CN107118987A - 一种聚磷菌剂及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种聚磷菌剂及其应用，属于生物技术领域。该聚磷菌剂是将转化菌和产酸菌于26‑30℃的条件下培养4‑6天后，筛选对有机磷具有降解作用的转化菌配置成第一菌悬液，筛选对有机磷具有降解作用的产酸菌配置成第二菌悬液，然后再将第一菌悬液和第二菌悬液混合而得。转化菌包括纤维单胞菌和芽孢杆菌中的至少一种，产酸菌包括嗜酸菌。该聚磷菌剂对有机磷具有高效稳定的降解能力，并且对抗污能力强，对污染环境具有较强的适应性。将其应用于有机磷的降解，能有效治理磷污染，环保节能。

Description

一种聚磷菌剂及其应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，且特别涉及一种聚磷菌剂及其应用。
背景技术
伴随着我国化工行业的高速发展，近二十年来，我国磷化工得到了迅速发展，并取得了令人鼓舞的沉积。但是，伴随中磷化工的发展而产生的环境污染状况也日趋严重。
因此，防治磷化工污染，保护生态环境，合理利用不可再生的有限资源，是我国磷化工健康发展所面临的一项迫切任务和重要课题。
现阶段，除磷方法包括化学沉淀法、离子交换法、吸附法、膜分离法和生物法。目前，已有部分用于处理磷污染的微生物菌剂，但是这些微生物菌剂中部分菌剂所含的菌种来源有限，价格昂贵，不适宜普遍使用；部分菌剂所含的菌种繁杂，制备过程和条件难以控制。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种聚磷菌剂，该聚磷菌剂对有机磷具有高效稳定的降解能力，并且对抗污能力强，对污染环境具有较强的适应性。
本发明的另一目的在于提供一种上述聚磷菌剂在降解有机磷中的应用，能够有效治理磷污染，环保节能。
本发明解决其技术问题是采用以下技术方案来实现的：
本发明提出一种聚磷菌剂，是将转化菌和产酸菌于26-30℃的条件下培养4-6天后，筛选对有机磷具有降解作用的转化菌配置成第一菌悬液，筛选对有机磷具有降解作用的产酸菌配置成第二菌悬液，然后再将第一菌悬液和第二菌悬液混合而得。
转化菌包括纤维单胞菌和芽孢杆菌中的至少一种，产酸菌包括嗜酸菌。
本发明还提出一种聚磷菌剂在降解有机磷中的应用，可应用于降解土壤或废水中的有机磷。
本发明较佳实施例中聚磷菌剂的有益效果是：26-30℃条件下培养4-6天后的转化菌和产酸菌形态和数量均较稳定，性能较强。将此阶段的转化菌和产酸菌混合，丰富了聚磷菌剂所包含的有效菌种，提高了聚磷菌剂对有机磷的降解效果，能够适用于不同环境和不同场所的磷降解。对转化菌和产酸菌进行稀释制成菌悬液，可将菌剂中的活菌数维持在适宜的范围，并有效避免了菌悬液中由于菌种浓度过高或过低影响降解效果。故上述聚磷菌剂对有机磷具有高效稳定的降解能力，并且对抗污能力强，对污染环境具有较强的适应性。此外，将其应用于有机磷的降解，能有效治理磷污染，环保节能。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
下面对本发明实施例的聚磷菌剂及其应用进行具体说明。
本发明实施例的聚磷菌剂主要用于降解有机磷，其降解机制如下：聚磷菌剂所含的菌种在好氧条件下，将有机磷转化为主要以不溶性或可溶性磷酸盐的形式存在的无机磷，进而大量吸收无机磷以合成自身核酸、异染颗粒(多聚磷酸盐)以供其体内的内源呼吸使用。此外，上述无机磷还能被其它微生物或植物等利用。
本发明实施例提供的聚磷菌剂主要包括转化菌和产酸菌。作为可选地，上述转化菌例如可以包括纤维单胞菌和芽孢杆菌中的至少一种，产酸菌例如可以包括嗜酸菌。
其中，芽孢杆菌为能形成芽孢的杆菌或球菌，包括芽孢杆菌属、芽孢乳杆菌属、梭菌属、脱硫肠状菌属和芽孢八叠球菌属等。该类细菌对外界有害因子抵抗力强、分布广。芽孢杆菌中的芽孢具有厚实且含水量较低的多层结构，且芽孢中还具有含量较高的吡啶二羧酸，因此使其对热、干燥、辐射和化学消毒剂等具有较强的抗性。本实施例中将芽孢杆菌作为转化菌的组成成分之一，可利用芽孢杆菌具有代谢快和繁殖快的特点，在其增殖的同时，释放出具有高活性的分解酵素，不仅能将难分解的大分子物质分解成可利用的小分子物质，还可以分解产生恶臭气体的有机物质、有机硫化物和有机氮等，对有机磷具有较优的降解效果。
纤维单胞菌属于细菌中的棒状杆菌类，能够产纤维素酶和葡聚糖酶。纤维素是以β-1，4糖苷键连接而成的高分子化合物。自然条件下，土壤可利用的碳源十分有限，从而限制了具有降解有机磷的菌种等一些功能微生物发挥其作用。因此，利用纤维素分解菌分解纤维素类物质，产生的简单糖类物质可作为碳源供其他有益微生物使用，提高具有降解有机磷的菌种的降解能力。此外，本实施例中的转化菌还可以包括生胞食纤维菌、粉状侧孢霉和链霉菌等可以同样分解纤维素的菌种。
较佳地，本实施例中的转化菌同时包括纤维单胞菌和芽孢杆菌。作为可选地，纤维单胞菌和芽孢杆菌的重量比为0.8-1.2：1-3。根据实验测定，单独施用芽孢杆菌的转化菌较联合施用芽孢杆菌和纤维单胞菌的转化菌能提高40％的有机磷降解度。在上述重量比下将两种菌混合，可使转化菌对有机磷的降解效果达到最佳，并避免了菌种的浪费。
承上，同时包括纤维单胞菌和芽孢杆菌的转化菌通过纤维单胞菌分解纤维素等物质生成糖类，为芽孢杆菌提供充足的碳源，从而通过混合菌种的协同作用，提高了转化菌中对有机磷的转化和降解效果。
为进一步提高聚磷菌剂对有机磷的降解程度，本实施例中的聚磷菌剂中还包括了作为产酸菌的嗜酸菌。
由于本实施例中所用到的微生物菌种最适生长pH为5-9，为了扩大本聚磷菌剂的适用范围，在产酸菌中优选加入了嗜酸菌，如氧化亚铁硫杆菌、氧化钩端螺旋菌和铁氧化细菌等。嗜酸菌在极低的pH环境下，甚至在pH低于0的环境中均可生长。嗜酸菌可在酸性环境中通过代谢改变有机磷所存在的环境的离子浓度、pH等物理和化学性质，从而间接促使有机磷降解。除此以外，嗜酸菌还可氧化有机废弃物中的Fe2+为Fe3+，并且还能去除有机废弃物中的部分重金属，如Cu、Zn、Ni和Cd等。
进一步地，本实施例中的产酸菌还可包括不动杆菌。不动杆菌广泛分布于水体和土壤中，易在潮湿环境中生存。部分不动杆菌本身含有降解有机磷的酶系基因，而部分不动杆菌可经诱导或环境选择，致使体内基因发生重组或改变，已产生新的降解酶系。通过降解酶系，释放降解酶，对有机磷进行降解。作为可选地，本实施例中的不动杆菌例如可以选自醋酸钙不动杆菌、鲁菲不动杆菌、鲍曼不动杆菌、溶血不动杆菌、琼氏不动杆菌和约翰不动杆菌中的至少一种。
较佳地，上述嗜酸菌与不动杆菌的重量比例如可以为2-4：0.5-1.5。在上述重量比下将两种菌混合，可使产酸菌对有机磷的降解效果达到最佳，并避免了菌种的浪费。
承上，通过将转化菌和产酸菌混合，可通过各类菌种所具有的不同特性，协同将聚磷菌剂所具有的降解有机磷的作用达到最优。通过验证，将转化菌和产酸菌组合后得到的聚磷菌剂较单独的转化菌或产酸菌对有机磷降解呈现出显著的协同增效作用。
具体地，本实施例中的聚磷菌剂可以通过以下方式得到：
先活化上述转化菌和产酸菌，活化可以是在30-37℃的条件下活化至少24h，具体活化时间可通过观察微生物的生长情况确定，必要时可进行多次活化。较佳地，活化温度为32℃，在此活化温度下，转化菌和产酸菌中所含的菌种均能较好生长。
配制多个牛肉膏蛋白胨液体培养基，以分别与纤维单胞菌、芽孢杆菌、嗜酸菌和不动杆菌对应。此培养基例如可按以下配方配制：牛肉膏2-4g、蛋白胨8-12g、氯化钠4-6g、琼脂15-20g，水1000-1100mL。按上述配比将培养基各配方混合，调节培养基的pH至中性或微碱性(如pH为7.5-8)，以利于细菌生长繁殖。培养基中所含的牛肉膏可为微生物提供碳源和能源，蛋白胨可提供氮源，氯化钠则可提供无机盐。
将上述培养基进行高温灭菌，冷却后，再将活化后的转化菌和产酸菌按不同的菌种类别分别接种于与其对应的牛肉膏蛋白胨液体培养基中培养。例如当转化菌仅含有纤维单胞菌和芽孢杆菌，产酸菌仅含有嗜酸菌和不动杆菌时，即将纤维单胞菌、芽孢杆菌、嗜酸菌和不动杆菌分别接种于4个不同的牛肉膏蛋白胨液体培养基中培养。作为可选地，例如可将接种后的转化菌和产酸菌于26-30℃的条件下培养4-6天，此培养阶段，培养基中的转化菌和产酸菌所产生的菌落数量和长势均较好，性能较强。
对培养后的菌种进行筛选，主要目的是筛选出对有机磷具有较强降解作用的菌，以将聚磷菌剂的降解水平维持在较高范围。
将筛选后的对有机磷具有降解作用的转化菌配置成第一菌悬液，并将筛选对有机磷具有降解作用的产酸菌配置成第二菌悬液，然后再将第一菌悬液和第二菌悬液混合，即得到聚磷菌剂。
为了避免稀释后的第一菌悬液和第二菌悬液中菌种浓度过低，对有机磷的降低效果不佳，本实施例中例如可将转化菌稀释成浊度OD600为0.65-0.85的第一菌悬液，较佳地，第一菌悬液中转化菌的活菌数为0.3-0.6×107cfu/mL。同理，可将产酸菌稀释成浊度OD600为0.65-0.85的第二菌悬液，较佳地，第二菌悬液中产酸菌的活菌数为0.4-0.7×107cfu/mL。
上述浊度范围内的第一菌悬液和第二菌悬液所含菌种的数量，特别是活菌的数量适中，有效避免了菌悬液中由于菌种浓度过高或过低影响降解效果。
较佳地，在混合时，可按第一菌悬液与第二菌悬液的体积比为0.6-1.4：2-3.4混合得到聚磷菌剂。该比例下混合，可使聚磷菌剂中所含的不同菌种所起到的协同作用达到最佳。
经测试，本发明实施例中所制备出的聚磷菌剂的活菌含量至少为1×107cfu/mL。此外，本发明实施例中所制备出的聚磷菌剂在室温(10-40℃)保存1年后，活菌含量至少为1×106cfu/mL，说明本发明实施例中的聚磷菌剂的稳定性较高。
在实际应用中，可将上述聚磷菌剂用于降解有机磷。具体地，例如可以将其用于降解土壤中含有的有机磷农药，或者用于降解废水的有机磷。
在用于降解有机磷农药时，例如可将聚磷菌剂按与每亩土壤所施用的有机磷农药的重量比为8-12％添加于土壤中。较佳的，可在施用后每6个月再追加施用聚磷菌剂一次，以降低土壤中所残留的有机磷。
值得说明的是，本实施例中转化菌和产酸菌的种类和含量，以及聚磷菌剂制备过程所涉及到的参数等均不仅限于上述范围，制备者可根据实际需要对上述内容进行相关调整。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
于30℃的条件下活化转化菌和产酸菌24h，其中，转化菌含有纤维单胞菌，产酸菌含有嗜酸菌。
将2g牛肉膏、8g蛋白胨、4g氯化钠和15g琼脂加入至1000mL水中，调节混合溶液的pH至7.0，得到液体牛肉膏蛋白胨培养基。
上述培养基经高温灭菌、冷却后，将纤维单胞菌、芽孢杆菌和嗜酸菌分别接种于2个不同的牛肉膏蛋白胨液体培养基中，然后置于26℃的条件下培养6天。筛选对有机磷具有降解作用的转化菌配制成浊度OD600为0.65的第一菌悬液，且第一菌悬液中转化菌的活菌数为0.3×107cfu/mL；筛选对有机磷具有降解作用的产酸菌配制成浊度OD600为0.85的第二菌悬液，且第二菌悬液中转化菌的活菌数为0.4×107cfu/mL。按第一菌悬液与第二菌悬液的体积比为0.6：2混合，得到聚磷菌剂。
该聚磷菌剂的活菌含量为1×107cfu/mL。将其在10℃的条件下保存1年后，活菌数为1.0×106cfu/mL。
实施例2
于30℃的条件下活化转化菌和产酸菌24h，其中，转化菌含有芽孢杆菌，产酸菌含有嗜酸菌。
将2g牛肉膏、8g蛋白胨、4g氯化钠和15g琼脂加入至1000mL水中，调节混合溶液的pH至7.0，得到液体牛肉膏蛋白胨培养基。
上述培养基经高温灭菌、冷却后，将纤维单胞菌、芽孢杆菌和嗜酸菌分别接种于2个不同的牛肉膏蛋白胨液体培养基中，然后置于26℃的条件下培养6天。筛选对有机磷具有降解作用的转化菌配制成浊度OD600为0.65的第一菌悬液，且第一菌悬液中转化菌的活菌数为0.33×107cfu/mL；筛选对有机磷具有降解作用的产酸菌配制成浊度OD600为0.85的第二菌悬液，且第二菌悬液中转化菌的活菌数为0.46×107cfu/mL。按第一菌悬液与第二菌悬液的体积比为0.6：2混合，得到聚磷菌剂。
该聚磷菌剂的活菌含量为1.01×107cfu/mL。将其在10℃的条件下保存1年后，活菌数为1.04×106cfu/mL。
实施例3
于30℃的条件下活化转化菌和产酸菌24h，其中，转化菌含有重量比为0.8：1的纤维单胞菌和芽孢杆菌，产酸菌含有嗜酸菌。
将2g牛肉膏、8g蛋白胨、4g氯化钠和15g琼脂加入至1000mL水中，调节混合溶液的pH至7.0，得到液体牛肉膏蛋白胨培养基。
上述培养基经高温灭菌、冷却后，将纤维单胞菌、芽孢杆菌和嗜酸菌分别接种于3个不同的牛肉膏蛋白胨液体培养基中，然后置于26℃的条件下培养6天。筛选对有机磷具有降解作用的转化菌配制成浊度OD600为0.65的第一菌悬液，且第一菌悬液中转化菌的活菌数为0.3×107cfu/mL；筛选对有机磷具有降解作用的产酸菌配制成浊度OD600为0.85的第二菌悬液，且第二菌悬液中转化菌的活菌数为0.4×107cfu/mL。按第一菌悬液与第二菌悬液的体积比为0.6：2混合，得到聚磷菌剂。
该聚磷菌剂的活菌含量为1×107cfu/mL。将其在10℃的条件下保存1年后，活菌数为1.0×106cfu/mL。
实施例4
于37℃的条件下活化转化菌和产酸菌32h，其中转化菌含有重量比为1.2：3的纤维单胞菌和芽孢杆菌，产酸菌含有重量比为2：0.5的嗜酸菌和不动杆菌。
将4g牛肉膏、12g蛋白胨、6g氯化钠和20g琼脂加入至1100mL水中，调节混合溶液的pH至7.5，得到液体牛肉膏蛋白胨培养基。
上述培养基经高温灭菌、冷却后，将纤维单胞菌、芽孢杆菌、嗜酸菌和不动杆菌分别接种于4个不同的牛肉膏蛋白胨液体培养基中，然后置于30℃的条件下培养4天。筛选对有机磷具有降解作用的转化菌配制成浊度OD600为0.85的第一菌悬液，且第一菌悬液中转化菌的活菌数为0.6×107cfu/mL；筛选对有机磷具有降解作用的产酸菌配制成浊度OD600为0.65的第二菌悬液，且第二菌悬液中转化菌的活菌数为0.7×107cfu/mL。按第一菌悬液与第二菌悬液的体积比为1.4：3.4混合，得到聚磷菌剂。
该聚磷菌剂的活菌含量为1.32×107cfu/mL。将其在40℃的条件下保存1年后，活菌数为3.07×106cfu/mL。
实施例5
于33.5℃的条件下活化转化菌和产酸菌48h，其中转化菌含有重量比为1：2的纤维单胞菌和芽孢杆菌，产酸菌含有重量比为3：1的嗜酸菌和不动杆菌。
将3g牛肉膏、10g蛋白胨、6g氯化钠和17g琼脂加入至1050mL水中，调节混合溶液的pH至8，得到液体牛肉膏蛋白胨培养基。
上述培养基经高温灭菌、冷却后，将纤维单胞菌、芽孢杆菌、嗜酸菌和不动杆菌分别接种于4个不同的牛肉膏蛋白胨液体培养基中，然后置于28℃的条件下培养5天。筛选对有机磷具有降解作用的转化菌配制成浊度OD600为0.75的第一菌悬液，且第一菌悬液中转化菌的活菌数为0.45×107cfu/mL；筛选对有机磷具有降解作用的产酸菌配制成浊度OD600为0.75的第二菌悬液，且第二菌悬液中转化菌的活菌数为0.55×107cfu/mL。按第一菌悬液与第二菌悬液的体积比为1：2.7混合，得到聚磷菌剂。
该聚磷菌剂的活菌含量为2.3×107cfu/mL。将其在25℃的条件下保存1年后，活菌数为1.6×106cfu/mL。
实施例6
于32℃的条件下活化转化菌和产酸菌36h，其中转化菌含有重量比为1：1.5：0.7的纤维单胞菌、芽孢杆菌和生胞食纤维菌，产酸菌含有重量比为3：1的嗜酸菌和不动杆菌。
将3g牛肉膏、10g蛋白胨、6g氯化钠和17g琼脂加入至1050mL水中，调节混合溶液的pH至7.75，得到液体牛肉膏蛋白胨培养基。
上述培养基经高温灭菌、冷却后，将纤维单胞菌、芽孢杆菌、嗜酸菌和不动杆菌分别接种于5个不同的牛肉膏蛋白胨液体培养基中，然后置于27℃的条件下培养5天。筛选对有机磷具有降解作用的转化菌配制成浊度OD600为0.7的第一菌悬液，且第一菌悬液中转化菌的活菌数为0.45×107cfu/mL；筛选对有机磷具有降解作用的产酸菌配制成浊度OD600为0.75的第二菌悬液，且第二菌悬液中转化菌的活菌数为0.6×107cfu/mL。按第一菌悬液与第二菌悬液的体积比为1：2.5混合，得到聚磷菌剂。
该聚磷菌剂的活菌含量为2.33×107cfu/mL。将其在18℃的条件下保存1年后，活菌数为1.62×106cfu/mL。
实验例1
重复实施上述实施例1-6，制得足够多的聚磷菌剂。取6块土地作为试验组1-6，将实施例1-6所得的聚磷菌剂分别按每亩土壤所施用的有机磷农药的重量的8％、9％、10％、11％、11.5％和12％添加于试验组1-6的土壤中，比较施加聚磷菌剂后1周和未施加聚磷菌剂情况下土壤中有机磷的含量，其结果如表1所示。
表1 有机磷含量
由表1可以看出，在土壤中施加聚磷菌剂能够有效降解土壤中的有机磷。并且，通过对比试验组1-6的降解率，可以看出试验组3-6有机磷的降解率高于试验组1-2有机磷的降解率，且试验组4-6又高于试验组3。其原因之一在于试验组1-2中的转化菌和产酸菌均只包括一种菌种，试验组3中的转化菌包括2种菌种(纤维单胞菌和芽孢杆菌)，试验组3-6中的转化菌和产酸菌均包括至少2种菌种；原因之二在于聚磷菌剂在土壤中的施加量逐渐增多。
实验例2
重复实施上述实施例1-6，制得足够多的聚磷菌剂。取6个不同地区的含有有机磷的废水作为试验组1-6，将实施例1-6所得的聚磷菌剂均等量添加等体积的试验组1-6的废水中，比较加入聚磷菌剂后1周和未加入聚磷菌剂情况下废水中有机磷的含量，其结果如表2所示。
表2 有机磷含量
试验组1 试验组2 试验组3 试验组4 试验组5 试验组6
施加前 8.74％ 8.69％ 9.55％ 14.72％ 11.03％ 21.74％
施加后 3.95％ 3.99％ 4.10％ 5.51％ 4.11％ 8.24％
降解率 54.80％ 54.08％ 57.07％ 62.56％ 62.74％ 62.10％
由表2可以看出，在废水中施加聚磷菌剂能够有效降解废水中的有机磷。并且，通过对比试验组1-6的降解率，可以看出试验组3-6有机磷的降解率高于试验组1-2有机磷的降解率，且试验组4-6又高于试验组3。其原因在于试验组1-2中的转化菌和产酸菌均只包括一种菌种，试验组3中的转化菌包括2种菌种(纤维单胞菌和芽孢杆菌)，试验组3-6中的转化菌和产酸菌均包括至少2种菌种。由此，该实验例验证了本实施例中的转化菌和产酸菌之间具有一定的协同作用。
综上所述，本发明实施例的聚磷菌剂对有机磷具有高效稳定的降解能力，并且对抗污能力强，对污染环境具有较强的适应性。将其应用于有机磷的降解，能有效治理磷污染，环保节能。
以上所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

Claims (10)

1.一种聚磷菌剂，其特征在于，将转化菌和产酸菌于26-30℃的条件下培养4-6天后，筛选对有机磷具有降解作用的所述转化菌配置成第一菌悬液，筛选对有机磷具有降解作用的所述产酸菌配置成第二菌悬液，然后再将所述第一菌悬液和所述第二菌悬液混合而得；
所述转化菌包括纤维单胞菌和芽孢杆菌中的至少一种，所述产酸菌包括嗜酸菌。
2.根据权利要求1所述的聚磷菌剂，其特征在于，所述转化菌包括纤维单胞菌和芽孢杆菌，所述纤维单胞菌与所述芽孢杆菌的重量比为0.8-1.2：1-3。
3.根据权利要求1所述的聚磷菌剂，其特征在于，所述产酸菌还包括不动杆菌，所述嗜酸菌与所述不动杆菌的重量比为2-4：0.5-1.5。
4.根据权利要求1所述的聚磷菌剂，其特征在于，由所述第一菌悬液与所述第二菌悬液按体积比为0.6-1.4：2-3.4混合得到。
5.根据权利要求1所述的聚磷菌剂，其特征在于，所述第一菌悬液的OD600值为0.65-0.85，且所述第一菌悬液中所述转化菌的活菌数为0.3-0.6×107cfu/mL。
6.根据权利要求1所述的聚磷菌剂，其特征在于，所述第二菌悬液的OD600值为0.65-0.85，且所述第二菌悬液中所述产酸菌的活菌数为0.4-0.7×107cfu/mL。
7.权利要求1-6任一项所述的聚磷菌剂在降解有机磷中的应用。
8.根据权利要求7所述的聚磷菌剂在降解有机磷中的应用，其特征在于，将所述聚磷菌剂用于降解土壤中含有的有机磷农药。
9.根据权利要求8所述的聚磷菌剂在降解有机磷中的应用，其特征在于，将所述聚磷菌剂按与每亩所述土壤所施用的所述有机磷农药的重量比为8-12％添加于所述土壤中。
10.根据权利要求7所述的聚磷菌剂在降解有机磷中的应用，其特征在于，将所述聚磷菌剂用于降解废水中的有机磷。
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