染的水体、土壤及农产品的生物修复或生物净化。
Description
技术领域
本发明属于化学农药生物降解技术领域,涉及一株对菊酯类、有机磷、阿维酶素具高效降解能力的新菌及其用途,用于高效氯氰菊酯、三氟氯氰菊酯、溴氰菊酯、联苯菊酯、二嗪磷、甲基对硫磷、辛硫磷、毒死蜱、阿维菌素农药的生物降解,以及这些农药污染的水体、土壤及农产品的生物修复和生物净化。
背景技术
化学杀虫剂是用于控制害虫的一关有毒化合物,在农业产生产中具有重要的作用。我国农药杀虫剂产量占全国农药总产量的60%,其主要品种为有机磷和拟除虫菊酯等。
我国蔬菜、茶叶、果树上广泛使用菊酯类和有机磷农药,在挽回产量损失的同时,农药的污染和残留问题也十分严重,农药在农产品中的累积直接对人体健康构成危害,农药残留在农田可造成面源污染,对水体中的鱼类和中性生物等造成毒害。在农产品中的农药残留超标还直接影响农产品出口贸易。
我国进入WTO以来,国际贸易日益频繁,农药残留限量标准已成为国际食品和农产品贸易的绿色壁垒,我国农产品的出口正面临着严峻的挑战。在我国出口的农副产品中,因农药的残留问题而导致的贸易损失每年超过百亿美元,损失巨大。从出口创汇产品看,茶叶、蔬菜、水果、烟草等大宗产品由于农药残留超标而不得不减少出口。欧盟2003年制订的标准中除对有机磷作出严格的限制外,对认为低毒的菊酯类农药检测标准也提高到每公斤1毫克以下,对以前不作要求的生物农药阿维菌素也制订了每公斤不超过0.02毫克的苛刻标准。
目前,从我国农业生产的实际情况出发,不使用农药来实现无污染是可能的。因此,利用微生物来降解农田环境及农产品中的农药残留具有重要意义,特别是针对菊酯类和有机磷类农药筛选得到的高效降解菌株,其应用价值和经济意义更为明显。应用生物降解技术解决农药污染问题,亦具有显著的社会和生态效益。
发明内容
本发明的目的在于针对农业生产实践中的实际问题和需求,提供一株新型农药降解菌株,该菌株分离自江苏常州市农药厂排污口土样,对菊酯类、有机磷类和阿维菌素农药具有高效降解能力。本发明的另一目的为提供应用本发明菌株降解菊酯类、有机磷类和阿维菌素农药的方法。
本发明的技术方案概述如下:
本发明提供一株对菊酯类、有机磷及阿维菌素农药具有高效降解能力的降解菌株,该微生物为不动杆菌属(Acinetobacter sp.)的菌株JCX22D,2006年8月30日保藏于《中国微生物菌种保存管理委员会普通微生物中心》,菌种保藏号为:CGMCC No.1793。
该菌株革兰氏染色阴性,无鞭毛,短杆状,菌落呈白色圆点状且表面光滑,有酯酶、脂肪酶活性,无氧化酶活性,能利用葡萄糖、果糖。该菌株能以拟除虫菊酯、有机磷、阿维菌素等农药为唯一碳源。该菌株在4℃~50℃,pH 7.0~9.0范围内均可生长,但最适生长温度为28℃,最适生长 pH值为8.0。该菌株对菊酯农药的耐受浓度可以达到0.5g/L,最适生长的农药浓度为0.2g/L。
该菌株对氨卞青霉素(Amp)、较低浓度壮观霉素(Spc)低浓度氯霉素(Cm)有抗性,对利富平(Rif)无抗性。对高效氯氰菊酯、三氟氯氰菊酯、溴氰菊酯、联苯菊酯等菊酯类农药降解能力达到70%以上;对二嗪磷、甲基对硫磷、毒死蜱、辛硫磷等有机磷农药降解能力超过70%以上;对阿维菌素的降解效率达90%以上。
经Biolog试验和16S rDNA序列分析,该菌株鉴定为:Acinetobacter sp(不动杆菌)。
菌株分离与筛选
土样:采自江苏常州市农药厂排污口受菊酯等农药长期污染的土壤。
菌株的富集与分离:本发明所述培养基为:Burk无机盐培养基(1000mL):K2HPO4 0.2g;KH2PO4 0.8g;MgSO4 0.2g;CaSO4.2H2O 0.1g;NaMOO1.2H2O 0.0033g;FeSO4.7H2O 0.005g;(NH4)2SO4 1g;pH 7.2。(固体培养基再加入1.2~1.5%的琼脂粉);筛选培养基:Burk无机盐培养基+农药
取菊酯类农药污染的污泥4份,分别拌匀,各取5g,在无菌操作条件下,制成20%的菌悬液,并加入适量灭菌玻璃珠,在28℃、180rpm摇床上振荡6~8h,静置一段时间后,按5%的接种量取上层菌悬液,接种到30mL的液体筛选培养基中,农药浓度为0.1g/L。置于28℃、180rpm摇床培养;每隔7d按5%的接种量将其转接到另一批液体筛选培养基中,相同条件下摇床培养7d,且培养过程中农药的浓度逐步提高,每次提高0.1g/L,驯化培养1月。
取驯化培养1月后的培养物,稀释10-6涂布于筛选平板上,农药浓度为0.2g/L,置于28℃恒温培养箱中培养72h,选取在农药培养基中生长快,菌落规则,传代稳定的单菌落转入斜面保存,进行生理、生化及分子鉴定。
菌株生化鉴定
生理、生化鉴定(菌株Biolog鉴定结果,委托中国农业科学院农业菌种保存中心鉴定)
表1 JCX22D菌株的Biolog鉴定
SPECIES | PROB | SIM | DIST | TYPE | OXI(±) |
Acinetobacter GnnospeciesBurkholderia CocovenenansBukholderia VietnamiensisAcinetobacter GnnospeciesRalstonia PickettiiPseudomonas MendocinaAcinetobacter Junii/GnnospeciesPseudomonas SynxanthaPseudomonas Fluorescns BiotypePseudomonas Bathycetes | 100000000000 | 0.8180.0000.0000.0000.0000.0000.0000.0000.0000.000 | 2.725.325.526.566.637.047.167.267.557.65 | GN-NENTGN-NENTGN-NENTGN-NENTGN-NENTGN-NENTGN-NENTGN-NENTGN-NENTGN-NENT | OXI+OXI+OXI+OXI-OXI+OXI+OXI-OXI+OXI+OXI+ |
菌株的分子鉴定
JCX22D菌株的16SrDNA序列经测序,得到如下序列:
agagtttgatcatggctcagattgaacgctggcggcaggcttaacacatgcaagtcgagcggagagaggtagcttgctact-gatcttagcggcggacgggtgagtaatgcttaggaatctgcctattagtgggggacaacatttcgaaaggaatgctaataccgcatacgtcctacgggagaaagcaggggatcttcggaccttgcgctaatagatgagcctaagtcggattagctagttggtggggtaaaggcctaccaaggcgacgatctgtagcgggtctgagaggatgatccgccacactgggactgagacacggcccagactcctacgggaggcagcagtggggaatattggacaatgggcgcaagcctgatccagccatgccgcgtgtgtgaagaaggccttatggttgtaaagcactttaagcgaggaggaggctactttagttaatacctagagatagtggacgttactcgcagaataagcaccggctaactctgtgccagcagccgcggtaatacagagggtgcaagcgttaatcggatttactgggcgtaaagcgcgcgtaggcggctaattaagtcaaatgtgaaatccccgagcttaacttgggaattgcattcgatactggttagctagagtgtgggagaggatggtagaattccaggtgtagcggtgaaatgcgtagagatctggaggaataccgatggcgaaggcagccatctggcctaacactgacgctgaggtgcgaaagcatggggagcaaacaggattagataccctggtagtccatgccgtaaacgatgtctactagccgttggggcctttgaggctttagtggcgcagctaacgcgataagtagaccgcctggggagtacggtcgcaagactaaaactcaaatgaattgacgggggcccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgatgcaacgcgaagaaccttacctggccttgacatagtaagaactttccagagatggattggtg-cttcgggaacttacatacaggtgctgcatggctgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaacccttttccttatttgccagcgagtaatgtcgggaactttaaggatactgccagtgacaaactggaggaaggcggggacgacgtcaagtcatcatggcccttacggccagggctacacacgtgctacaatggtcggtacaaagggttgctacctagcgataggatgctaatctcaaaaagccgatcgtagtccggattggagtctgcaactcgactccatgaagtcggaatcgctagtaatcgcggatcagaatgccgcggtgaatacgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcacaccatgggagtttgttgcaccagaagtagctagcctaactgcaaagagggcggttaccacggtgtggccgatgactggggtgaagtcgtaacaaggtaacc
登陆Genebank,进行JCX22D菌株16SrDNA的BLAST比较分析(结果见表2)。BLAST比较分析结果表明:该菌株的16S rDNA序列与不动杆菌属的同源性极高(98%),因此JCX22D菌株在分子分类上鉴定为不动杆菌属(Acinetobacter)。
表2 JCX22D菌株16SrDNA基因序列的BLAST比较
Bacterium strains | Genebank Accession No. | Identity |
Acinetobacter sp.TUT1001Acinetobacter sp.KS2Acinetobacter calcoaceticusUncultured Acinetobacter sp.Clone MHP1_PitestiUncultured Acinetobacter sp.Clone FH101_PitestiAcinetobacter sp.PHD-4Acinetobacter calcoaceticuspartialAcinetobacter sp.PALXIL10Acinetobacter sp.DR.Y12Acinetobacter calcoaceticusAcinetobacter sp.SMCCB0208Acinetobacter baumanniistrain Ab8 | AB098569.1DQ345292.1AF159045.1DQ366106.1DQ366092.1DQ227342.1AJ888983.1DQ411820.1DQ226213.1AF417872.1AF500278.1AY847284.1 | 1498/1498(100%)1498/1498(100%)1495/1498(99%)1493/1496(99%)1493/1496(99%)1493/1497(99%)1483/1484(99%),1489/1496(99%)1455/1457(99%)1453/1455(99%)1457/1461(99%)1436/1437(99%) |
菌株的抗生素抗性检测
JCX22D菌株在几种不同浓度抗生素的生长情况见表3。从表3可以看出对氨卞青霉素(Amp)、较低浓度壮观霉素(Spc)低浓度氯霉素(Cm)有抗性,对利富平(Rif)无抗性。
表3 JCX22D菌株在不同抗生素浓度下的生长情况
氨卞青霉素(Amp) | 壮观霉素(Spc) | 氯霉素(Cm) | 利富平(Rif) | |
25ug/ml50ug/ml75ug/ml100ug/ml150ug/ml200ug/ml | ++++++ | +++--- | +----- | ------ |
+:生长良好;-:不生长
菌株的生物降解作用(用途)
该菌株用途是降解菊酯类、有机磷类和阿维菌素农药,适用于农药污染的水体、土壤及农产品的生物修复或生物净化。
具体实施方式
实施例1:JCX22D菌株生物降解菊酯农药
JCX22D在LB培养基中培养至对数生长期,以2%接种量分别接入高效氯氰菊酯、三氟氯氰菊酯、溴氰菊酯、联苯菊酯均为200mg/l的基础盐培养基中,28℃,180rpm恒温振荡器振荡培养,按一定的培养时间取样,样品立即用环己烷萃取,气相色谱仪(Trace GC)测定农药残留,检测器为电子俘获器(ECD)。测定结果见表4。
表4 JCX22D菌株对四种拟除虫菊酯类农药的降解率
农药种类 | 初始浓度(g/L) | 观察项目 | 培养时间(h) | ||||
24 | 48 | 60 | 84 | 108 | |||
高效氯氰菊酯三氟氯氰菊酯溴氰菊酯联苯菊酯 | 0.20.20.20.2 | 对照浓度(g/L)样品浓度(g/L)降解效率(%)对照浓度(g/L)样品浓度(g/L)降解效率(%)对照浓度(g/L)样品浓度(g/L)降解效率(%)对照浓度(g/L)样品浓度(g/L)降解效率(%) | 0.1800.05072.00.1760.09546.00.1900.10246.30.1870.09549.2 | 0.1720.04275.60.1740.05071.20.1920.09252.10.1800.06961.7 | 0.1700.04175.80.1700.04871.80.1870.07062.60.1780.06464.0 | 0.1680.04076.20.1660.04075.90.1620.04174.70.1770.06265.0 | 0.1620.03876.50.1620.03677.80.1600.04075.00.1650.04970.3 |
实施例2:JCX22D菌株生物降解有机磷农药
JCX22D在LB培养基中培养至对数生长期,以2%接种量分别接入辛硫磷、甲基对硫磷、毒死蜱和二嗪磷均为200mg/l的基础盐培养基中,28℃、180rpm恒温培养,按一定的培养时间取样,环己烷萃取,使用UV-VIS 8500双光束紫外/可见分光光度计进行波长扫描,通过样品与对照的比较来确定农药的降解率。测定结果见表5。
表5 JCX22D菌株对四种有机磷类农药的降解率(%)
24hr | 48hr | 60hr | 84hr | 108hr | |
辛硫磷甲基对硫磷毒死蜱二嗪磷 | 33.44929.160.2 | 48.658.636.275 | 71.173.267.377.8 | 74.374.272.279.1 | 75.87573.880.2 |
实施例3: JCX22D菌株生物降解阿维菌素
JCX22D在LB培养基中培养至对数生长期,以2%接种量分别接入阿维菌素为200mg/l的基础盐培养基中,28℃、180rpm恒温培养,按一定的培养时间取样,三氯甲烷萃取,使用UV-VIS 8500双光束紫外/可见分光光度计进行波长扫描,通过样品与对照的比较来确定农药的降解率。测定结果见表5。
表5 JCX22D菌株对阿维菌素的降解率(%)
培养时间 | 24hr | 48hr | 60hr | 84hr | 108hr |
降解率 | 81.9 | 88.4 | 92.1 | 93.5 | 94 |
实施例4: JCX22D菌株降解土壤和水体中的菊酯农药
高效氯氰菊酯、三氟氯氰菊酯、溴氰菊酯、联苯菊酯4种菊酯农药用丙酮溶解,硅藻土吸附,干燥硅藻土,拌入无菌土壤中,使每公斤土壤含农药量为20mg,按10%的接种量接入对数生长期的JCX22D菌株,搅拌均匀,30℃保温,24小时,环己烷萃取土样中的菊酯农药,气相色谱仪(Trace GC)测定农药残留,检测器为电子俘获器(ECD)。以不加农药的土样为对照。测定结果见表6-1。
高效氯氰菊酯、三氟氯氰菊酯、溴氰菊酯、联苯菊酯4种菊酯农药用丙酮溶解,按20mg/l比例加入无菌水中,按10%的接种量接入对数生长期的JCX22D菌株,30℃保温,24小时,环己烷萃取土样中的菊酯农药,气相色谱仪(Trace GC)测定农药残留,检测器为电子俘获器(ECD)。以不加农药的无菌水为对照。测定结果见表6-2。
表6-1 JCX22D菌株对土样中四种拟除虫菊酯类农药的降解率(%)
菊酯 | 高效氯氰菊酯 | 三氟氯氰菊酯 | 溴氰菊酯 | 联苯菊酯 |
降解率 | 74.1 | 75 | 73.9 | 67.8 |
表6-2 JCX22D菌株对水体中四种拟除虫菊酯类农药的降解率(%)
菊酯 | 高效氯氰菊酯 | 三氟氯氰菊酯 | 溴氰菊酯 | 联苯菊酯 |
降解率 | 77.8 | 78.9 | 77.1 | 71.4 |
实施例5:JCX22D菌株降解土壤和水体中的有机磷农药
辛硫磷、甲基对硫磷、毒死蜱和二嗪磷4种有机磷农药用丙酮溶解,硅藻土吸附,干燥硅藻土,拌入无菌土壤中,使每公斤土壤含农药量为20mg,按10%的接种量接入对数生长期的JCX22D菌株,搅拌均匀,30℃保温,24小时,环己烷萃取土样中的农药,UV-VIS 8500双光束紫外/可见分光光度计进行波长扫描,通过样品与对照的比较来确定农药的降解率。以不加农药的土样为对照。测定结果见表7-1。
辛硫磷、甲基对硫磷、毒死蜱和二嗪磷4种有机磷农药用丙酮溶解,按20mg/l比例加入无菌水中,按10%的接种量接入对数生长期的JCX22D菌株,30℃保温,24小时,环己烷萃取土样中的农药,UV-VIS8500双光束紫外/可见分光光度计进行波长扫描,通过样品与对照的比较来确定农药的降解率。以不加农药的无菌水为对照,测定结果见表7-2。
表7-1 JCX22D菌株对土样中四种有机磷农药的降解率(%)
有机磷 | 辛硫磷 | 甲基对硫磷 | 毒死蜱 | 二嗪磷 |
降解率 | 690.3 | 70.6 | 64.3 | 723.2 |
表7-2 JCX22D菌株对水体中四种有机磷农药的降解率(%)
有机磷 | 辛硫磷 | 甲基对硫磷 | 毒死蜱 | 二嗪磷 |
降解率 | 72.7 | 74.4 | 68.5 | 77.6 |
实施例6:JCX22D菌株降解土壤和水体中的阿维菌素农药
阿维菌素用丙酮溶解,硅藻土吸附,干燥硅藻土,拌入无菌土壤中,使每公斤土壤含农药量为20mg,按10%的接种量接入对数生长期的JCX22D菌株,搅拌均匀;丙酮溶解的阿维菌素按20mg/l比例加入无菌水中。30℃保温,24小时,三氯己烷萃取土样和水体中阿维菌素,UV-VIS 8500双光束紫外/可见分光光度计进行波长扫描,通过样品与对照的比较来确定农药的降解率。分别以以不加阿维菌素的土样和无菌水为对照。测定结果见表8。
表8 JCX22D菌株对土样、水体中阿维菌素农药的降解率(%)
观察项 | 土壤阿维菌素 | 水体阿维菌素 |
降解率 | 84.2 | 89.8 |
Claims (3)
1.一株对菊酯、有机磷及阿维菌素农药高效降解新菌株JCX22D及其用途,其菌株特征为:不动杆菌属(Acinetobacter sp.)的菌株JCX22D,2006年8月30日保藏于“中国微生物菌种保存管理委员会普通微生物中心”,菌种保藏号为:CGMCC No.1793。
2.根据权力要求1所述的菌株JCX22D,该菌株革兰氏染色阴性,无鞭毛,短杆状,有酯酶、脂肪酶活性,无氧化酶活性,能利用葡萄糖、果糖,菌株16SrDNA序列为:
agagtttgatcatggctcagattgaacgctggcggcaggcttaacacatgcaagtcgagcggagagaggtagcttgctact-gatcttagc
ggcggacgggtgagtaatgcttaggaatctgcctattagtgggggacaacatttcgaaaggaatgctaataccgcatacgtcctacgggag
aaagcaggggatcttcggaccttgcgctaatagatgagcctaagtcggattagctagttggtggggtaaaggcctaccaaggcgacgatct
gtagcgggtctgagaggatgatccgccacactgggactgagacacggcccagactcctacgggaggcagcagtggggaatattggacaatg
ggcgcaagcctgatccagccatgccgcgtgtgtgaagaaggccttatggttgtaaagcactttaagcgaggaggaggctactttagttaat
acctagagatagtggacgttactcgcagaataagcaccggctaactctgtgccagcagccgcggtaatacagagggtgcaagcgttaatcg
gatttactgggcgtaaagcgcgcgtaggcggctaattaagtcaaatgtgaaatccccgagcttaacttgggaattgcattcgatactggtt
agctagagtgtgggagaggatggtagaattccaggtgtagcggtgaaatgcgtagagatctggaggaataccgatggcgaaggcagccatc
tggcctaacactgacgctgaggtgcgaaagcatggggagcaaacaggattagataccctggtagtccatgccgtaaacgatgtctactagc
cgttggggcctttgaggctttagtggcgcagctaacgcgataagtagaccgcctggggagtacggtcgcaagactaaaactcaaatgaatt
gacgggggcccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgatgcaacgcgaagaaccttacctggccttgacatagtaagaactttcca
gagatggattggtg-cttcgggaacttacatacaggtgctgcatggctgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgcaac
gagcgcaacccttttccttatttgccagcgagtaatgtcgggaactttaaggatactgccagtgacaaactggaggaaggcggggacgacg
tcaagtcatcatggcccttacggccagggctacacacgtgctacaatggtcggtacaaagggttgctacctagcgataggatgctaatctc
aaaaagccgatcgtagtccggattggagtctgcaactcgactccatgaagtcggaatcgctagtaatcgcggatcagaatgccgcggtgaa
tacgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcacaccatgggagtttgttgcaccagaagtagctagcctaactgcaaagagggcggttac
cacggtgtggccgatgactggggtgaagtcgtaacaaggtaacc
3.根据权利要求1所述的用途,该菌株可用于高效氯氰菊酯、三氟氯氰菊酯、溴氰菊酯、联苯菊酯、二嗪磷、甲基对硫磷、辛硫磷、毒死蜱、阿维菌素农药的生物降解,以及这些农药污染的水体、土壤及农产品的生物修复和生物净化。
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PB01 | Publication | ||
C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20080312 |