CN104560814A - 一种乳氟禾草灵农药残留降解菌及其生产的菌剂 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种乳氟禾草灵农药残留降解菌及其生产的菌剂。该菌株为革兰氏阳性菌，经鉴定为芽孢杆菌(Bacillus？sp.)，2014年2月27日保藏于中国典型培养物保藏中心，菌种保藏号为：CCTCC？NO:M？2014050。将Za菌种发酵完成后的培养液即为菌剂。Za菌株可使土壤中乳氟禾草灵农药残留量降低70％以上，可以解决农业生产中乳氟禾草灵农药残留超标问题。

Description

一种乳氟禾草灵农药残留降解菌及其生产的菌剂

技术领域

本发明属于生物高技术领域，提供一种乳氟禾草灵农药残留降解菌及其生产的菌剂。

背景技术

化学农药的使用大大地促进了现代农业的发展，为农业生产挽回了大量因植物病、虫、草害等原因造成的损失，并极大地提高了农业生产的劳动效率和机械化程度，在农业生产的现代化进程中起了不可估量的作用。但同时农药是一些有毒有害化学物质，它们进入生态环境后，不仅杀死了对人类有害的生物，同时也对生态系统造成了严重的危害。农药的大量使用引起农产品中农药残留超标，严重影响了人们的身体健康及农产品的出口创汇。随着人们生活水平的提高和环境保护意识的增强，全社会对农药残留带来的直接危害和潜在影响也越来越关注，人们迫切需要无农药残留污染的清洁绿色农产品。但从目前我国的农业生产形式和人口状况来看，以停止农药使用降低农业产量为代价的生产模式是行不通的，农药作为控制植物病、虫、草害的有效手段还将继续在农业生产中发挥巨大的作用。如何能解决农业生产中的这个两难问题就成为研究热点。实验室和实际应用研究都表明利用微生物来降解土壤中的农药残留，从而降低粮食、蔬菜、茶叶等农产品中的农药残留，提高农产品的品质和经济价值是可行的。

发明内容

本发明的目的在于针对生产实践中的实际问题和需求，开发研制出一种新型的乳氟禾草灵农药残留降解菌剂。

本发明的目的可通过如下技术方案实现：

本发明提供一种乳氟禾草灵降解菌Za，为革兰氏阳性菌，经鉴定为芽孢杆菌(Bacillus sp.)，2014年2月27日保藏于中国典型培养物保藏中心，菌种保藏号为：CCTCC NO:M 2014050。主要生物学特性为革兰氏染色阳性，接触酶和氧化酶阳性，能进行硝酸还原，不能产生吲哚。在透射电镜下呈长杆状，有鞭毛，菌体大小0.8-1.0μm×2.0-2.5μm。

本发明所述的乳氟禾草灵降解菌Za在降解乳氟禾草灵中的应用。

本发明所述的乳氟禾草灵降解菌Za在生产乳氟禾草灵农药残留降解菌剂中的应用。

乳氟禾草灵农药残留降解菌剂，优选通过以下方法制备得到：

1)将权利要求1所述的乳氟禾草灵降解菌Za接种于肉汤培养基摇瓶中，振荡培养至对数期；

2)将上述培养好的菌种按种子罐培养基的10％(v/v)的接种量接种入500升种子罐，培养过程中无菌空气的通气量为1:0.8-1.2，搅拌速度为180-240转/分，培养温度为30-32℃，培养至对数生长期，种子罐所用的培养基配方为：葡萄糖1.0wt％，NH₄NO₃ 1.0wt％，K₂HPO₄ 0.2wt％，MgSO₄ 0.05wt％，NaCl 0.01wt％，CaCO₃ 0.3wt％，酵母膏0.02wt％，pH值7.2-7.5；

3)将种子液按生产罐培养基的10％(v/v)接种量接入生产罐培养，生产罐所用培养基与种子罐培养基相同，培养过程中无菌空气的通气量为1:0.8-1.2(v/v)，搅拌速度为180-240转/分，培养温度为30-32℃，全流程培养时间为36-48小时，发酵结束后菌体数量达到10亿个/ml以上，发酵完成后培养液出罐直接用塑料包装桶或包装瓶分装成液体剂型或采用泥炭吸附用包装袋分装成固体剂型。

有益效果

使用该发明生产的农药残留降解菌剂具有生产使用成本低，使用方便，去除效果好的优点，适合在全国粮油蔬菜生产出口基地或有绿色食品商标标志的地区大面积推广使用。本发明对于保护生态环境，保护人民的身体健康，提高农产品的附加值具有重要的意义。降解菌Za能将土壤中乳氟禾草灵农药残留降解70％以上(表1)，使用该降解菌剂可以在农作物的正常生长过程中正常使用化学农药进行草害防治而保证农产品中农药残留含量符合绿色食品要求。

本发明成功地解决了农业生产中乳氟禾草灵农药残留超标问题，既充分发挥了化学农药在草害防治中的高效快速的作用，又可以生产出无毒无公害的绿色农产品。

生物材料保藏信息

一种乳氟禾草灵降解菌Za，分类命名为Bacillus sp.Za，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2014年2月27日，保藏地址为中国武汉·武汉大学，菌种保藏号为：CCTCC NO:M 2014050。

具体实施方式

实施例1：

采集长期施用乳氟禾草灵的农田土壤，取10克土样放入90ml无菌水中，振荡20min，使土样和水充分混合均匀，梯度稀释，取样涂布于1/10LB固体培养基平板(蛋白胨1克，酵母膏0.5克，NaCl 1克，琼脂粉20克，水1000毫升，pH 7.0～7.2)，在30℃培养箱培养48h，挑单菌进行乳氟禾草灵降解效果验证。

将挑到的单菌扩大培养后以5％的接种量接种在50mg/L乳氟禾草灵的无机盐液体培养基(NH₄NO₃ 1.0克，K₂HPO₄ 1.5克，KH₂PO₄ 0.5克，MgSO₄ 0.2克，NaCl0.5克，水1000毫升，pH 7.0～7.2)中进行降解验证，对乳氟禾草灵有降解效果的即为有效单菌。通过验证得到1株有效单菌，命名为Za，经鉴定为芽孢杆菌(Bacillus sp.)。菌株Za的主要生物学特性为革兰氏染色阳性，接触酶和氧化酶阳性，能进行硝酸还原，不能产生吲哚。在透射电镜下呈长杆状，有鞭毛，菌体大小0.8-1.0μm×2.0-2.5μm。

菌株Za于2014年2月27日保藏于中国典型培养物保藏中心，菌种保藏号为：CCTCC NO:M 2014050。

实施例2

无机盐液体培养基中降解菌Za降解特性测定：挑取Za单菌落于3ml LB液体培养基(蛋白胨10克，酵母膏5克，NaCl 10克，水1000毫升，pH 7.0-7.2)中，30℃、160rmp/min振荡培养12h，获得新鲜菌液。在100ml的50mg/l乳氟禾草灵的无机盐液体培养基(NH₄NO₃ 1.0克，K₂HPO₄ 1.5克，KH₂PO₄ 0.5克，MgSO₄ 0.2克，NaCl 0.5克，水1000毫升，pH 7.0-7.2)中，接入3ml离心悬浮后的菌液，于30℃摇床培养(160rmp/min)，定时取样测定，测定乳氟禾草灵的含量，结果见表1，无机盐液体培养基中降解菌Za对乳氟禾草灵的降解率达到94.8％。

土壤中降解菌Za对乳氟禾草灵降解特性测定：称取1000g土壤，加入乳氟禾草灵，使土壤中含药浓度为10mg/kg，加入Za菌液，混匀，使土壤中的Za浓度为10⁸个细胞/克土，置于30℃培养箱中黑暗条件下恒温培养，定时取样测定乳氟禾草灵在土壤中的残留量，结果见表1，土壤中降解菌Za降解乳氟禾草灵达到72.3％。

表1：菌株Za在无机盐液体培养基中和土壤中对乳氟禾草灵的降解效果

培养基	无机盐液体培养基	土壤
			降解率	94.8％	72.3％

实施例2

将本发明的农药残留降解菌Za的原种在培养皿上活化，接种于试管斜面上备用。斜面种培养基配方：蛋白胨10克，酵母膏5克，NaCl 10克，水1000毫升，琼脂20克，pH7.0-7.2。将试管斜面菌种接种于含200ml肉汤培养基(牛肉膏3克，蛋白胨10克，NaCl 5克，水1000毫升，pH 7.0-7.2)的1000ml摇瓶中，30℃恒温振荡培养至对数期，准备接种种子罐。种子罐500升，投料量400升，培养基配方(质量百分比)：葡萄糖1.0wt％，NH₄NO₃ 1.0wt％，K₂HPO₄0.2wt％，MgSO₄ 0.05wt％，NaCl 0.01wt％，CaCO₃ 0.3％，酵母膏0.02％，pH值7.2-7.5。投料完毕后121℃高压湿热灭菌，冷却至33℃后，将上述培养好的摇瓶菌种按10％(体积百分比，下同)的接种量接种入500升种子罐，培养至对数生长期，种子罐温度控制在30-32℃，搅拌速度为220转/分，无菌空气通入量为1:0.8-1.2。将到达对数期的种子液按10％的接种量接入生产罐培养，生产罐所用培养基成分与种子罐培养基相同。生产罐容量5吨，投料量4.5吨。投料后的生产罐1.1kg/cm²的压力下，121℃高压湿热灭菌，灭菌后冷却至35℃以下，通无菌空气保持无菌状态备用。接种后的生产罐温度控制在30-32℃，生产罐的培养过程中无菌空气的通气量为1:0.8-1.2，搅拌速度为240转/分，整个工艺流程培养时间为36-48小时。发酵结束后菌体数量达到10亿个/ml以上。发酵完成后培养液出罐直接用塑料包装桶或包装瓶分装成液体剂型或采用泥炭吸附用包装袋分装成固体菌剂剂型。

土壤中Za液体降解菌剂对乳氟禾草灵降解效果测定：取5000g长期使用乳氟禾草灵的农田土壤，乳氟禾草灵残留浓度为5.3mg/kg，加入本实施例制备的Za液体降解菌剂，混匀，使土壤中的Za浓度为10⁸个细胞/克土，置于30℃，定时取样测定乳氟禾草灵在土壤中的残留量，结果见表2，土壤中Za液体降解菌剂降解乳氟禾草灵达到70.3％。

表2：Za乳氟禾草灵降解菌剂在土壤中对乳氟禾草灵的降解效果

培养基	土壤
		降解率	70.3％

Claims (4)

1.一种乳氟禾草灵降解菌Za，为革兰氏阳性菌，经鉴定为芽孢杆菌(Bacillus sp.)，2014年2月27日保藏于中国典型培养物保藏中心，菌种保藏号为：CCTCC NO:M 2014050。

2.权利要求1所述的乳氟禾草灵降解菌Za在降解乳氟禾草灵中的应用。

3.权利要求1所述的乳氟禾草灵降解菌Za在生产乳氟禾草灵农药残留降解菌剂中的应用。

4.一种乳氟禾草灵农药残留降解菌剂，其特征在于通过以下方法生产而成：

1)将权利要求1所述的乳氟禾草灵降解菌Za接种于肉汤培养基摇瓶中，振荡培养至对数期；

2)将上述培养好的菌种按种子罐培养基的10％(v/v)的接种量接种入500升种子罐，培养过程中无菌空气的通气量为1:0.8-1.2，搅拌速度为180-240转/分，培养温度为30-32℃，培养至对数生长期，种子罐所用的培养基配方为：葡萄糖1.0wt％，NH₄NO₃1.0wt％，K₂HPO₄0.2wt％，MgSO₄0.05wt％，NaCl0.01wt％，CaCO₃0.3wt％，酵母膏0.02wt％，pH值7.2-7.5；

3)将种子液按生产罐培养基的10％(v/v)接种量接入生产罐培养，生产罐所用培养基与种子罐培养基相同，培养过程中无菌空气的通气量为1:0.8-1.2(v/v)，搅拌速度为180-240转/分，培养温度为30-32℃，全流程培养时间为36-48小时，发酵结束后菌体数量达到10亿个/ml以上，发酵完成后培养液出罐直接用塑料包装桶或包装瓶分装成液体剂型或采用泥炭吸附用包装袋分装成固体剂型。