CN102732450B - 一株胺菊酯降解菌及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一株胺菊酯降解菌及其土壤修复应用。本发明所提供的胺菊酯降解菌是假单胞菌属（Pseudomonassp.）的菌株T-6，该菌可在好氧条件下，48小时内实现对200mg/L胺菊酯的完全降解；菌株T-6对庆大霉素、新霉素、四环素和卡那霉素呈不同程度敏感反应，对13种供试重金属呈现耐受性；具备在水环境和实际土壤环境下高效降解胺菊酯的能力，能够显著缩短胺菊酯降解时长，具备实际应用意义和价值。
Description
技术领域
本发明属于环境污染物生物处理技术领域，具体涉及一株高效降解胺菊酯的细菌及其在废水生物处理和土壤污染修复中的应用。
背景技术
农药作为重要的农业生产资料，在保护农业生产、提高农业综合生产能力、促进粮食稳定增产和农民持续增收等方面发挥着极其重要的作用。中国既是农药生产大国，也是使用大国，年使用量和平均用量均位居世界第一。然而，农药的利用率却不足20%，其余部分全部进入土壤、水体和大气，形成了严重的污染和危害。
菊酯类农药是一类人工合成的, 类似天然除虫菊素的神经致毒性杀虫剂。作为高毒、高残留有机磷和有机氯农药的替代品，拟除虫菊酯类农药已成为世界第三大类杀虫剂，广泛用于防治农作物虫害。此类农药过去一直被认为在生物体内易被氧化酶系统作用降解，无蓄积性，是毒性较低，使用安全的农药。然而，越来越多的研究表明，此类农药有蓄积性，长期接触即使是低剂量水平也会引发多种慢性疾病；有些品种具致癌、致畸和致突变作用；对哺乳动物具有中等神经毒性、免疫系统毒性、心血管毒性和遗传毒性；对家蚕、蜜蜂和鱼类等水生生物高毒，对鱼类的LC50值常在每升几微克至十几微克水平，安全系数约为0.063。联合国粮农组织和世界卫生组织已对它们在农产品中的残留做出严格限定。目前，此类农药残留已对我国食品安全和农产品出口构成实际、严重负面影响，如何有效清除环境中的拟除虫菊酯农药残留物成为了亟待解决的重大社会问题。
胺菊酯（Tetramethrin），化学名称3,4,5,6-甲氢邻苯二甲酰亚氨基甲基（±）顺,反式菊酸酯。广泛应用于防治茶树、蔬菜、果树、棉花、花卉和卫生害虫，用量较大；对生物钠离子通道会产生扰乱作用，是皮肤和呼吸系统的过敏原，是一种环境激素；理化性质稳定，不易发生降解，50℃、6个月仍具有较高生物活性，正常条件活性维持可长达两年；对水生生物毒性较强，如研究显示当水中胺菊酯浓度为1 mg/L时，其对小球藻的生长抑制率可达43.67%，其对扇贝及紫贻贝的半对数抑制浓度分别为1.15和1.28 mg/L。此外，越来越多的研究显示，胺菊酯在环境中会对其它鱼类、鸟类和老鼠等动物的内分泌系统产生干扰。
由于微生物降解具有成本低、效率高、无二次污染和生态恢复性良好等优点，其在农药、石油、染料和表面活性剂等环境污染物降解中已得到广泛应用，成为了环境修复的核心技术和当前环境科学研究的热点。目前，已报道的拟除虫菊酯农药降解菌有芽孢杆菌、假单胞菌、产碱杆菌、黑曲霉、酸单胞菌、红球菌、鞘氨醇杆菌、微球菌和苍白杆菌，等等。然而，能够高效降解胺菊酯的菌株却极为有限。陈少华等人报道过一株具备胺菊酯降解能力的链霉菌（Streptomycessp.）菌株HP-S-01，该菌株能够在72小时降解80.9%的供试胺菊酯（初始浓度为100 mg/L）（陈少华，罗建军，胡美英，黄华盛，张芳. 链霉菌HP-S-01降解高效氯氰菊酯的特性及其动力学. 微生物学通报，2011，38：1207-1215），5天之内无法实现完全降解。此外，该降解菌的抗生素抗性和重金属耐受性尚未探明，在土壤等实际环境中的应用效果也未作测试，存在环境施用风险。
综上所述，筛选更为高效、对常用抗生素敏感且能够耐受多种重金属，并在实际环境下具备胺菊酯降解能力的降解菌株成为了相关领域的研究热点。
发明内容
本发明的目的是针对上述现有胺菊酯微生物降解中存在的问题或不足，提供一种高效胺菊酯降解菌。
本发明的另一个目的是提供上述菌种在修复胺菊酯污染水体和土壤中的应用。
本发明的上述技术问题是通过以下技术方案得以实施的：
一株胺菊酯降解菌，该菌是假单胞菌属（Pseudomonas sp.）的菌株T-6，于2012年4月13日在中国普通微生物菌种保藏管理中心保藏，编号为CGMCC No. 6000 ，该菌具有降解胺菊酯的能力。
一种所述胺菊酯降解菌在含胺菊酯废水处理中或在受胺菊酯污染土壤修复中的应用。
作为优选，将所述菌株CGMCC No. 6000 接种至含胺菊酯50-200 mg/L的基础无机盐液体培养基中，150 r/min震荡培养32 h以上，所述的基础无机盐液体培养基成份为（g/L）：MgCl2 0.2，NH4NO3 1，KH2PO4 2，K2HPO4 7.5，NaCl 1，去离子水1 L。
作为优选，所述的液体培养温度为25-30℃，基础无机盐液体培养基的pH为6.2-7.6。进一步优化的方案是，所述的液体培养温度为30℃，基础无机盐液体培养基的pH为7.6。
作为优选，将所述菌株CGMCC No. 6000 接种至发酵培养基中30℃恒温培养32小时以上，得到菌体发酵液，对受胺菊酯污染的土壤喷施菌体发酵液进行降解；发酵培养基的成份为（g/L）：玉米粉10，豆粕粉8，(NH4)2SO4 6，玉米浆6，MgSO4·7H2O 1，K2HPO4·3H2O 2，MnSO4 0.05，pH 7.6。
本发明所提供的胺菊酯降解菌Pseudomonas sp.T-6源自浙江省临安市污水处理厂活性污泥池的活性污泥，经人工富集培养、压力筛选和分离纯化得到。该菌属假单胞菌属，其生物学特征在于：革兰氏染色阴性，接触酶阳性，氧化酶阴性，V. P.试验阴性，吲哚试验阴性，菌体形态为短杆状，菌落呈浅黄色、圆形、边缘齐整、光滑湿润，其它生理生化特征如表1所示。菌株于2012年4月13日在中国普通微生物菌种保藏管理中心保藏，编号为CGMCC No. 6000 。
注：“+”表示生长或阳性反应；“-”表示不生长或阴性反应。
该菌的最适生长条件为：pH 7.6，温度为30℃。以五分之一LB（Luria-Bertani）或工业发酵培养基（玉米粉10 g/L，豆粕粉8 g/L，(NH4)2SO4 6 g/L，玉米浆6 g/L，MgSO4·7H2O 1 g/L，K2HPO4·3H2O 2 g/L，MnSO4 0.05 g/L，pH 7.6）培养32小时后，菌液菌体浓度可达2-3×109 CFU/mL（CFU，菌落形成单位）。
该菌对庆大霉素、新霉素、四环素和卡那霉素呈不同程度敏感反应，上述抗生素均为常用抗生素。可以认为：当菌体被释放到自然环境中时，不会因抗（耐）药性问题而产生超级细菌。
该菌对13种测试金属离子（Li+、Ag+、Cu+、Cu2+、Hg2+、Ba2+、Pb2+、Zn2+、Mn2+、Ni2+、Fe2+、Fe3+和Co4+）呈现不同程度的耐受性。鉴于我国土壤污染现状——持久性有机污染物污染和重金属污染并存，以及工业废水中含有重金属的事实，降解菌株具备重金属耐受性就显得十分重要。可以认为：一般环境条件下，该菌株污染修复效果受重金属抑制影响较小。
该菌株在摇瓶降解试验中（容积为500 mL的三角瓶，装有150 mL液体无机盐培养基，胺菊酯为唯一碳源，初始浓度200 mg/L，摇床转速150 r/min，温度30℃），能在48小时内将供试胺菊酯降解完全；在含100 mg/L胺菊酯合成废水的处理试验中，施用该菌较活性污泥能更为高效地去除胺菊酯；在供试土壤胺菊酯含量为50 mg/kg情况下，施用该菌5天可使土样中94.8%的胺菊酯发生降解，显著提升胺菊酯降解速率、缩短降解时长，具备实际应用意义和价值。
综上所述，本发明和现有技术相比具有如下优点：
与现有技术相比，本发明的Pseudomonas sp.T-6菌株可在好氧条件下以胺菊酯作为唯一碳源和能源进行生长繁殖，同时将其快速、完全降解。在纯培养条件下，它能将浓度为200 mg/L的胺菊酯在48小时内降解完全。与已有降解菌株相比，Pseudomonas sp.T-6胺菊酯降解率最高，降解速率最快。此外，Pseudomonas sp.T-6对常用抗生素敏感，对13种重金属呈现耐受性，且具备在水环境和实际土壤环境条件下发挥胺菊酯降解作用的能力，该菌株有望在含胺菊酯工业废水的生物处理和受胺菊酯污染土壤的生物环境修复中发挥重要作用。
附图说明
图1是本发明菌株T-6的胺菊酯降解能力测试结果；
图2是本发明菌株T-6对土壤环境中的胺菊酯降解结果，其中□：灭活土样中胺菊酯含量；■：喷施T-6菌体灭活土样中胺菊酯含量；△：新鲜土样中胺菊酯含量；▲：喷施T-6菌体新鲜土样中胺菊酯含量。
具体实施方式
下面通过具体实施例，对本发明的技术方案作进一步的具体说明。应当理解，本发明的实施并不局限于下面的实施例，对本发明所做的任何形式上的变通和/或改变都将落入本发明保护范围。
在本发明中，若非特指，所有的份、百分比均为重量单位，所有的设备和原料等均可从市场购得或是本行业常用的。
实施例1： Pseudomonas sp.T-6的分离与胺菊酯降解能力
现场采集浙江省临安市污水处理厂活性污泥池中的活性污泥，用500 mL三角瓶盛装，并迅速带回实验室。将取回的样品置于胺菊酯选择性基础无机盐液体培养基中驯化培养。培养基成份为（g/L）：MgCl2 0.2，NH4NO3 1，KH2PO4 2，K2HPO4 7.5，NaCl 1，胺菊酯 0.1（预溶于丙酮），pH 7.4，去离子水1 L，121℃湿热灭菌25分钟后备用。培养条件为：28℃，120 r/min振荡培养，容器装液量为容器容积的1/3。此后，每隔一周将摇瓶静止片刻，弃上清液，随后补入等量的新鲜配置的选择性液体培养基并继续振荡富集培养。六周后，将上述培养物均匀涂布于固体选择性基础无机盐培养基（每升液体培养基中再加入20克的琼脂）上。将涂布好的平板倒置放入培养箱，28℃培养48小时。用无菌牙签挑选单菌落或用接种针划线直至出现单菌落再行转接至新鲜配置的固体选择性平板上，并通过气相色谱法逐一验证各菌株的胺菊酯降解能力，结果得到一株胺菊酯降解菌T-6。
将菌株T-6接入以200 mg/L胺菊酯为唯一碳源的选择性基础无机盐培养基中，以OD600值为0.1的接种量接入T-6，30℃，150 r/min振荡培养。随后，每隔12小时对培养液中胺菊酯的残留情况进行测试，结果如图1所示。从中可看出菌株T-6可以胺菊酯为唯一碳源和能源进行生长，同时实现对胺菊酯的完全降解。
本实施例说明分离得到的Pseudomonas sp.T-6可利用胺菊酯作为唯一碳源和能源进行生长繁殖，并具备高效降解胺菊酯的能力。
实施例2： Pseudomonas sp. T-6的抗药性实验
采用滤纸片法，选择庆大霉素、新霉素、四环素和卡那霉素进行测试，以各抗生素滤纸片在培养降解菌T-6平板上的抑菌圈直径大小作为敏感或者耐药的判定依据。结果如表2所明，菌株T-6对上述五种抗生素均呈敏感反应。
注：抑菌圈的直径大于高度敏感范围上限值的为极度敏感。
本实施例说明当菌体被释放到自然环境中时，不会因抗（耐）药性问题而产生超级细菌，为其今后的实际应用提供了安全保证。
实施例3： Pseudomonas sp.T-6的重金属最小抑制浓度（MIC）测试
MIC试验设计参照Filali等人的研究进行（Filali B.K.，Taoufik J.，Zeroual Y.，Dzairi F.Z.，Talbi M.，Blaghen M. Waste water bacterial isolates resistant to heavy metals and antibiotics. Current Microbiology，2000，41：151-156），挑取等大、经活化处理的T-6单菌落于培养试管中，28℃，150 r/min振荡培养32小时。依菌体长势判定MIC值，每组设3个重复，分别测试该菌对13种金属离子的耐受情况。结果如表3所示，该菌株具多重耐受性，耐受性强。
实施例4： Pseudomonas sp.T-6处理含胺菊酯废水的试验
将培养好的T-6菌株和新鲜采集的活性污泥按30%的比例分别接种于装有弹性填料的2 L反应器中，并通气培养（溶解氧浓度维持在2 mg/L左右）。每24小时加入300 mL新鲜配置的合成废水（pH 7.1），合成废水成分为（g/L）：醋酸钠0.68，葡萄糖0.1，硫酸镁0.075，蛋白胨0.1，酵母浸提物0.01，NaCl 0.05，K2HPO4 0.05，NaHCO3 0.075，CaCl2 0.025。该废水COD值与一般市政废水COD值相近。9-10天后填料上长出生物膜，再以100 mL/小时流量泵入合成废水，进一步进行驯化处理。经一周左右的动态驯化后，待二者出水COD值相差不大时，开始泵入胺菊酯含量为100 mg/L的合成废水。水温为20℃，进水COD值约为480-520 mg/L，溶解氧维持在2.2 mg/L左右，水力停留时间为24小时，分别测定添加菌株T-6和活性污泥反应器的出水COD和胺菊酯含量。每次测定设3个重复，结果以平均值表示，结果如表4所示。
从第7天开始两组反应器在COD去除方面表现有所不同，添加T-6菌株的反应器在第7天胺菊酯去除率约为77%，在第18天更是实现了完全去除。相比之下，添加活性污泥反应器的胺菊酯去除率由18%上升至57%，存在一个明显的适应、驯化过程。结果表明，T-6菌株较活性污泥能更为高效地去除胺菊酯，同时出水COD符合相关国家标准（小于100 mg/L）。
实施例5： Pseudomonas sp.T-6降解土壤中胺菊酯的试验
将菌株T-6在发酵培养基中30℃恒温培养32小时后，得到菌体发酵液。发酵培养基的成份为（g/L）：玉米粉10，豆粕粉8，(NH4)2SO4 6，玉米浆6，MgSO4·7H2O 1，K2HPO4·3H2O 2，MnSO4 0.05，pH 7.6。
在无菌水中加入一定量的胺菊酯（胺菊酯预溶于甲醇之中），在摇床上充分振荡混匀后，浸泡待试土壤（供试土壤为pH 6.2的红壤），使土壤颗粒能够均匀的吸附胺菊酯，胺菊酯含量为50 mg/kg。喷施菌体发酵液，搅拌均匀，使土样中T-6菌体浓度约为2-3×107 个/g。土壤水分含量控制在60%左右，恒温22℃。同时，参照Li Wen等人研究（Li W.，Dai Y.，Xue B.B.，Li Y.Y.，Peng X.，Zhang J.S.，Yan Y.C. Biodegradation and detoxification of endosulfan in aqueous medium and soil by Achromobacter xylosoxidans strain CS5. Journal of Hazardous Materials，2009，167：209-216），设置对照。随后，每隔1天取5 g土样测算胺菊酯降解率。
结果如图2所示，5天供试土样中有94.8%的胺菊酯发生降解，喷施T-6能够显著提升胺菊酯降解速率、缩短降解时长，具备实际应用意义和价值。
以上所述的实施例只是本发明的一种较佳的方案，并非对本发明作任何形式上的限制，在不超出权利要求所记载的技术方案的前提下还有其它的变体及改型。
Claims (6)
1.一株胺菊酯降解菌，该菌是假单胞菌属（Pseudomonas sp.）的菌株T-6，于2012年4月13日在中国普通微生物菌种保藏管理中心保藏，编号为CGMCC No. 6000 ，该菌具有降解胺菊酯的能力。
2.权利要求1所述胺菊酯降解菌在含胺菊酯废水处理中或在受胺菊酯污染土壤修复中的应用。
3.权利要求2所述的应用，其特征在于：将所述菌株CGMCC No. 6000 接种至含胺菊酯50-200 mg/L的用于液体培养的基础无机盐液体培养基中，150 r/min震荡培养32 h以上，所述的基础无机盐液体培养基成份为：MgCl2 0.2 g/L，NH4NO3 1 g/L，KH2PO4 2 g/L，K2HPO4 7.5 g/L，NaCl 1 g/L，去离子水1 L。
4.权利要求3所述的应用，其特征在于：所述的液体培养温度为25-30℃，基础无机盐液体培养基的pH为6.2-7.6。
5.权利要求3所述的应用，其特征在于：所述的液体培养温度为30℃，基础无机盐液体培养基的pH为7.6。
6.权利要求2所述的应用，其特征在于：将所述菌株CGMCC No. 6000 接种至发酵培养基中30℃恒温培养32小时以上，得到菌体发酵液，对受胺菊酯污染的土壤喷施菌体发酵液进行降解；发酵培养基的成份为：玉米粉10 g/L，豆粕粉8 g/L，(NH4)2SO4 6 g/L，玉米浆6 g/L，MgSO4·7H2O 1 g/L，K2HPO4·3H2O 2 g/L，MnSO4 0.05 g/L，pH 7.6。
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